Utilizzo della fetta polmonare tagliata con precisione per studiare la regolazione contrattile delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare

Il presente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di fette polmonari tagliate con precisione dal topo per valutare la contrattilità delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare in un ambiente quasi in vivo .

Il PCLS supporta la valutazione dell'attività delle cellule muscolari lisce delle vie aeree e vascolari in un ambiente tissutale quasi intatto, fornendo così un prezioso modello ex vivo per la ricerca polmonare. In termini di ricerca sulla muscolatura liscia, le fette polmonari tagliate con precisione preservano il fenotipo in vivo delle cellule muscolari lisce e la loro interazione con le strutture circostanti, consentendo al contempo l'accesso alla cellula muscolare liscia, che è importante per uno studio meccanicistico a livello cellulare. Per iniziare, posizionare il corpo del mouse su una scheda di dissezione in posizione supina.

Fissa la coda, le zampe anteriori e la testa con aghi per siringhe da 25 G e disinfetta il corpo con il 70% di etanolo. Aprire attentamente la cavità toracica lungo lo sterno e la gabbia toracica inferiore bilaterale sopra il diaframma. Quindi, puntare la punta affilata della forbice lontano dal tessuto polmonare e rimuovere parte delle gabbie costali ventrali bilaterali per esporre il cuore.

Osservare che i lobi polmonari collassano quando si apre la cavità toracica. Utilizzare le forbici per rimuovere i tessuti molli nel collo del topo per esporre la trachea. All'estremità superiore della trachea fare un piccolo foro di diametro 1,2 millimetri che dovrebbe consentire il passaggio di una punta del catetere IV a forma di Y da 20 G.

Collegare una porta adattatore del catetere a forma di Y con una siringa da 3 millilitri preriempita con 0,5 millilitri di aria e l'altra porta con una siringa da 3 millilitri preriempita con 2 millilitri di soluzione di agarosio all'1,5% riscaldata a 42 gradi Celsius. Iniettare la soluzione di agarosio per riempire il catetere e quindi spingere il catetere attraverso l'apertura nella trachea a 5-8 millimetri. Iniettare lentamente la soluzione di agarosio ad una velocità di 1 millilitro ogni 5 secondi.

Osservare che il polmone si espande lungo l'asse prossimale a quello distale. Interrompere l'iniezione quando il bordo di ciascun lobo polmonare è gonfiato. Quindi, iniettare da 0,2 a 0,3 millilitri di aria dall'altra siringa per spingere l'agarosio residuo nelle vie aeree conduttive nello spazio degli alveoli distali.

Clip chiuse la trachea con un paio di pinze emostatiche curve. Per riempire la vascolarizzazione polmonare, riempire una siringa da 1 millilitro con gelatina calda al 6% e collegarla a un catetere venoso aghino. Riempire il catetere con una soluzione di gelatina e quindi perforare il ventricolo destro vicino alla parete inferiore con l'ago.

Spingere l'ago per 2-3 millimetri nel ventricolo destro e puntare la punta dell'ago verso l'arteria polmonare principale. Iniettare lentamente circa 0,2 millilitri di soluzione di gelatina nel ventricolo destro e nei vasi arteriosi polmonari. Tenere l'ago in posizione per cinque minuti dopo l'iniezione e raffreddare i lobi polmonari versando la soluzione di HBSS ghiacciata sul cuore e sui polmoni e mettere il corpo in frigorifero.

Dopo questo passaggio, rimuovere il polmone e il cuore del topo dai tessuti connettivi circostanti con le forbici. Quindi, separare ogni lobo polmonare e tenerli in soluzione HBSS sul ghiaccio. Tagliare il lobo polmonare e orientarlo in modo tale che la direzione di taglio sia perpendicolare alla maggior parte delle vie aeree dall'hila alla superficie polmonare.

Attaccalo sopra la colonna del campione con super colla. Utilizzare un vibratoma con una lama di rasoio sottile fresca per tagliare il lobo polmonare in fette di 150 micrometri. Raccogliere le fette in piastre di Petri sterili preriempite con soluzione fredda di HBSS.

Trasferire le fette in piastre di Petri riempite con terreno di coltura DMEM/F-12. Metti i piatti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte prima degli esperimenti. Posizionare una singola fetta polmonare tagliata con precisione in ogni pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti riempita con HBSS.

Posizionare la fetta al centro del pozzetto e quindi rimuovere la soluzione HBSS con una pipetta. Al microscopio, trova le vie aeree e la nave bersaglio nella fetta e poi coprila usando una rete di nylon con un foro centrale pretagliato per esporre l'area del vaso delle vie aeree mirato. Metti una rondella metallica cava sopra la rete per tenere le fette in posizione.

Quindi, aggiungere 600 microlitri di soluzione HBSS per immergere le fette. Dopo 10 minuti, registrare le immagini di base. Per indurre le vie aeree o la contrazione vascolare, rimuovere con cautela la soluzione HBSS con una pipetta e aggiungere 600 microlitri di HBSS con un agonista.

Per preparare il tampone di carico del colorante di calcio, prima sciogliere 50 microgrammi di colorante con 10 microlitri di DMSO e 0,2 grammi di polvere Pluronic F-12 in 1 millilitro di DMSO. Mescolare 10 microlitri della soluzione Pluronic con 10 microlitri di soluzione di colorante di calcio. Aggiungere questa miscela a 2 millilitri di soluzione HBSS contenente 200 micromolari di sulfobromophthalein.

Quindi, posizionare 15 fette polmonari tagliate con precisione in 2 millilitri di tampone di carico di calcio e incubare a 30 gradi Celsius per un'ora, seguite dall'incubazione in HBSS contenente 100 sulfobromophthalein micromolare per 30 minuti. Quindi, posizionare le fette caricate con colorante di calcio su un grande vetro di copertura. Riempire il grasso siliconico ad alto vuoto in una siringa da 3 millilitri attaccata ad un ago smussato da 18 G o una punta di pipetta da 200 microlitri e disegnare due linee parallele attraverso il vetro di copertura, sopra e sotto la fetta.

Coprire la fetta con una rete di nylon tra due linee di grasso. Posizionare il secondo vetro di copertura sopra la rete per generare una camera. Aggiungere HBSS o una soluzione agonista nella camera da un'estremità con una pipetta.

Rimuovere il fluido dalla camera aspirando dall'altra estremità con carta velina. La camera della fetta è ora pronta per l'imaging del calcio con un microscopio confocale a scansione laser ad alta velocità. Fasci di arterie delle vie aeree polmonari sono stati osservati in fette polmonari tagliate con precisione di spessore 150 micrometri al microscopio a contrasto di fase.

Allo stato di riposo, una via aerea è stata identificata da cellule epiteliali cuboidali con un'arteria polmonare vicina. Dopo l'esposizione alla metacolina, l'area luminale è stata ridotta mentre l'arteria polmonare non ha mostrato alcuna risposta agli stimoli. Le risposte contrattili delle vie aeree sono state quantificate dalla percentuale di riduzione dell'area luminale e hanno mostrato risposte dose-dipendenti simili in colture di un giorno e cinque giorni.

Dopo aver raggiunto il campo polmonare periferico, le vie aeree conduttive si ramificano nei dotti respiratori e nelle sacche che circondano le piccole arteriole intra-acinari. Quando esposti agli endoteli, sia le vie aeree che le arterie polmonari si restringono, che è seguito da un rilassamento indotto da NOC-5. Allo stato di riposo, le fette caricate con colorante di calcio hanno mostrato una bassa fluorescenza nelle cellule muscolari lisce delle vie aeree e del sistema vascolare sotto un microscopio fluorescente confocale.

Dopo l'esposizione agli agonisti, l'intensità della fluorescenza del calcio aumentava nelle cellule e si propagava all'intera cellula, che si correlava con i segnali oscillatori. Dal punto di vista tecnico, è essenziale gonfiare il polmone con agarosio in modo omogeneo ed evitare un'iniezione rapida o eccessiva di agarosio. Spingere sempre l'aria alla fine per lavare l'agarosio dalle vie aeree conduttive allo spazio degli alveoli distali.

In sintesi, utilizzando la coltura di fette polmonari tagliate con precisione, si può fornire una speciale varietà di funzioni muscolari lisce polmonari e modellare la deregolazione della muscolatura liscia in vitro. Fornisce anche una piattaforma ideale per lo screening di farmaci novo vasodilatatori o broncodilatatori.