Analisi videomorfometrica della vasocostrizione polmonare ipossica delle arterie intrapolmonari utilizzando fette polmonari tagliate con precisione murina

La vasocostrizione polmonare ipossica (HPV) è un importante fenomeno fisiologico con cui alla perfusione polmonare ipossia alveolare viene abbinata alla ventilazione. Il principale segmento vascolare che contribuisce all'HPV è l'arteria intra-acinare. Qui descriviamo il nostro protocollo per l'analisi dell'HPV dei vasi polmonari murini con diametri di 20-100 μm.

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la vasocostrizione polmonare ipossica di arterie intrapolmonari speculari con diametri interni da 20 a 100 micron. Ciò si ottiene riempiendo prima le vie aeree dei polmoni con aros a basso punto di fusione. Il secondo passo consiste nell'utilizzare un vibratore per tagliare i polmoni isolati in fette spesse 200 micron.

Successivamente, l'aros viene rimosso dalle sezioni polmonari mediante incubazione a 37 gradi Celsius, mezzo caldo, che viene gorgogliato con gas normossico. Quindi le sezioni si muovono lentamente nel fluido. Quindi una singola sezione polmonare viene trasferita in una camera di superfusione a flusso continuo, seguita da un'analisi morfometrica video della reattività del vaso dell'arteria in sezione trasversale.

Infine, vengono valutati i cambiamenti nell'area luminale del vaso in risposta a diversi trattamenti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia intravitale dei microvasi subpleurici, è la misurazione della tensione vascolare nelle arterie polmonari prossimali isolate che consente l'analisi quantitativa della reattività VA delle arterie intrapolmonari con diametri compresi tra 20 e 100 micrometri. A dimostrare la procedura saranno Anna Goldenberg e due tecnici di questo laboratorio.

Immediatamente dopo aver ucciso un topo per lussazione cervicale, aprire la cavità addominale, spostare le anse intestinali e recidere i grandi vasi addominali per il sanguinamento. Quindi, usa le forbici sottili per penetrare nel diaframma. Ciò provoca il collasso dei polmoni a causa dell'ingresso di aria nella cavità pleurica.

Continuare a tagliare per staccare il diaframma dall'apertura toracica inferiore. Ora tagliate lateralmente le costole e la clavicola. Per rimuovere la parte ventrale della gabbia toracica, estrarre il timo.

Riempire una siringa con tampone di perfusione caldo. Quindi, fai un piccolo foro nel ventricolo sinistro del cuore. Regolare il deflusso del tampone di perfusione e perfondere lentamente il sistema vascolare polmonare attraverso il ventricolo destro fino a quando i polmoni appaiono bianchi.

Quindi, rimuovi le ghiandole salivari, i piccoli muscoli e il tessuto connettivo dalla trachea. Scollegare la trachea dal tessuto connettivo circostante e inserire un pezzo di cotone da cucire tra l'esofago e la trachea per la successiva legatura. Quindi utilizzare una micro forbice per praticare un piccolo foro nella parte superiore della trachea tra due cartilagini tracheali vicine.

Dopo aver riempito una siringa con 37 gradi Celsius, agro caldi e a basso punto di fusione, collegarla a una cannula di plastica flessibile e spingere lentamente lo stantuffo fino a rimuovere l'aria dalla cannula. Inserire la cannula nel piccolo foro della trachea e ancorarla con cura in posizione con del cotone da cucito. Successivamente, riempi lentamente le vie aeree con gli aros e osserva i polmoni.

All'inizio, il polmone destro inizia ad espandersi, seguito dal polmone sinistro. Dopo 30-40 secondi, il riempimento è completato ed entrambi i polmoni vengono gonfiati a un volume paragonabile alla situazione in vivo, che è di circa 1,2-2,0 millilitri. A seconda del sesso, dell'età e del peso, è importante iniettare l'uovo rosa abbastanza velocemente in modo che non si solidifichi così velocemente durante la procedura, ma non così velocemente da danneggiare i polmoni.

Dopo che i polmoni sono stati riempiti contemporaneamente, estrarre la cannula di plastica e legare la trachea con il cotone da cucito per evitare la fuoriuscita dell'aros. Successivamente tagliare la trachea sopra la legatura e staccare i polmoni e il cuore in blocco dal torace, trasferire gli organi in cumuli di ghiaccio freddo tampone ringer per solidificare l'agros, cosa che avviene in pochi minuti durante l'attesa. Usa la super colla per attaccare un pezzo di tappo di champagne al supporto del campione del vibratore per fungere da inclinazione all'indietro per il tessuto polmonare Dopo che l'agros si è solidificato, separare i singoli lobi polmonari.

Poi super colla, un lobo al portacampioni. Per ottenere sezioni trasversali delle piccole arterie intraasner, prendere il lobo cranico del polmone destro e incollarlo con la superficie dell'ilo al supporto, utilizzando un vibrato dotato di una lama di rasoio fresca tagliata dalla periferia, tagliando il lobo polmonare in fette spesse 200 micron. Per ottenere sezioni trasversali delle arterie pre aser più grandi, allineare l'ilo del polmone sinistro con il tappo di champagne e incollare il lobo in questo orientamento al supporto, quindi tagliato dalla periferia per la rimozione degli aros.

Trasferisci le sezioni dell'organo in un bicchiere di vetro riempito con circa 200 millilitri a 37 gradi Celsius. MEM ha messo il becher in una camera di riscaldamento e ha fatto bollire con gas normossico in modo che le sezioni polmonari si muovano lentamente nel mezzo. Dopo circa due ore, le placche aros che riempiono l'aria saranno state rimosse dal tessuto polmonare e le sezioni si saranno depositate sul fondo del becher.

Per l'analisi morfometrica video delle arterie intrapolmonari, trasferire una sezione polmonare nella camera di superfusione a flusso continuo, montata su un microscopio e riempita con 1,2 millilitri di gas normossico. MEM. Fissare la sezione polmonare sul fondo della camera con corde di nylon collegate a un anello di platino. Iniziare a perfondere la camera con mezzo gassato normossico.

Utilizzare un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10 x per scansionare la sezione polmonare alla ricerca di arterie in sezione trasversale con diametri interni compresi tra 20 e 100 micron. Una volta individuato un recipiente candidato ragionevole, utilizzare l'obiettivo 20 x per scattare una foto di un recipiente pre asner o, come mostrato qui, l'obiettivo 40 x per scattare una foto di un'arteria intra asner per la misurazione del diametro interno del recipiente. Prima di iniziare l'esperimento, impostare il software per scattare foto dell'arteria sezionata ogni minuto durante l'intero esperimento.

Dopo aver attivato la fotografia, continuare la perfusione della camera con il mezzo gassoso normossico per 10 minuti. Quindi bagnare la sezione polmonare in U 466 19 per 10 minuti senza flusso per analizzare la contrattilità dell'arteria utilizzando solo vasi le cui aree luminali erano ridotte di almeno il 30%Con l'U 466 19. Lavare il farmaco con un gast medio normossico per 10 minuti.

Quindi dilatare l'arteria applicando res per 10 minuti senza flusso basso. Ancora una volta, rimuovere il farmaco con un lavaggio di 10 minuti con mezzo gassato normossico a una velocità di flusso di sei millilitri al minuto, seguito da 10 minuti a un flusso di 0,7 millilitri al minuto. Successivamente, incubare la fetta polmonare con un terreno gassoso ad alto ipossia per 40 minuti.

Far fluire anche la miscela di gas ipossico nello spazio aereo della camera di perfusione attraverso un set aggiuntivo di tubi. Rimuovere il mezzo ipossico con un lavaggio di 20 minuti con mezzo gassato normossico e passare dal flusso di gas ipossico a quello normossico nello spazio aereo della camera per verificare la vitalità del recipiente. Al termine dell'esperimento, applicare U 466 19 nella camera di perfusione e incubare per 20 minuti senza flusso per indurre vasocostrizione.

Ripetere questi passaggi con una sezione polmonare fresca per misurare la reattività del vaso di un altro vaso. Iniziare l'analisi caricando le immagini delle arterie sezionate trasversalmente in un programma di analisi delle immagini. Quindi usa un cursore per delineare l'area luminale del vaso.

L'asciugatura delle mani è necessaria in quanto evita artefatti dovuti, ad esempio, alle cellule del sangue attaccate alla parete vascolare. Continuare ad analizzare le immagini della sezione trasversale in modo simile. Ogni immagine dovrebbe essere analizzata quando una condizione nel flusso attraverso la camera di incubazione viene modificata in un'altra, ma l'analisi di ogni altra immagine è sufficiente quando le condizioni non cambiano.

La vasocostrizione polmonare ipossica è osservabile in queste immagini a contrasto di fase di un'arteria pre ASIN in sezione trasversale, che corre in prossimità di un bronco in sezione trasversale. Le immagini sono scattate nei punti temporali indicati da cerchi nel grafico all'inizio della misurazione, alla fine della misurazione con U 466 19, al termine dell'esposizione a RA dopo 30 o 40 minuti in mezzo gassato ipossico, dopo il lavaggio con mezzo gassato normossico, e dopo l'applicazione finale di U 466 19, la reattività del vaso viene registrata come variazioni relative dell'area luminale della sezione trasversale arteria contro il tempo. L'area all'inizio dell'esperimento è definita come 100% e la vasocostrizione è data come valori relativi all'area iniziale.

In questo caso, l'esposizione all'ipossia induce una riduzione del 60% dell'area luminale per una presentazione più chiara della risposta ipossica. La fase iniziale dell'esperimento in cui è stata testata la reattività vasale non è mostrata qui e il valore ottenuto immediatamente prima dell'esposizione all'ossigeno ridotto è fissato al 100%L'altro tipo di vasi esaminati in questi studi sono le arterie intra ASIN, che si trovano in corrispondenza dei soffietti alveolari. In questa serie di esperimenti, viene analizzato a questo scopo l'impatto di sidal, un apritore non selettivo dei canali del potassio sensibili al TP mitocondriale A sulla vasocostrizione polmonare ipossica delle piccole arterie intraasner.

Le fette vengono incubate in mezzo ipossico. In assenza o presenza di 50 micromolari sidal di controllo, le incubazioni vengono eseguite in terreno gassoso normossico per una presentazione più chiara della risposta alla normossia o all'ipossia o all'ipossia più sidale. I valori ottenuti immediatamente prima dell'esposizione al mezzo gassoso normossico o ipossico sono fissati come 100%L'arteria esposta alla pineale non mostra una diminuzione dell'area, così come l'arteria incubata in mezzo ipossico senza additivi.

Nel mezzo normossico, non sono rilevabili cambiamenti nell'area luminale. Le registrazioni di piccole arterie intra ASIN esposte a mezzo gassoso ipossico con o senza sidal 50 micromolari sono presentate come medie più o meno SEM. In questo grafico sono riportati i dati relativi in relazione al valore all'inizio dell'incubazione ipossica.

Non è rilevabile alcuna reattività vascolare. Nelle fette polmonari esposte a gast ipossico, il mezzo contenente vasocostrizione pineale indotta da U 466 19 non è influenzato dal farmaco. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare la precisione dello specchio, tagliare fette di polmone e come usarle per la misurazione quantitativa della reattività VA di piccole arterie intra asina con diametri compresi tra 20 e 40 micrometri, che si trovano a Gas dei setti alveolari, e di arterie pre ateniche più grandi con diametri compresi tra 40 e 100 micrometri, che corrono adiacenti ai Bronchi e ai Bronchioli.