Name: Uso dellimaging in vivo per lo screening dei fenotipi di morfogenesi in ceppi mutanti di Candida albicans durante linfezione attiva in un ospite di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Scopri un metodo di imaging in vivo per analizzare la morfogenesi di Candida albicans in un ospite mammifero utilizzando la microscopia confocale. Questa tecnica consente di studiare i fenotipi di filiazione senza artefatti in vitro.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH 1R01AI33409 e dal Dipartimento di Pediatria, Carver College of Medicine, Università dell'Iowa.

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo modello utilizza la microscopia confocale per ottenere immagini degli organismi di C. albicans mentre crescono all'interno del tessuto di un ospite di mammifero, permettendoci così di valutare i fenotipi della morfogenesi durante l'infezione attiva. Il processo di morfogenesi è centrale per la patogenesi di C. albicans ed è stato ampiamente studiato utilizzando una varietà di saggi in vitro 2,3,4. Tuttavia, nessun test in vitro può modellare completamente il complesso ambiente biochimico e strutturale dell'ospite.
Il protocollo qui descritto è focalizzato sull'uso di questo sistema di imaging in vivo per lo screening di una serie / libreria di mutanti di C. albicans per identificare i geni coinvolti nella morfogenesi durante l'infezione. L'uso di ceppi di C. albicans che esprimono diverse proteine fluorescenti ci permette di quantificare in vivo la morfogenesi dei ceppi mutanti di C. albicans rispetto a quella di un ceppo di riferimento. Il confronto della morfogenesi nel mutante con il ceppo di riferimento all'interno della stessa area di infezione assicura che gli organismi siano esposti ad ambienti identici. Ciò consente la misurazione quantitativa della percentuale di cellule sottoposte a filamentazione, nonché l'entità della filamento. La normalizzazione delle misurazioni dei ceppi mutanti con quelle del ceppo di riferimento ci consente di confrontare meglio le prestazioni di un mutante con un altro.
I risultati rappresentativi qui presentati dimostrano il potenziale per una discrepanza significativa tra fenotipi in vitro e in vivo . Il ceppo mutante di C. albicans efg1ΔΔ è spesso usato come controllo negativo per i saggi di morfogenesi in quanto non riesce a filarsi in quasi tutte le condizioni in vitro 20. Sebbene i risultati in vivo fossero molto simili ai risultati in vitro , anche questo ceppo gravemente ostacolato ha occasionalmente formato filamenti nell'ambiente del tessuto ospite (Figura 3). Questo sottolinea la forza dell'ambiente ospite nell'innescare la morfogenesi.
Al contrario, il ceppo mutante cyr1ΔΔ dimostra una sostanziale discordanza tra crescita in vitro e in vivo; sebbene nessuna delle cellule mutanti subisca filamentazione in vitro, circa la metà delle cellule cresce come filamenti in vivo (Figura 4)10,21. È interessante notare che questi filamenti erano significativamente più corti di quelli formati dal ceppo di riferimento, suggerendo che CYR1 contribuisce al tasso di crescita del filamento o alla capacità di mantenere un fenotipo filamentoso. Per facilitare l'analisi della lunghezza del filamento, la lunghezza del percorso della curva dei filamenti è stata misurata utilizzando una proiezione bidimensionale delle immagini. Nelle proiezioni bidimensionali di filamenti che crescono in tre dimensioni, qualsiasi filamento che cresce su un asse che non è parallelo al piano xy proietterà più corto della sua lunghezza reale. Poiché questo scorcio si verifica anche per il ceppo di riferimento, la valutazione della distribuzione delle lunghezze dei filamenti in una proiezione bidimensionale consente ancora un confronto quantitativo tra i ceppi di riferimento e mutanti. L'analisi della lunghezza del filamento in due anziché tre dimensioni richiede un'analisi dell'immagine meno intensiva; Pertanto, può essere eseguito in tempi relativamente brevi su un tipico computer desktop. L'utilizzo di questa analisi più semplice consente di includere la distribuzione della lunghezza del filamento come parte di un protocollo di screening, fornendo una comprensione più sfumata della capacità di ciascun mutante di subire morfogenesi senza causare ritardi sostanziali nel throughput.
Gli studi rappresentativi qui presentati sono stati eseguiti utilizzando topi DBA2/N, che hanno un difetto nel loro sistema del complemento che causa un mancato reclutamento di neutrofili nel sito dell'infezione da C. albicans 22. L'obiettivo di questi studi era quello di studiare i meccanismi di regolazione della filamentazione di C. albicans all'interno del tessuto ospite. Pertanto i topi DBA2/N sono stati utilizzati per evitare di confondere i risultati a causa della suscettibilità o della resistenza di un singolo ceppo ai neutrofili. Poiché la risposta dei neutrofili anti-C. albicans può influire sulla filamento23, il reclutamento dei neutrofili nel sito di infezione potrebbe influire sui risultati di un test di morfogenesi. Se un ceppo è in grado di filamentare in vivo ma è fortemente inibito dalla filamento quando sono presenti neutrofili, la filamentazione verrebbe rilevata nei topi DBA2/N, ma sarebbe improbabile che venga osservata quando si usano topi con chemiotassi neutrofila intatta. Pertanto, lo sforzo del mouse utilizzato come host è un fattore importante quando si utilizza questo protocollo.
È improbabile che l'osservazione che il ceppo mutante efg1ΔΔ non riesca a filamentarsi in vivo sia correlata alle risposte dei neutrofili dell'ospite, perché anche questo ceppo non riesce a filarsi in vitro. La filamentazione osservata in vivo con il ceppo cyr1ΔΔ è discordante con la sua mancata filamento in vitro. I dati del modello zebrafish dell'infezione da C. albicans indicano che i neutrofili che rispondono sono importanti nella prevenzione della morfogenesi24. Pertanto, è improbabile che l'uso di topi DBA2/N, privi di risposte neutrofile, spieghi l'aumento della filamentazione del ΔΔ cyr1in vivo rispetto a quello in vitro. Tuttavia, l'ambiente in vivo sta chiaramente influenzando la morfogenesi del ceppo cyr1ΔΔ; pertanto, ulteriori indagini su questo ceppo possono fornire importanti informazioni sulla regolazione della morfogenesi di C. albicans durante le infezioni attive. Il protocollo qui descritto è progettato come un test di screening per identificare ceppi come il ceppo cyr1ΔΔ da utilizzare in studi futuri.
L'uso di un sistema di anestesia a gas a basso flusso è molto utile per questo protocollo (Figura 1A, B). Durante lo sviluppo iniziale di questo protocollo, i topi sono stati anestetizzati usando un cocktail anestetico iniettabile di ketamina mescolato con xilazina. Mentre era possibile eseguire immagini limitate con quel metodo anestetico, la durata dell'anestesia era imprevedibile, richiedendo che le sessioni di imaging fossero terminate rapidamente per evitare che il topo si riprendesse dall'anestesia durante l'imaging. I sistemi anestetici tradizionali per via inalatoria sono ingombranti e richiedono alti tassi di flusso di gas anestetici, spesso richiedendo di essere utilizzati all'interno di una cappa aspirante. Pertanto, i tradizionali sistemi anestetici inalati sarebbero molto difficili da usare con i vincoli di spazio di un microscopio confocale senza esporre inavvertitamente i ricercatori agli agenti anestetici. L'uso di un sistema anestetico inalato a basso flusso consente un'anestesia coerente dell'animale mantenendo un ambiente sicuro per lo sperimentatore. Il naso a basso flusso consente un facile posizionamento dell'animale sia per l'inoculazione che per la microscopia. Il tubo di erogazione di piccolo calibro e a basso volume consente l'uso di tubi relativamente lunghi, che consentono di posizionare la macchina per anestesia a una distanza sufficiente per non interferire con la microscopia.
La clorofilla presente nel tipico topo porta ad una significativa autofluorescenza tissutale25. Ciò crea un rumore sostanziale nelle immagini, rendendo difficile ottenere immagini di alta qualità e ad alta risoluzione spaziale. Quando gli animali sono stati nutriti con chow privo di clorofilla per 7 giorni prima dell'imaging, il background da autofluorescenza era sostanzialmente diminuito nei tessuti, ma la clorofilla depositata nei capelli continuava ad essere problematica. La rimozione dei peli sui padiglioni auricolari utilizzando una crema depilatoria chimica da banco è efficace nel ridurre al minimo l'autofluorescenza nei capelli (Figura 1C, D). Pertanto, la combinazione di chow privo di clorofilla e un'adeguata depilazione ha ridotto sostanzialmente l'autofluorescenza e migliorato notevolmente la qualità dell'immagine. Poiché i peli vengono rimossi dall'orecchio prima dell'imaging, il colore dei capelli dell'animale non influisce su questo sistema. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare le infezioni da C. albicans in topi BALB / c (bianco), C57BL / 6 (nero) e DBA2 / N (marrone). Il protocollo può essere utilizzato anche con topi knockout C57BL/6 carenti di vari geni dell'ospite; Ciò consentirà future indagini su come il sistema immunitario dell'ospite dei mammiferi influisce sulla filamento. Una caratteristica di questo modello non discussa in questo protocollo è che, poiché questo sistema di imaging non è invasivo, lo stesso animale può essere ripreso ripetutamente per diversi giorni, consentendo di seguire l'andamento della singola infezione nel tempo. Questa caratteristica giocherà probabilmente un ruolo chiave negli studi futuri sull'interazione ospite-patogeno.
In sintesi, questo protocollo si traduce in immagini ad alta risoluzione spaziale di C. albicans che crescono nel tessuto di un ospite di mammifero vivo, consentendo una valutazione accurata della morfogenesi nei ceppi mutanti 8,9,10. I risultati presentati qui dimostrano come questo protocollo possa essere utilizzato per lo screening di una libreria di mutanti di C. albicans. Dei mutanti di C. albicans testati fino ad oggi, una gran parte dei mutanti con difetti noti nella morfogenesi in vitro si sottopongono prontamente alla filamentazione in vivo 9,10. Ciò evidenzia l'importanza di includere un sistema in vivo come questo negli esperimenti progettati per chiarire i meccanismi della patogenesi di C. albicans.

La Candida albicans è un comune agente patogeno fungino umano, che causa malattie mucocutanee, malattie disseminate e infezioni tissutali localizzate1. Una caratteristica chiave della fisiologia di C. albicans è la sua complessa crescita polimorfica, che è legata al suo ruolo sia come commensale che come patogeno 2,3,4. In condizioni di ricche sostanze nutritive in vitro a 30 °C, cresce tipicamente come lievito ovoidale in erba. Una varietà di fattori scatenanti ambientali, tra cui la privazione di nutrienti, i cambiamenti di pH, la crescita a 37 ° C, l'esposizione al siero e la crescita quando incorporati nell'agar, provocano la transizione verso un modello di crescita polarizzato, con conseguente formazione di vere ife e / o pseudoife5. L'inizio della crescita polarizzata e la conseguente crescita di organismi filamentosi è indicato come morfogenesi.
A causa dell'importanza della morfogenesi nella virulenza dell'organismo, la regolazione della formazione delle ife è stata ampiamente studiata 6,7. Esiste una complessa rete di vie di segnalazione e regolazione trascrizionale che innesca la morfogenesi. Nonostante la relazione della morfogenesi di C. albicans con la patogenesi, la maggior parte degli studi che studiano la morfogenesi hanno utilizzato stimoli in vitro per innescare la formazione di ifele. Sta diventando sempre più chiaro che i vari modelli in vitro di filamento non sono identici in termini di percorsi regolatori individuali stimolati. Inoltre, nessuna condizione di crescita in vitro corrisponde strettamente al complesso ambiente dell'ospite. Data l'importanza di C. albicans come patogeno umano, l'obiettivo di questo protocollo è quello di studiare la sua morfogenesi durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero utilizzando un sistema con throughput moderato, consentendo così a un investigatore di esaminare le librerie mutanti di C. albicans. 
Per facilitare queste indagini, è stato sviluppato un sistema di imaging in vivo che ci permette di ottenere immagini ad alta risoluzione spaziale delle cellule di C. albicans durante l'infezione del padiglione auricolare di un topo anestetizzato utilizzando un microscopio confocale invertito 8,9,10. Poiché la pelle del padiglione auricolare è piuttosto sottile, queste immagini possono essere ottenute senza la necessità di dissezione tissutale. Pertanto, i dati quantitativi sul fenotipo possono essere misurati nel sito di infezioni attive all'interno del tessuto ospite. Il protocollo qui descritto prevede la trasformazione di un ceppo di riferimento e di uno o più ceppi mutanti con diverse cassette di espressione proteica fluorescente11,12. I ceppi fluorescenti che esprimono proteine vengono quindi miscelati e co-iniettati per via intradermica. Dopo che l'infezione è stata stabilita, l'imaging confocale viene utilizzato per quantificare sia la frequenza della filamento che la lunghezza dei filamenti formati. I dati ottenuti dai ceppi mutanti sono normalizzati a quelli ottenuti dal ceppo di riferimento, che è presente nella stessa regione tissutale, fornendo così un controllo interno. Questo sistema ci ha permesso di selezionare con successo diverse serie di ceppi mutanti di C. albicans, molti dei quali presentano difetti di morfogenesi in vitro 9,10. Molti di questi ceppi filano facilmente in vivo, evidenziando l'importanza dei modelli in vivo per lo studio della morfogenesi.

<table><tbody><tr><td>#1.5 vetrini coprioggetti</td><td>Thermo-Fisher</td><td>20811</td><td>abbastanza grande da coprire l'apertura del tavolino universale</td></tr><tr><td>0.1mL Siringhe da insulina</td><td>EXELint</td><td>26018</td><td>Può utilizzare siringhe da 5/16"&ndash; 1/2" di lunghezza e 29" 32 G</td></tr><tr><td>3,7% di formaldeide in dPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBJ5734</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo/30% acqua</td><td>Decon Laboratories</td><td>A05061001A</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol</td><td>Covidien</td><td>5110</td><td>Alternativa: garze imbevute di alcol isopropilico al 70%</td></tr> <tr><td>C.albicans ceppo di riferimento e ceppi sperimentali</td><td>SN250</td><td>FGSC Catalogo</td> <td>onlineIl ceppo specifico C. albicans varia a seconda dell'esperimento e degli obiettivi dei ricercatori. Abbiamo utilizzato ceppi derivati da SC5314 e altri isolati clinici.</td></tr><tr><td>Clorofilla senza mouse</td><td>chow Envigo</td><td>2920x</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7050</td><td>Computer in grado di eseguire software di imaging per l'acquisizione e l'analisi delle immagini. È disponibile una varietà di software di imaging che varia a seconda del microscopio specifico e del sistema utente.</td></tr><tr><td>Applicatore con punta in cotone</td><td>Pro Advantage</td><td>76200</td><td></td></tr><tr><td>DBA2/N (topi di 6-12 settimane)</td><td></td><td></td><td>Possono essere utilizzati anche i topi BALB/c e C57/BL6.&nbsp; Questi ultimi consentono l'uso di modelli murini knockout ampiamente disponibili e di modelli murini in cui i singoli tipi di cellule, come i fagociti, sono identificati dalla loro espressione di proteine fluorescenti.</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo progettato per tenere il tessuto sulla pelle (nastro di moda)</td> <td>farmacia locale o negozio</td><td></td> di alimentari <td>Nastro biadesivo progettato per mantenere gli indumenti in posizione sulla pelle umana. Questo è in genere disponibile al banco nelle farmacie e nei negozi di varietà. È importante utilizzare questo tipo di nastro in quanto è progettato per un'aderenza delicata alla pelle. Esempi:&nbsp; https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =moda+nastro& qid=1649174406& sprefix= moda+nastro%2Caps%2C70& sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =moda+nastro& qid=1649174320& sprefix= moda+nastro%2Caps%2C70& sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =moda+nastro& qid=1649174406& sprefix= moda+nastro%2Caps%2C70& sr=8-29</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>14190-144</td><td>Deve essere sterile; aprire un nuovo contenitore per ogni esperimento</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td>Pro Advantage</td><td>P157112</td><td></td></tr><tr><td>Gel lurbicant per gli occhi</td><td>farmacia locale o negozio</td><td></td><td></td>di alimentari</tr><tr><td>ImageJ o FIJI software di analisi</td><td>NIH</td><td>ImageJ (FIJI)</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Akorn</td><td>J119005</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 (piattaforma SP8) con obiettivo Leica 11506375 Leica</td><td></td><td>DMi8 (SP8)</td><td>La lente dell'obiettivo&nbsp; (Leica 11506375) usato qui&nbsp; è una lente ad immersione in acqua 25x per permetterci di avere un NA elevato (0,95) mentre si avvicina l'indice di rifrazione del tessuto dell'orecchio. Il microscopio (Leica DMi8 (piattaforma SP8) ha linee laser a diodi da 488 nm e 638 nm ed è dotato di rilevamento spettrale senza filtro con larghezza di banda regolabile controllata da computer per il rilevamento della luce di emissione. Il tavolino deve avere uno spazio sufficiente per consentire all'obiettivo di Raggiungi il vetrino coprioggetti inferiore senza colpire il palco.</td></tr><tr><td>Sistema di anestesia a basso flusso o vaporizzatore per anestesia tradizionale</td><td>Kent Scientific International</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Nair lozione depilatoria</td><td>farmacia locale o negozio</td><td></td> di alimentari <td>Crema depilatoria da banco</td></tr><tr><td>Nourseotricina</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-101L</td><td></td></tr><tr><td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmidi</td><td></td><td></td><td>Costrutti di trasformazione dell'espressione proteica fluorescente&nbsp; generosamente donatoci dal Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infezione e immunità; Bergeron, et al., 2017, Infezione e immunità)</td></tr><tr><td>Nastro da laboratorio sensibile alla pressione</td><td>Tape & Label Graphic Systems Inc</td><td>1007910</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 terreno di coltura cellulare</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Ditale, provetta conica in plastica da 15 mL o provette in polistirene a fondo tondo Falcon da 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>Per trattenere in sicurezza l'orecchio degli animali durante le iniezioni</td></tr></tbody></table>

uso dell'imaging in vivo per lo screening dei fenotipi di morfogenesi in ceppi mutanti di candida albicans durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

La Candida albicans è un importante agente patogeno umano. La sua capacità di passare da una forma morfologica all'altra è fondamentale per la sua patogenesi; Questi cambiamenti morfologici sono regolati da una complessa rete di segnalazione controllata in risposta a stimoli ambientali. Questi componenti regolatori sono stati altamente studiati, ma quasi tutti gli studi utilizzano una varietà di stimoli in vitro per innescare la filamento. Per determinare come la morfogenesi è regolata durante il processo di patogenesi, abbiamo sviluppato un sistema di microscopia in vivo per ottenere immagini ad alta risoluzione spaziale di organismi sottoposti a formazione di ife all'interno dell'ospite mammifero. Il protocollo qui presentato descrive l'uso di questo sistema per lo screening di piccole collezioni di ceppi mutanti di C. albicans, permettendoci di identificare i regolatori chiave della morfogenesi mentre si verifica nel sito di infezione. Vengono presentati risultati rappresentativi, dimostrando che alcuni regolatori della morfogenesi, come il regolatore trascrizionale Efg1, hanno fenotipi coerenti in vitro e in vivo, mentre altri regolatori, come l'adenilciclasi (Cyr1), hanno fenotipi significativamente diversi in vivo rispetto a quelli in vitro.

I risultati qui presentati si basanosui rapporti 9,10 pubblicati in precedenza. L'obiettivo di questa analisi è valutare quantitativamente la capacità dei ceppi mutanti di C. albicans di subire morfogenesi durante le infezioni attive. I parametri tipici che distinguono le pseudoife dalle ife possono essere difficili da valutare in organismi che crescono in tre dimensioni in un ambiente complesso in vivo. Ciò è particolarmente vero quando si osservano le sezioni trasversali bidimensionali create dall'imaging confocale. Pertanto, questa analisi di screening si concentra sull'identificazione degli organismi che crescono come filamentosi rispetto al lievito. Per gli studi di follow-up che utilizzano un'analisi più approfondita, comprese le ricostruzioni tridimensionali, questo metodo potrebbe essere adattato per discriminare lieviti, ife e pseudoife.
L'espressione di una proteina fluorescente in un ceppo di riferimento o mutante di C. albicans consente di rilevare direttamente la morfologia del ceppo in vivo (Figura 3 e Figura 4). In generale, l'analisi quantitativa al microscopio ottico viene eseguita al meglio quando pochi o nessuno dei pixel nell'immagine è saturo. Per questo protocollo, tuttavia, una saturazione dell'immagine spesso semplifica l'analisi. La localizzazione delle proteine fluorescenti non è uniforme in tutta la cellula ed è spesso più alta nel lievito madre che nei filamenti. Fortunatamente, per lo studio della morfogenesi, la distribuzione spaziale del segnale, piuttosto che la sua intensità, definisce il risultato. Pertanto, ottenere immagini in cui molti pixel sono saturi migliora la capacità di quantificare la morfogenesi in questo test.
Per illustrare l'importanza di valutare la morfogenesi in vivo, vengono presentati risultati rappresentativi per il ceppo di riferimento (SN250) e due mutanti: uno privo del fattore di trascrizione Efg1 e l'altro privo di adenilil ciclasi Cyr1. In vitro, nessuno di questi ceppi cresce come filamenti20,21. Quando viene coltivato in vitro in mezzo RPMI integrato con siero al 10%, il ceppo di riferimento forma rapidamente filamenti, mentre i ceppi efg1ΔΔ e cyr1ΔΔ non lo fanno (Figura 3 e Figura 4). In queste condizioni, il mutante efg1ΔΔ mostra una crescita piuttosto polarizzata, con le cellule figlie leggermente allungate rispetto alle cellule madri. Ciò sottolinea l'importanza di utilizzare una chiara definizione di filamento. Qualsiasi definizione di questo tipo è per impostazione predefinita arbitraria, ma è necessaria per una valutazione coerente del fenotipo. Per questi studi, un modello filamentoso di crescita è definito come un organismo con la dimensione più lunga di una cellula figlia più del doppio di quella della cellula madre. Usando questa definizione, le cellule ΔΔ efg1allungate non sono filamentose.
Coerentemente con il suo fenotipo in vitro, efg1 ΔΔ mostra un significativo difetto di filamentazione in vivo: circa il 9% delle cellule efg1ΔΔ è cresciuto come filamenti in vivo (Figura 3). Al contrario, il 53% delle cellule mutanti ΔΔ cyr1è cresciuto come filamenti in vivo (Figura 4). Sebbene il numero di cellule mutanti ΔΔ cyr1 sottoposte a filamentazione in vivo fosse significativamente inferiore rispetto al ceppo di riferimento, la capacità del mutante ΔΔ cyr1di formare filamenti in vivo rappresenta un cambiamento sostanziale rispetto alla sua completa mancanza di morfogenesi in vitro. Visivamente, i filamenti formati dal mutante cyr1ΔΔ sembravano essere più corti del ceppo di riferimento. Per valutare questo quantitativamente, la lunghezza del percorso della curva delle celle filamentose è stata misurata utilizzando una proiezione bidimensionale delle immagini in vivo (Figura 4E). La lunghezza mediana dei filamenti di ΔΔ cyr1era inferiore del 29% rispetto ai filamenti del ceppo di riferimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Figura 1: Anestesia e inoculazione . (A) Induzione dell'anestesia utilizzando una camera di induzione. (B) L'anestesia viene mantenuta utilizzando un cono nasale, che consente di riposizionare il mouse secondo necessità. (C) La crema depilatoria viene applicata utilizzando un applicatore con punta di cotone. Il gel lubrificante per gli occhi è stato applicato per proteggere gli occhi durante l'anestesia. (D) Depilazione efficace dell'orecchio destro. Confronta con l'orecchio sinistro non trattato. (E) Iniezione intradermica di C. albicans nell'orecchio del topo. L'orecchio viene tenuto in posizione usando la punta di un tubo conico avvolto con nastro biadesivo (nastro di moda). (F) Primo piano dell'iniezione intradermica. Nella pelle si forma una bolla pallida, che è un segno di un posizionamento intradermico di successo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Figura 2: Preparazione per l'imaging. (A) Fase del microscopio preparata per l'imaging. Il cono del naso dell'anestesia è fissato in posizione. Una copertina è fissata al palco che copre l'apertura della lente. Sono disponibili ulteriori pezzi di nastro. Lo stadio riscaldato è preriscaldato a 37 °C (non mostrato). (B) Posizionamento del topo anestetizzato nel cono del naso dell'anestesia. (C) Il mouse viene ruotato leggermente in modo che il lato dell'orecchio che è stato inoculato sia rivolto verso il coperchio inferiore/lente dell'obiettivo. L'orecchio viene quindi appiattito contro il coprislip inferiore e fissato in posizione posizionando un secondo coprislip sulla parte superiore dell'orecchio. (D) Il coprislip superiore è fissato al palco per fissare l'orecchio in posizione rispetto al palco del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Figura 3: Morfologia in vitro e in vivo del ceppo mutante efg1ΔΔ . (A) Immagine a campo largo di ceppi mutanti WT ed efg1ΔΔ dopo induzione in vitro della filamentazione mediante cellule in crescita in RPMI + 10% di siero a 37 °C per 4 ore. Le barre della scala rappresentano 10 μm. Il contrasto dell'immagine è stato regolato utilizzando un software di fotoritocco per facilitare la visualizzazione. (B) Percentuale di filamentazione in vitro osservata nei ceppi mutanti WT ed efg1ΔΔ. Und = non rilevabile (non sono stati rilevati filamenti). L'altezza della barra rappresenta la percentuale mediana di cellule filamentose da tre esperimenti indipendenti in cui sono state quantificate almeno 100 cellule. Le barre di errore indicano la deviazione standard (risultati confrontati dal test t dello studente, p &lt; 0,001). (C) Micrografia confocale di WT (verde) e del mutante efg1ΔΔ (rosso) che cresce in vivo 24 ore dopo l'inoculazione. Le frecce indicano esempi di cellule mutanti efg1ΔΔ che soddisfano la nostra definizione di "filamentose". La barra della scala rappresenta 50 μm. (D) Percentuale di filamentazione in vivo osservata nei ceppi mutanti WT ed efg1ΔΔ. L'altezza della barra rappresenta la percentuale mediana di cellule filamentose da due esperimenti indipendenti. Le barre di errore indicano la deviazione standard (risultati confrontati dal test t dello studente, p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Figura 4: Morfologia in vitro e in vivo del ceppo mutante cyr1 ΔΔ. (A) Immagine a campo ampio del ceppo mutante cyr1ΔΔ dopo induzione in vitro della filamentazione mediante cellule in crescita in RPMI + 10% siero a 37 °C per 4 ore. La barra della scala rappresenta 10 μm. Il contrasto dell'immagine è stato regolato utilizzando un software di fotoritocco per facilitare la visualizzazione. (B) Percentuale di filamento in vitro osservata nei ceppi mutanti WT e cyr1ΔΔ. Und = non rilevabile (non sono stati rilevati filamenti). L'altezza della barra rappresenta la percentuale mediana di cellule filamentose da tre esperimenti indipendenti in cui sono state quantificate almeno 100 cellule. Le barre di errore indicano la deviazione standard (risultati confrontati con il test t dello studente, p &lt; 0,001). (C) Micrografia confocale di WT (verde) e del mutante cyr1ΔΔ (rosso) che cresce in vivo 24 ore dopo l'inoculazione. La barra della scala rappresenta 50 μm. (D) Percentuale di filamentazione in vivo osservata nei ceppi mutanti WT e cyr1ΔΔ. L'altezza della barra rappresenta la percentuale mediana di cellule filamentose da due esperimenti indipendenti. Le barre di errore indicano la deviazione standard (risultati confrontati dal test t dello studente, p &lt; 0,001). (E) Distribuzione della lunghezza del filamento in vivo, misurata dalla lunghezza del percorso della curva in una proiezione bidimensionale dello z-stack. Ogni punto rappresenta la lunghezza di un filamento. Le cellule che crescono come lievito non sono state incluse in questa analisi. La barra indica la lunghezza mediana del filamento. La distribuzione delle lunghezze è significativamente diversa quando analizzata utilizzando un test U di Mann-Whitney (p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Questo manoscritto descrive un metodo per lo screening di librerie mutanti di Candida albicans di dimensioni moderate per fenotipi di morfogenesi durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero utilizzando la microscopia confocale non invasiva.

Uso dell'imaging in vivo per lo screening dei fenotipi di morfogenesi in ceppi mutanti di Candida albicans durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

La morfogenesi della Candida albicans è innescata da una miriade di segnali ambientali. Studiando la morfogenesi in vivo, stiamo determinando come l'organismo si integra e risponde a tutti questi segnali ambientali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di studiare la morfogenesi in assenza di bias o artefatti che potrebbero essere introdotti utilizzando sistemi modello in vitro.Pochissime persone hanno esperienza con iniezioni intradermiche. Consiglio vivamente a qualcuno nuovo a questa tecnica di contattare il proprio veterinario delle risorse animali per aiutarlo a impararlo. A dimostrare la procedura sarà Rohan Wakade, un borsista post-dottorato del nostro gruppo di laboratorio.Inizia preparando l'animale per l'inoculazione alimentando chow privo di clorofilla per almeno sette giorni prima dell'inoculazione. Un giorno prima dell'iniezione, prendere un tampone di cellule albicans del Canada da una colonia usando uno stuzzicadenti. Inoculare 25 millilitri di YPD e ripetere questo processo più volte per ottenere cellule da diverse colonie.Incubare la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius in un incubatore orbitale a 175 RPM. Centrifugare un millilitro di coltura per due minuti a 500 x g, quindi lavare il lievito tre volte con un millilitro di DPBS sterile. Risospendere il pellet in un millilitro di DPBS sterile e diluire la coltura da 1 a 100.Contare le cellule usando un emocitometro e regolare di conseguenza la densità cellulare. Quindi, creare l'inoculo per iniezione mescolando volumi uguali del ceppo di riferimento e sperimentale. Utilizzando un batuffolo di cotone, applicare una crema depilatoria da banco liberamente sulla superficie interna ed esterna di entrambe le orecchie di un animale anestetizzato.Dopo due o tre minuti, pulire delicatamente l'orecchio con una garza asciutta seguita da tamponi di garza saturi di acqua sterile per rimuovere accuratamente i residui di crema depilatoria. Dopo aver sterilizzato la superficie delle orecchie con etanolo al 70%, mescolare bene l'inoculo capovolgendo la fiala più volte o vorticciandola. Aspirare da 20 a 30 microlitri di inoculo in una siringa da insulina.Tenere l'ago in posizione verticale e picchiettare delicatamente la siringa per assicurarsi che l'aria nel cilindro sia nella parte superiore. Espellere con cautela l'aria e l'inoculo in eccesso nel tubo dell'inoculo o in un tubo di scarico in modo che lo stantuffo sia al segno di 10 microlitri. Applicare il nastro biadesivo da banco su un piccolo tubo di plastica conico o rotondo e drappeggiare l'orecchio attraverso il nastro, evitando di rimuovere il cono del naso dell'anestesia.Mantenendo l'ago della siringa quasi parallelo alla pelle ed evitando vene grandi, inserire la punta dell'ago nello strato più esterno della pelle fino a quando la smussatura è appena coperta e iniettare lentamente l'inoculo per via intradermica. Una buona iniezione intradermica solleverà una piccola bolla nella pelle. Tenere l'ago in posizione per 15-20 secondi prima di rimuoverlo dall'orecchio per ridurre al minimo le perdite.Seguendo i protocolli istituzionali, contrassegnare la gabbia con etichette di rischio biologico che indicano che gli animali nella gabbia sono infetti da Candida albicans. Utilizzando le stesse colture lavate che sono state utilizzate per preparare l'inoculo, creare una diluizione da 1 a 50 di cellule in RPMI 1640, integrata con il 10% di calore e siero fetale attivo bovino e incubare a 37 gradi Celsius con ruzzolazione per quattro ore. Esaminare il campione utilizzando un microscopio.Contare almeno 100 cellule, registrando il numero di lieviti e cellule filamentose per ogni ceppo. Ruotare l'obiettivo a lunga distanza di lavoro in posizione e posizionare una goccia di fluido di immersione sull'obiettivo. Abbassare la lente per evitare possibili danni quando si posiziona la slitta del coperchio.Posizionare la copertina numero 1.5 sopra l'apertura del palco e fissarla in posizione. Sollevare l'obiettivo in modo che il fluido di immersione sia a contatto sia con la lente dell'obiettivo che con la vetrina. Fissare un cono naso per anestesia sul palcoscenico del microscopio in modo tale da coprire completamente il naso dell'animale quando è in posizione per l'imaging.Posizionare il naso di un topo anestetizzato nel cono del naso. Posizionare una goccia di acqua sterile sul vetrino del coperchio sopra la lente dell'obiettivo. Regolare il cono del naso dell'anestesia e posizionare il mouse in modo tale che l'orecchio del topo sia sopra la goccia d'acqua.Prendi un'altra linguetta di copertina e posiziona il bordo della copertina parallelamente al corpo del mouse con il bordo che tocca il mouse dove l'orecchio incontra la testa. Utilizzando un movimento a cerniera, abbassare il bordo libero del vetrino del coperchio fino allo stadio del microscopio. Poiché il vetrino di copertura viene contro il palco del microscopio, appiattirà l'orecchio.Fissare saldamente la linguetta del coperchio superiore per mantenere la pressione sufficiente a mantenere l'orecchio piatto ed evitare di catturare i peli o i baffi del mouse nel nastro. A meno che non venga utilizzato un microscopio con una camera ambientale, coprire liberamente il corpo del topo con un drappo sterile per mantenere un normale ambiente termico. Utilizzando la luce bianca, l'imaging a campo ampio, regolare il piano di messa a fuoco nel tessuto auricolare e concentrarsi sui globuli rossi che si muovono nei vasi sanguigni.Per ottenere un rapporto segnale/rumore abbastanza forte in modo che la morfologia possa essere determinata per tutte le celle nel campo visivo, regolare la potenza del laser o la velocità di imaging. Per evitare danni ai tessuti, utilizzare la potenza laser più bassa possibile. Scegli un campo visivo con una chiara formazione di filamenti nel ceppo di riferimento e dove la maggior parte degli organismi è abbastanza sparsa da poter determinare la loro morfologia.Impostate i piani superiore e inferiore di messa a fuoco per uno stack Z. Non è necessario coprire l'intera profondità dell'area infetta, ma tieni presente che gli organismi nella parte superiore o inferiore del volume ripreso sono in genere esclusi dall'analisi. Acquisisci immagini Z-stack, pseudo colora ogni canale per distinguere ogni ceppo e sovrapponi i canali.Salvare le immagini. Utilizzare il software di imaging per eseguire la massima proiezione dello stack Z in un'immagine bidimensionale. Contare ogni organismo visto nelle immagini di proiezione massima per tipo di ceppo e morfologia.Il ceppo di riferimento forma rapidamente filamenti in vitro. Mentre l'EFG1 Null non è riuscito a formare i filamenti. L'EFG1 Null presenta un difetto di filamento significativo anche in vivo.Circa il 9% delle cellule EFG1 Null è cresciuto come filamenti in vivo. Allo stesso modo, il ceppo mutante CYR1 Null ha mostrato un difetto di filamento in vitro rispetto al ceppo di riferimento. Al contrario, il 53% delle cellule mutanti CYR1 Null è cresciuto come filamenti in vivo.I filamenti formati dal mutante CYR1 Null erano più corti del ceppo di riferimento. È fondamentale mantenere l'ago parallelo alla pelle durante l'inoculazione. L'obiettivo è posizionare l'inoculo appena sotto lo strato esterno della pelle.Questa tecnica può essere utilizzata anche con ceppi murini che esprimono una proteina fluorescente nelle cellule ospiti di interesse permettendoci di studiare in vivo le interazioni dei patogeni dell'ospite.

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Uso dellimaging in vivo per lo screening dei fenotipi di morfogenesi in ceppi mutanti di Candida albicans durante linfezione attiva in un ospite di mammifero (Video) | JoVE Journal

Uso dell'imaging in vivo per lo screening dei fenotipi di morfogenesi in ceppi mutanti di Candida albicans durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero

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