Uso dell'imaging in vivo per lo screening dei fenotipi di morfogenesi in ceppi mutanti di Candida albicans durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero

La morfogenesi della Candida albicans è innescata da una miriade di segnali ambientali. Studiando la morfogenesi in vivo, stiamo determinando come l'organismo si integra e risponde a tutti questi segnali ambientali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di studiare la morfogenesi in assenza di bias o artefatti che potrebbero essere introdotti utilizzando sistemi modello in vitro.

Pochissime persone hanno esperienza con iniezioni intradermiche. Consiglio vivamente a qualcuno nuovo a questa tecnica di contattare il proprio veterinario delle risorse animali per aiutarlo a impararlo. A dimostrare la procedura sarà Rohan Wakade, un borsista post-dottorato del nostro gruppo di laboratorio.

Inizia preparando l'animale per l'inoculazione alimentando chow privo di clorofilla per almeno sette giorni prima dell'inoculazione. Un giorno prima dell'iniezione, prendere un tampone di cellule albicans del Canada da una colonia usando uno stuzzicadenti. Inoculare 25 millilitri di YPD e ripetere questo processo più volte per ottenere cellule da diverse colonie.

Incubare la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius in un incubatore orbitale a 175 RPM. Centrifugare un millilitro di coltura per due minuti a 500 x g, quindi lavare il lievito tre volte con un millilitro di DPBS sterile. Risospendere il pellet in un millilitro di DPBS sterile e diluire la coltura da 1 a 100.

Contare le cellule usando un emocitometro e regolare di conseguenza la densità cellulare. Quindi, creare l'inoculo per iniezione mescolando volumi uguali del ceppo di riferimento e sperimentale. Utilizzando un batuffolo di cotone, applicare una crema depilatoria da banco liberamente sulla superficie interna ed esterna di entrambe le orecchie di un animale anestetizzato.

Dopo due o tre minuti, pulire delicatamente l'orecchio con una garza asciutta seguita da tamponi di garza saturi di acqua sterile per rimuovere accuratamente i residui di crema depilatoria. Dopo aver sterilizzato la superficie delle orecchie con etanolo al 70%, mescolare bene l'inoculo capovolgendo la fiala più volte o vorticciandola. Aspirare da 20 a 30 microlitri di inoculo in una siringa da insulina.

Tenere l'ago in posizione verticale e picchiettare delicatamente la siringa per assicurarsi che l'aria nel cilindro sia nella parte superiore. Espellere con cautela l'aria e l'inoculo in eccesso nel tubo dell'inoculo o in un tubo di scarico in modo che lo stantuffo sia al segno di 10 microlitri. Applicare il nastro biadesivo da banco su un piccolo tubo di plastica conico o rotondo e drappeggiare l'orecchio attraverso il nastro, evitando di rimuovere il cono del naso dell'anestesia.

Mantenendo l'ago della siringa quasi parallelo alla pelle ed evitando vene grandi, inserire la punta dell'ago nello strato più esterno della pelle fino a quando la smussatura è appena coperta e iniettare lentamente l'inoculo per via intradermica. Una buona iniezione intradermica solleverà una piccola bolla nella pelle. Tenere l'ago in posizione per 15-20 secondi prima di rimuoverlo dall'orecchio per ridurre al minimo le perdite.

Seguendo i protocolli istituzionali, contrassegnare la gabbia con etichette di rischio biologico che indicano che gli animali nella gabbia sono infetti da Candida albicans. Utilizzando le stesse colture lavate che sono state utilizzate per preparare l'inoculo, creare una diluizione da 1 a 50 di cellule in RPMI 1640, integrata con il 10% di calore e siero fetale attivo bovino e incubare a 37 gradi Celsius con ruzzolazione per quattro ore. Esaminare il campione utilizzando un microscopio.

Contare almeno 100 cellule, registrando il numero di lieviti e cellule filamentose per ogni ceppo. Ruotare l'obiettivo a lunga distanza di lavoro in posizione e posizionare una goccia di fluido di immersione sull'obiettivo. Abbassare la lente per evitare possibili danni quando si posiziona la slitta del coperchio.

Posizionare la copertina numero 1.5 sopra l'apertura del palco e fissarla in posizione. Sollevare l'obiettivo in modo che il fluido di immersione sia a contatto sia con la lente dell'obiettivo che con la vetrina. Fissare un cono naso per anestesia sul palcoscenico del microscopio in modo tale da coprire completamente il naso dell'animale quando è in posizione per l'imaging.

Posizionare il naso di un topo anestetizzato nel cono del naso. Posizionare una goccia di acqua sterile sul vetrino del coperchio sopra la lente dell'obiettivo. Regolare il cono del naso dell'anestesia e posizionare il mouse in modo tale che l'orecchio del topo sia sopra la goccia d'acqua.

Prendi un'altra linguetta di copertina e posiziona il bordo della copertina parallelamente al corpo del mouse con il bordo che tocca il mouse dove l'orecchio incontra la testa. Utilizzando un movimento a cerniera, abbassare il bordo libero del vetrino del coperchio fino allo stadio del microscopio. Poiché il vetrino di copertura viene contro il palco del microscopio, appiattirà l'orecchio.

Fissare saldamente la linguetta del coperchio superiore per mantenere la pressione sufficiente a mantenere l'orecchio piatto ed evitare di catturare i peli o i baffi del mouse nel nastro. A meno che non venga utilizzato un microscopio con una camera ambientale, coprire liberamente il corpo del topo con un drappo sterile per mantenere un normale ambiente termico. Utilizzando la luce bianca, l'imaging a campo ampio, regolare il piano di messa a fuoco nel tessuto auricolare e concentrarsi sui globuli rossi che si muovono nei vasi sanguigni.

Per ottenere un rapporto segnale/rumore abbastanza forte in modo che la morfologia possa essere determinata per tutte le celle nel campo visivo, regolare la potenza del laser o la velocità di imaging. Per evitare danni ai tessuti, utilizzare la potenza laser più bassa possibile. Scegli un campo visivo con una chiara formazione di filamenti nel ceppo di riferimento e dove la maggior parte degli organismi è abbastanza sparsa da poter determinare la loro morfologia.

Impostate i piani superiore e inferiore di messa a fuoco per uno stack Z. Non è necessario coprire l'intera profondità dell'area infetta, ma tieni presente che gli organismi nella parte superiore o inferiore del volume ripreso sono in genere esclusi dall'analisi. Acquisisci immagini Z-stack, pseudo colora ogni canale per distinguere ogni ceppo e sovrapponi i canali.

Salvare le immagini. Utilizzare il software di imaging per eseguire la massima proiezione dello stack Z in un'immagine bidimensionale. Contare ogni organismo visto nelle immagini di proiezione massima per tipo di ceppo e morfologia.

Il ceppo di riferimento forma rapidamente filamenti in vitro. Mentre l'EFG1 Null non è riuscito a formare i filamenti. L'EFG1 Null presenta un difetto di filamento significativo anche in vivo.

Circa il 9% delle cellule EFG1 Null è cresciuto come filamenti in vivo. Allo stesso modo, il ceppo mutante CYR1 Null ha mostrato un difetto di filamento in vitro rispetto al ceppo di riferimento. Al contrario, il 53% delle cellule mutanti CYR1 Null è cresciuto come filamenti in vivo.

I filamenti formati dal mutante CYR1 Null erano più corti del ceppo di riferimento. È fondamentale mantenere l'ago parallelo alla pelle durante l'inoculazione. L'obiettivo è posizionare l'inoculo appena sotto lo strato esterno della pelle.

Questa tecnica può essere utilizzata anche con ceppi murini che esprimono una proteina fluorescente nelle cellule ospiti di interesse permettendoci di studiare in vivo le interazioni dei patogeni dell'ospite.