Legatura parziale del nervo sciatico: un modello murino di dolore neuropatico cronico per studiare l'effetto antinocicettivo di nuove terapie

Poiché una pletora di terapie innovative sono ora in fase di studio per il trattamento del dolore cronico, il nostro protocollo fornisce concetti cruciali per la standardizzazione degli interventi chirurgici necessari per indurre dolore neuropatico. La legatura parziale del nervo sciatico, o PSNL, è un modello vantaggioso per studiare il dolore neuropatico in quanto riproduce molti sintomi osservati negli esseri umani con dolore neuropatico. Poiché PSNL riproduce molti sintomi osservati negli esseri umani con dolore neuropatico, questo protocollo fornisce concetti cruciali per studiare e sviluppare nuove terapie di gestione del dolore.

A dimostrare la procedura sarà Kevin Cheng, un dottorando MD nel mio laboratorio. Per iniziare, abituare i topi all'apparecchiatura di prova Von Frey per un'ora prima del test mettendoli in scatole di plexiglass trasparente su una rete metallica nella stessa stanza della sala prove. Applicare una serie di monofilamenti sottili calibrati perpendicolarmente alla superficie della fioriera della zampa posteriore omolaterale PSNL degli animali tenuti in gabbie di rete metallica sospese.

Determinare la soglia di prelievo aumentando o diminuendo sequenzialmente la forza dello stimolo corrispondente alla dimensione del filamento. Aumentare la dimensione del filamento quando la risposta è negativa e diminuire la dimensione del filamento quando l'animale ritira la zampa. Riportare le risposte negative e positive nella scheda tecnica e testare la stessa zampa quattro volte con filamenti diversi dopo la prima risposta positiva.

Abituare i topi all'apparecchiatura di prova Hargreaves per un'ora prima del test mettendoli in scatole di plexiglass trasparente nella stessa stanza della sala prove. Stabilire le latenze di prelievo della zampa basale utilizzando l'apparato di Hargreaves. Focalizzare una fonte di calore radiante sulla superficie della fioriera della zampa posteriore omolaterale al PSNL e avviare la stimolazione.

Quando l'animale ritira la zampa, attendi che un rilevatore di movimento fermi lo stimolo e fermi il timer. Regolare l'intensità della fonte di calore per ottenere una latenza di prelievo della zampa di circa 10 secondi. Quindi, registra il tempo di prelievo in una tabella.

Impostare la piastra riscaldante a 52 gradi Celsius. Posizionare l'animale nella camera di prova e avviare un cronometro. Osservare i comportamenti nocifensivi e fermare il cronometro non appena si osserva un comportamento nocifensivo.

Quindi rimuovere l'animale dalla camera e registrare la latenza a questo comportamento. Assicurati di pulire l'apparato di qualsiasi urina tra ogni animale testato per evitare di influenzare la temperatura dello stimolo termico. Pulire la camera di prova con etanolo al 70% tra gli animali per ridurre l'impatto comportamentale degli odori.

Per fare un gancio di vetro nervoso, accendi il bruciatore bunsen. Tenere un'estremità dell'asta di vetro al fuoco in una mano. Mentre questa bacchetta di vetro si scioglie, usa un'altra bacchetta di vetro nell'altra mano per guidare e tirare il vetro di fusione sulla prima asta.

Rimuovere la prima bacchetta di vetro dal fuoco e lasciare che l'estremità della parte fusa rotoli naturalmente verso l'interno per formare una piccola forma a sfera usando la seconda asta di vetro. Pizzicare le dita dei piedi su una zampa posteriore con una pinzetta per garantire l'assenza di riflesso della zampa e controllare il riflesso del battito delle palpebre corneale prima di applicare un unguento oftalmico lubrificante. Dopo aver scelto su quale lato eseguire l'intervento chirurgico, modellare la zampa posteriore dell'animale attorno alla regione della coscia, inferiormente verso la rotula, superiormente verso l'anca e sopra il femore.

Quindi, pulire tre volte con clorexidina in una direzione con tre garze separate alternate a soluzione salina sterile calda. Quindi far scivolare la gamba attraverso una fessura fatta in un drappo sterile di 10 per 10 centimetri per creare un campo sterile attorno alla gamba scelta. Usando sottili forbici chirurgiche fare un piccolo taglio di due millimetri della pelle nella linea mediana dell'aspetto laterale della coscia.

Far scorrere le forbici sotto la pelle con un movimento circolare per sfondare la fascia e creare uno spazio, allargando lo spazio dell'incisione. Successivamente, usando una pinza per legare crea un'incisione profonda un centimetro in verticale con un angolo di 90 gradi nei muscoli della coscia. Quindi inserire le piccole forbici sottili nella stessa incisione anche con un angolo di 90 gradi e aprirle delicatamente per separare i muscoli fino a visualizzare il nervo sciatico.

Individuare il nervo sciatico che corre parallelo alla coscia verticale nella direzione dell'anca al ginocchio. Rimuovere le forbici nella pinza di legatura dal corpo prima di procedere. Utilizzare la pinza extra fine nel gancio di vetro del nervo per isolare il nervo da sotto.

Liberare con cura i nervi dai tessuti connettivi circostanti in un sito vicino al trocantere del femore che è più vicino all'anca e più lontano dal ginocchio. Lasciare che il nervo si appoggi sull'asta di vetro e assicurarsi che l'estremità dell'asta impedisca al nervo di rotolare. Posizionare un nodo chirurgico per legare un terzo della larghezza del nervo sciatico usando una sutura di nylon nove zero prima di dividersi nei rami nervosi peroneali, tibiali e surali comuni.

Far scivolare con attenzione il nervo dall'asta di vetro una volta completato il nodo e rimetterlo nella posizione originale al livello sotto i muscoli separati. Successivamente, suturare l'incisione muscolare utilizzando una sutura poliglicolica cinque zero assorbibile. Separatamente, suturare la pelle utilizzando una sutura in polipropilene sei zero non assorbibile.

Quindi registrare l'intervento chirurgico e il tempo di arresto dell'anestesia. Consentire al topo di svegliarsi da solo in una gabbia di recupero prima di riportarlo in una nuova gabbia pulita. Utilizzare il test di Von Frey, Hargreaves o hot plate per valutare sia l'ipersensibilità termica che meccanica e la sua potenziale inversione.

I topi sottoposti a chirurgia PSNL hanno dimostrato soglie più basse agli stimoli meccanici rispetto agli animali fittizi per 28 giorni. Risultati simili sono stati ottenuti con la valutazione dell'ipersensibilità termica. Le latenze di astinenza della zampa dopo l'esposizione allo stimolo del calore radiante sono aumentate negli animali PSNL e le latenze di astinenza quando gli animali sono stati posti su una piastra di 52 gradi Celsius.

I gruppi iniettati con due diverse dosi di morfina hanno mostrato un'inversione di ipersensibilità che è durata da una a due ore. L'ipersensibilità meccanica è tornata al basale quattro ore dopo l'iniezione di morfina. Quando due diverse dosi di ibuprofene sono state somministrate per via intraperitoneale ai topi, i risultati hanno dimostrato una diminuzione dell'ipersensibilità meccanica rispetto ai topi iniettati in soluzione salina.

Limitare ulteriori danni al nervo è essenziale in quanto può influenzare le soglie sensoriali del dolore. Lo sperimentatore dovrebbe prestare particolare attenzione e utilizzare il gancio di vetro per ridurre i danni involontari Seguendo questa procedura, questo modello di dolore neuropatico cronico può essere utilizzato per identificare e caratterizzare l'effetto antinocicettivo dei farmaci che portano allo sviluppo di nuove terapie di gestione del dolore.