Un modello di Disturbed flusso indotta aterosclerosi carotidea in Arteria mouse da legatura parziale e un semplice metodo di isolamento dell'RNA da Endotelio carotidea

Questo video mostra un intervento chirurgico di legatura carotidea parziale in cui l'arteria carotide esterna, l'arteria carotide interna e l'arteria occipitale vengono legate in un topo anestetizzato per indurre condizioni di flusso disturbate e conseguente rapido sviluppo di aterosclerosi. Il successo dell'intervento viene verificato mediante ecografia, quindi vengono prelevate carotidi legate e controllate dal topo eutanasia e si ottiene RNA endoteliale di elevata purezza. Ciao, mi chiamo Doug Na, del laboratorio dell'onorevole Jo presso l'Ingegneria Biomedica e la Divisione di Cardiologia della Georgia Tech e della Emory University.

Ciao, mi chiamo Amir Revan. Sempre dal JO Lab. Dimostrerò la verifica ecografica della legatura e sono CHI anche dal laboratorio della mascella.

Dimostrerò la preparazione interna dell'RNA oggi. Ti mostreremo una procedura per la legatura carotidea parziale, l'ecografia, la verifica della legatura e un metodo per l'isolamento intimo dell'RNA. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli effetti dello stress puro sull'aterosclerosi.

Quindi iniziamo. Prima di iniziare questa procedura, verificare la profondità dell'anestesia indotta da ketamina e xilazina. In un topo di otto settimane con un pizzico di dita, posizionare il topo su un palco chirurgico nella posizione della linea inferiore, fissare le quattro zampe al palco, con i palmi rivolti verso l'alto.

Quindi fissare le zampe posteriori, le piante dei piedi verso il basso. Usa una garza come cuscino per il collo del topo. Quindi, applicare una quantità generosa di agente depilatorio sul collo dell'animale tra la mandibola e lo sterno.

Massaggiare delicatamente l'area fino a rimuovere tutti i peli. Utilizzando un applicatore di cotone, pulire l'agente depilatorio. Quindi applicare una quantità generosa di Betadine utilizzando un piccolo paio di forbici affilate.

Praticare un'incisione verticale da quattro a sei millimetri al centro del collo dell'animale, tagliando sia la pelle che la fascia sottostante. Usando una pinza da dissezione, sposta delicatamente la ghiandola carotide sinistra dalla linea mediana alla sinistra dell'animale. Senza mezzi termini, sezionare il tessuto usando una pinza da dissezione.

Per rivelare la carotide comune pulsante. Segui la carotide comune in modo coccoloso. Per localizzare la biforcazione.

Sezionare attentamente la biforcazione per esporre quanto segue. Quattro rami distali dell'arteria carotide comune sinistra, dell'arteria carotide esterna, dell'arteria carotide interna, dell'arteria occipitale e dell'arteria tiroidea superiore. Questi vasi, in particolare la tiroide superiore, possono essere molto fragili.

Passa una serie di pinze sotto la carotide esterna sopra la tiroide superiore e afferra un pezzo di sutura di seta lungo un pollice da un altro paio di pinze. Tirare delicatamente la sutura per farla passare sotto l'arteria. Legare saldamente la carotide esterna evitando il tessuto circostante.

Usando la stessa tecnica, legare le arterie carotide interna e occipitale con un solo nodo. Dopo aver verificato la posizione delle suture e la pervietà dell'arteria tiroidea superiore mediante ispezione visiva, spostare indietro la ghiandola parotide, approssimare la pelle e utilizzare uomini di tessuto per chiudere la pelle. Dopo la procedura chirurgica, posizionare il topo in una camera di riscaldamento fino a quando non si riprende.

In genere da 30 a 60 minuti. I topi possono quindi essere spostati nella loro normale area di stabulazione. Metti del cibo sul fondo della gabbia poiché i topi potrebbero sentirsi a disagio nel raggiungere il cibo durante il primo giorno.

Una singola dose di buprenorfina deve essere somministrata il giorno successivo per alleviare il dolore. Un giorno dopo la legatura. Preparare l'animale anestetizzato isof fluoro per l'ecografia posizionandolo sul tavolino di imaging con la pancia rivolta verso l'alto.

Fissare le braccia e le gambe al sensore ECG. Applicare il gel eco sul collo dell'animale. La temperatura corporea dell'animale deve essere monitorata durante tutta la procedura.

Accendere il computer e il software di imaging. Selezionare l'utente e la sonda eco appropriati. Imposta l'ecografia sulla modalità ape.

Quindi, con la manopola della sonda rivolta verso il naso del mouse, abbassare la sonda sul collo del mouse fino a ottenere un'immagine. Manipolare il tavolino della sonda a destra e a sinistra fino a quando la trachea può essere identificata. Quindi trova l'arteria carotide comune sinistra e inclina il tavolino di imaging in modo da creare un angolo tra il piano di imaging e la carotide.

Passare l'ecografia dalla modalità B al doppler a onde pulsate mantenendo la sonda al centro della carotide comune sinistra. Utilizzare la manopola di correzione dell'angolo per regolare l'angolo in modo che la linea di correzione dell'angolo sia parallela all'arteria carotide comune. Scatta un'immagine premendo il pulsante di memorizzazione delle cornici.

Verrà documentato il profilo di velocità del sangue nella carotide comune. Ci si aspetta un'inversione del profilo di velocità durante la diastole. Ripetere i passaggi successivi sulla carotide comune destra per il confronto.

La velocità sarà più alta e non si vedrà alcuna inversione nella carotide comune destra. Una volta ottenute immagini soddisfacenti, spegnere l'anestesia e rimuovere il gel eco dal mouse. Libera il mouse dai vincoli del nastro.

Metti l'animale in una camera di recupero riscaldata. Il recupero dal fluoro inalato di solito avviene in meno di cinque minuti. Fissa la pausa di un topo soppresso con anidride carbonica su un tovagliolo di carta usando le forbici.

Taglia la pelle del topo dall'addome alla parte superiore del torace. Quindi, utilizzando un paio di forbici affilate, aprire la parete addominale sotto la gabbia toracica utilizzando una pinza. Sollevare lo sterno e tagliare il diaframma.

Taglia via la gabbia toracica per esporre il cuore. Quindi tagliare la vena di CVA, utilizzando un kit di perfusione a farfalla, perfondere a pressione per due o tre minuti con soluzione fisiologica normale contenente 10 unità per millilitro di eparina attraverso il ventricolo sinistro fino a quando i polmoni e il fegato diventano pallidi. Dopo la perfusione salina, tagliare la pelle del collo e rimuovere tutti i muscoli adiposi e i tessuti connettivi fino a quando le arterie carotidi non sono esposte.

Ora posiziona il topo sotto un microscopio da dissezione utilizzando un foro puntuale con ago calibro 29 proprio sotto i siti di legatura nella carotide sinistra per la seconda perfusione. La pressione perfusione di nuovo per circa un minuto attraverso il ventricolo sinistro, assicurandosi che la carotide sinistra sia ben perfusa dopo la seconda perfusione. Usa una pinza a punta sottile e piccole forbici a molla per rimuovere con cura i tessuti peri advent che circondano le carotidi.

Fare attenzione a non schiacciare o allungare le carotidi durante questa fase di pulizia ora tra l'arco aortico e i punti di legatura sopra la biforcazione carotidea. Tagliare l'arteria carotide sinistra, quindi tra la succlavia destra e il punto di ramificazione dell'arteria e la biforcazione carotidea. Tagliare l'arteria carotide destra.

Trasferire le carotidi in una piastra di coltura da 35 millimetri contenente HBSS ghiacciato. Rimuovere con cautela il tessuto peri avventiziale residuo. Inserire una siringa da insulina con un ago calibro 29 in un'estremità di una carotide e afferrare la carotide e la punta dell'ago con una pinza.

Rapidamente e con attenzione. Lavare ogni carotide con 150 microlitri di tampone di lisi cazo, raccogliendo il tampone in una provetta da 1,5 millilitri etichettata intima eit. Infine, sciacquare ogni carotide una volta in HBSS.

Quindi posizionarlo in un tubo micro fuge da 1,5 millilitri etichettato con supporto più avventizia e scattare. Congelalo in azoto liquido. L'RNA può quindi essere estratto dai campioni congelati utilizzando i gin.

Mini kit Micro RZ. L'esame ecografico di un topo è stato effettuato un giorno dopo la legatura parziale dell'arteria carotide sinistra Come mostrato in questa figura, la legatura parziale riuscita riduce la velocità del flusso sanguigno e inverte il flusso nell'arteria carotide comune sinistra durante la diastole la legatura parziale di topi knockout per APOE con una dieta ricca di grassi induce una robusta aterosclerosi nell'arteria carotide comune sinistra, ma non nella carotide destra controlaterale di due settimane. L'aterosclerosi viene mostrata utilizzando la colorazione rosso olio o per i lipidi e la colorazione di contrasto dell'emato-toina per i nuclei.

L'RNA raccolto dall'intima carotide contiene geni marcatori endoteliali come pcam un marcatore di cellule muscolari lisce mediali. Geni come l'alfa SMA sono assenti nell'RNA raccolto dal resto dell'arteria marcato m più A per la media più avventizia, è presente il marcatore della muscolatura liscia mentre il marcatore endoteliale è assente. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire una legatura carotidea parziale.

Utilizzare gli ultrasuoni per verificare la legatura e anche un metodo per l'isolamento dell'RNA intimale Quando si esegue questa procedura è essenziale identificare correttamente i rami dell'arteria comune corretta e assicurarsi che il modello di rimandata dell'arteria tiroidea superiore mentre altri rami sono strettamente legati. E' importante verificare il risultato della legatura mediante ecografia durante, in una semplice preparazione, prestare attenzione affinché l'iLet arrossato non venga a contatto con nessun'altra parte dell'arteria se non con il lume. Detto questo, grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.