Imaging a singola molecola della mobilità laterale e dell'attività dei canali ionici in doppi strati lipidici mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

I canali ionici non sono statici nelle membrane biologiche. Qui presentiamo un approccio ottico a singola molecola per svelare il legame tra diffusione laterale della membrana e funzione del canale ionico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi è che non è richiesta la marcatura fluorescente delle proteine che potrebbero interferire con il loro movimento laterale e la loro funzione.

Il metodo può essere applicato a qualsiasi canale proteico di membrana in cui la diffusione libera o limitata è importante per l'organizzazione e la funzione. Per iniziare, trasferire 380 microlitri della soluzione madre DPhPC in una fiala di vetro e sovrapporre la soluzione madre lipidica con argon o azoto gassoso per prevenire l'ossidazione dei lipidi. Utilizzare il flusso di gas più basso possibile per evitare l'evaporazione del solvente organico in cui i lipidi sono sciolti o gli spruzzi degli spray di solvente dal flaconcino.

Asciugare il campione lipidico sotto un flusso di azoto e rimuovere il solvente organico rimanente dal campione lipidico sotto vuoto utilizzando una pompa per vuoto oil-free durante la notte. Sciogliere il film lipidico in una soluzione di olio di silicone esadecano aggiungendo volumi uguali di esadecano e olio di silicone utilizzando una pipetta da un millilitro per una concentrazione lipidica finale di 9,5 milligrammi per millilitro. Posizionare alcuni coprivetrini in un portavetrini in acciaio inossidabile e pulirli in un becher di vetro per circa 10 minuti con acetone in un pulitore ad ultrasuoni.

Risciacquare i coprivetrini con acqua doppia deionizzata e asciugarli sotto un getto di azoto. Inoltre, pulire e idrofilizzare un coprivetrino in un detergente al plasma con ossigeno per cinque minuti. Montare un coprislip trattato al plasma su uno spin coater e rivestire il coprislip con un film di agarosio spesso sub-micrometro aggiungendo lentamente 140 microlitri di agarosio riscaldato a 0,75% a basso punto di fusione con una pipetta da 200 microlitri a 3.000 RPM per 30 secondi.

Attaccare immediatamente il coprislip rivestito di spin con lo strato sottile dell'idrogel di agarosio sul lato inferiore della camera PMMA. Assicurarsi che l'idrogel di agarosio punti verso l'alto. Fissare i bordi del coprislip al dispositivo microlavorato in PMMA con nastro adesivo trasparente e posizionare il dispositivo su una piastra riscaldata a 35 gradi Celsius.

Versare con cura 200 microlitri di soluzione di agarosio al 2,5% nell'ingresso della camera senza creare bolle d'aria. Coprire immediatamente i pozzetti della camera PMMA con circa 60 microlitri di soluzione di olio lipidico per avviare la formazione di monostrato lipidico all'interfaccia dell'olio di agarosio per evitare la disidratazione dell'agarosio rivestito di spin nei pozzetti della camera PMMA. Posizionare il dispositivo su una piastra riscaldante a 35 gradi Celsius per circa due ore.

Posizionare circa 20 microlitri di soluzione lipidica di olio di silicone esadecano in ciascuno dei numerosi pozzetti microfabbricati in una camera di incubazione delle goccioline. Preparare un ago di vetro microcapillare con un diametro di apertura della punta di circa 20 micrometri utilizzando un estrattore di micropipette verticale o orizzontale. Riempire l'ago con circa cinque microlitri di soluzione acquosa per iniezione contenente 8,8 millimolari HEPES, sette micromolari di un colorante fluorescente, Fluo-8, 400 micromolari EDTA, 1,32 molari di cloruro di potassio e 30 nanomolari TOM core complex o in alternativa 20 nanomolari OMPF.

Montare l'ago con la soluzione di iniezione acquosa su un nanoiniettore piezoelettrico e iniettare da 100 a 200 nanolitri di goccioline acquose nei pozzetti nella camera di incubazione delle goccioline riempita con soluzione di olio di silicone lipidico esadecano utilizzando il nanoiniettore. Consentire la formazione di un monostrato lipidico all'interfaccia dell'olio di goccioline per circa due ore mantenendo le camere di incubazione del PMMA e delle goccioline su una piastra riscaldata a 35 gradi Celsius. Trasferire manualmente le singole goccioline acquose dai pozzetti della camera di incubazione delle goccioline nei pozzetti della camera PMMA utilizzando una pipetta microlitro a canale singolo con una punta in polipropilene monouso da 10 microlitri.

Lasciare che le goccioline affondino sui monostrati lipidici alle interfacce idrogel-olio per formare un doppio strato lipidico tra le goccioline e l'idrogel di agarosio. Montare la camera PMMA con le membrane a doppio strato o DIB con interfaccia a goccia sul supporto del campione di un microscopio a luce invertita e valutare la formazione della membrana utilizzando un obiettivo di contrasto di modulazione Hoffman 10x. Se si sono formate membrane DIB, montare la camera PMMA sul supporto del campione di un microscopio TIRF dotato di una sorgente luminosa convenzionale per l'illuminazione dell'epifluorescenza, un laser a 488 nanometri e una telecamera CCD retroilluminata con moltiplicazione elettronica per ottenere una dimensione dei pixel di circa 0,16 micrometri.

Focalizzare il bordo di una membrana DIB con un obiettivo di ingrandimento 10x sotto l'illuminazione a epifluorescenza con una sorgente luminosa ad alta intensità utilizzando un set di filtri GFP. Messa a fuoco fine dello stesso bordo della membrana DIB ad alto ingrandimento con un obiettivo TIRF di olio apocromatico 100x NA 1.49, sempre sotto illuminazione ad epifluorescenza con una sorgente luminosa ad alta intensità utilizzando un set di filtri GFP. Modificare l'impostazione del filtro da GFP al set di filtri TIRF quad band, accendere il laser a 488 nanometri e impostare l'intensità del laser sull'obiettivo.

Per visualizzare singoli canali ionici, regolare l'angolo TIRF e il guadagno della telecamera CCD EM in modo che i canali ionici aperti nella membrana DIB appaiano come punti fluorescenti ad alto contrasto su uno sfondo scuro e il rapporto segnale/sfondo raggiunga il massimo. Assicurarsi che i punti corrispondenti al flusso di ioni calcio attraverso singoli canali ionici rimangano a fuoco e abbiano una forma rotonda con alta intensità al centro e gradualmente decrescente verso la periferia. Controllare che i punti fluorescenti siano a fuoco per assicurarsi che i canali ionici si siano ricostituiti nelle membrane DIB e si muovano lateralmente nel piano della membrana.

Infine, registrare una serie di immagini a membrana che consentono il corretto tracciamento della posizione e il monitoraggio dello stato aperto-chiuso dei singoli canali ionici. Per determinare il tipo di mobilità laterale e lo stato dell'attività del canale, acquisire traiettorie sufficientemente lunghe e ben campionate. La struttura criogenica EM di Neurospora crassa TOM-CC è mostrata qui.

I mitocondri di una colorazione di N.crassa contenente un TOM 22 con un tag 6-His sono stati solubilizzati in DDM e sottoposti a cromatografia di affinità NTA di nichel e cromatografia a scambio anionico. SDS-PAGE della struttura cristallina TOM-CC isolata e SDS-PAGE dell'OMPF purificato di E.coli utilizzato per il confronto sono mostrati qui. La traccia di ampiezza fluorescente nella traiettoria corrispondente di TOM-CC indica che l'attività del canale aperto-chiuso di TOM-CC è correlata con la mobilità laterale della membrana del complesso.

La traccia di ampiezza visualizza tre stati di permeabilità: stato completamente aperto corrispondente ai canali in movimento, stato di permeabilità intermedio e stato del canale chiuso corrispondente ai canali non mobili. TOM-CC nello stato intermedio oscilla intorno alla sua posizione media di circa più / meno 60 nanometri. La traccia di ampiezza fluorescente nella traiettoria corrispondente di OMPF è mostrata qui.

OMPF rivela solo un livello di intensità rispetto a TOM-CC, indipendentemente dal fatto che sia in movimento o intrappolato. I segmenti di traiettoria corrispondenti ai periodi di tempo delle molecole intrappolate sono contrassegnati in grigio. Una cosa importante da notare è che questo metodo analizza le proteine di singola membrana in un ambiente di membrana intatto.

La dinamica delle proteine di membrana rimarrà un orizzonte per gli studi scientifici nel prossimo futuro. Ci aspettiamo che il nostro metodo contribuisca in modo significativo a questo campo.