Identificazione standardizzata della struttura del composto nella medicina tibetana mediante spettrometria di massa con trappola ionica e analisi di frammentazione a più stadi

Qui, descriviamo un protocollo generale e un disegno che potrebbe essere applicato per identificare tracce e costituenti minori nelle complesse formulazioni di prodotti naturali (matrici) nella medicina tibetana.

Questo metodo può aiutare i ricercatori ad analizzare le strutture dei composti della medicina tibetana, in particolare i componenti dell'albero. Può fornire informazioni sullo studio qualitativo del contenuto del composto nella medicina naturale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'accuratezza della struttura composta ottenuta in questo caso è superiore a quella del database.

Questa tecnica può essere utilizzata nell'analisi della struttura degli intermedi metabolici nella vescica o nelle urine. Per iniziare, la preparazione del campione di semi della medicina tibetana Abelmoschus manihot. Pesare accuratamente un grammo di AMS e metterlo in un matraccio conico contenente 30 millilitri di metanolo all'80%.

Utilizzando un sonicatore a bagno ad ultrasuoni a 40 kilohertz, eseguire l'estrazione sulla miscela per 30 minuti a 25 gradi Celsius. Quindi, centrifugare il campione a 14.000 g per cinque minuti. Preparare una siringa per iniezione e un filtro organico a membrana microporosa da 0,22 micron e filtrare il surnatante in un flacone campione da due millilitri.

Dopo aver acceso l'interruttore della pompa per vuoto, aprire la valvola principale del cilindro di argon insieme alla valvola a pressione parziale e regolare la pressione a circa 0,3 megapascal. Quindi, aprire la valvola dell'azoto. Avviare il software di controllo della spettrometria di massa, o MS.

Fare clic su Heated ESI Source nel pannello del software e impostare i parametri MS, tra cui temperatura del riscaldatore, portate del gas, tensione di spruzzatura per le modalità positiva e negativa e temperatura capillare. Fare clic sul pulsante Applica per attivare la sorgente di ioni per cromatografia liquida o LC.Preparare le fasi mobili A e B utilizzando acido formico allo 0,1% in una soluzione acquosa in acetonitrile puro rispettivamente. Degasarli in un sonicatore a bagno ad ultrasuoni a 40 kilohertz per almeno 15 minuti prima di collegare le soluzioni rispettivamente ai passaggi del fluido A e B.

Preparare una soluzione di acqua di metanolo 1:9 volume per volume, quindi riempirla manualmente nelle bottiglie di liquido di pulizia della pompa e dell'iniettore. Dopo aver avviato il software di controllo LC-MS, fare clic su Controllo diretto per aprire il pannello di controllo LC. Aprire la valvola di spurgo in senso antiorario sul modulo pompa.

Fare clic su Altra opzione per aprire l'impostazione della pompa e impostare i parametri di spurgo a cinque millilitri al minuto per tre minuti. Fare clic su Svuota per avviare la rimozione della bolla. Una volta fatto, chiudere la valvola di spurgo.

Quindi, fare clic su Prime Syringe per sciacquare la siringa per tre cicli, Wash Buffer Loop per risciacquare il ciclo per un ciclo e Wash Needle Externally per lavare l'ago per un ciclo. Posizionare il flacone del campione nel campionatore. Fare clic su Instrument Setup (Configurazione strumento) per aprire la finestra Method Editing (Impostazione metodo) per aprire la finestra di modifica del metodo e fare clic su Nuovo per creare un nuovo metodo dello strumento LC-MS.

Stabilire un runtime totale per il metodo e impostare il limite di pressione. Portata totale, gradiente di flusso, temperatura del campione, temperatura della colonna e delta della temperatura pronta nella finestra di modifica del metodo. Per il metodo MS, selezionare il tipo di esperimento MS o MSn generale.

Immettete i valori del tempo di acquisizione, della polarità, dell'intervallo di massa, del numero del valore di deviazione e della durata. Fare clic su Salva per configurare le impostazioni come metodo dello strumento. Fare clic su Sequence Setup (Impostazione sequenza) per aprire la tabella delle sequenze, in cui immettere le informazioni sul tipo di campione, il file, il nome, il percorso, l'ID del campione, il metodo dello strumento, la posizione e il volume di iniezione.

Registrare la tabella delle sequenze facendo clic su Salva, quindi implementare le impostazioni e avviare l'acquisizione MS. Per caricare i dati MS nel software di elaborazione dati, fare doppio clic sul file raw in Explorer. Nel cromatogramma di picco di base BPI, selezionare l'area massima sotto la curva o l'AUC facendo clic e trascinando il mouse.

Lo spettro MS corrispondente verrà visualizzato nella stessa finestra. Selezionare uno ione di destinazione per la successiva analisi MS/MS. Riaprire la finestra di modifica dei metodi e nella tabella delle impostazioni MSN impostare m/z dello ione di destinazione su una cifra decimale nella colonna Massa padre.

Quindi, selezionare la modalità di collisione e immettere l'energia di collisione o il valore CE. Impostare l'intervallo di scansione MS/MS. Fare clic su Salva per registrare il metodo MS e inserire un nuovo nome file nella tabella delle sequenze.

Fare clic sul pulsante Start per avviare l'acquisizione MS/MS. Una volta completata l'acquisizione, fare doppio clic sul file raw in Explorer per caricare il file raw MS/MS nel software di elaborazione dati. Identificare lo ione frammento più forte nello spettro e inserire il suo valore m/z nell'elenco dei metodi MSn.

Nella tabella delle impostazioni MSn, impostare i parametri MS3, inclusi la modalità di collisione, il valore CE e l'intervallo di scansione. Ancora una volta, fare clic su Salva per registrare il metodo MS e immettere un nuovo nome di file nella tabella di sequenza. Fare clic su Avvia per avviare l'acquisizione MS3.

Come illustrato in precedenza, fare doppio clic sul file raw in Esplora risorse per caricare il file raw MS3 nel software di elaborazione dati e ripetere i passaggi per ottenere lo spettro MS4. Per analizzare i dati, fare doppio clic sui file raw per aprire tutti gli spettri di massa da MS a MSn. Calcolare manualmente i valori di differenza m/z tra lo ione e gli ioni frammento corrispondenti.

Quindi, disegnare manualmente la struttura del nucleo in base ai risultati MS4 e derivare la struttura originale utilizzando gruppi funzionali o segmenti molecolari basati sul valore di differenza m / z. Disegnare manualmente i percorsi di scissione molecolare in base a ciascuna struttura molecolare in MSn. L'ESI-MS del cellobiosio modello di carboidrati ha prodotto la molecola proteinata M H a m/z 365 in modalità positiva.

La scansione ionica del prodotto, o CID MS/MS ha provocato un secondo frammento di ione a m/z 305. Inoltre, l'analisi MS3 e MS4 ha portato sequenzialmente al terzo e quarto frammento di ioni rispettivamente a m/z 254 e m/z 185. L'analisi MS / MS ha rivelato la sequenza di frammentazioni ioniche, vale a dire idrolisi ad apertura dell'anello, scissione CC e disidratazione.

Quindi, questo metodo è stato trovato adatto per i carboidrati. L'analisi qualitativa preliminare dell'AMS utilizzando LC Q-TOF MS ha rivelato la presenza di numerosi composti sconosciuti. L'analisi MSn negativa dello ione M H a m/z 617 ha prodotto un secondo frammento di ione a m/z 571.

L'analisi MS3 di questo ione frammento ha prodotto un terzo ione frammento a m/z 525 dalla perdita di idrossietile come metanolo corrispondente a 32 dalton e idrossile come acqua, che è 18 dalton. L'analisi MS4 ha prodotto quarti ioni frammento a m/z 344 e 273. L'identificazione manuale della struttura centrale ha rivelato la struttura molecolare del composto in m/z 617 e i suoi percorsi di scissione in MSn.

È stata eseguita la scansione ionica del prodotto dello ione M H di un altro composto sconosciuto e sono stati rivelati anche la sua struttura molecolare e il meccanismo di scissione. Dopo aver acceso la pompa per vuoto, attendere almeno cinque ore per garantire un grado di vuoto sufficiente per le condizioni sperimentali. L'analisi statistica può essere utilizzata per raccogliere i frammenti con lo stesso o simile rapporto massa-carica.

Con l'aumento della soluzione di spettrometria di massa, questa tecnica potrebbe aiutare i ricercatori a ottenere nuovi composti nelle medicine naturali.