Measuring Embryonic Viability and Brood Size in <em>Caenorhabditis elegans</em>

Ji Kent Kwah; Aimee Jaramillo-Lambert

doi:10.3791/65064

Misurazione della vitalità embrionale e delle dimensioni della covata in Caenorhabditis elega...

JoVE Journal
Genetics

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Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Misurazione della vitalità embrionale e delle dimensioni della covata in Caenorhabditis elegans

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February 24, 2023

DOI: 10.3791/65064-v

Ji Kent Kwah¹, Aimee Jaramillo-Lambert¹

¹Department of Biological Sciences,University of Delaware

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a method for determining embryonic viability and brood size in the model organism C. elegans. The protocol is designed for novice researchers and provides clear instructions for assessing developmental processes.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Developmental Biology
Genetics

Background

Brood size and embryonic viability are critical indicators of developmental health.
Defects in these areas can signal issues in myosis, fertilization, and embryogenesis.
Understanding these processes is essential for genetic studies in C. elegans.
Identification of embryos versus unfertilized eggs is a key challenge for researchers.

Purpose of Study

To provide a standardized method for measuring brood size and embryonic viability.
To assist novice researchers in conducting experiments with C. elegans.
To facilitate the identification of genetic factors affecting development.

Methods Used

Transfer of individual L4 stage hermaphrodites to culture plates.
Scoring of embryos and larvae at specified intervals.
Use of differential cell counters for accurate counting.
Recording observations in laboratory notebooks for data accuracy.

Main Results

The viability percentage for the N2 strain was 98.9%.
Strains him-5(e1490) and spo-11(ok79) showed reduced viability at 74.9% and 0.8%, respectively.
The average brood sizes were 217 for N2, 105 for him-5(e1490), and 219 for spo-11(ok79).
Familiarity with C. elegans developmental stages is crucial for accurate data collection.

Conclusions

This method is a valuable first step in genetic studies related to development.
Clear identification of developmental stages enhances data reliability.
Further cytological analyses can follow to explore disrupted processes.

Frequently Asked Questions

What is the significance of brood size in C. elegans?

Brood size is an important indicator of reproductive success and developmental health in C. elegans.

How can I identify embryos versus unfertilized eggs?

Practice is essential; familiarize yourself with the different developmental stages using images and a microscope.

What temperature should be maintained during the experiment?

The standard culturing temperature is 20 degrees Celsius.

What tools are recommended for counting larvae and embryos?

A differential cell counter and a gridded plate are recommended for accurate counting.

How do I record my observations?

Observations should be meticulously recorded in a laboratory notebook for data accuracy.

What challenges might I face when conducting this experiment?

Identifying embryos and ensuring proper mating between hermaphrodites and males can be challenging.

Qui, presentiamo un metodo generale per determinare la vitalità embrionale e il numero totale di embrioni prodotti (covata) utilizzando l'organismo modello C. elegans.

Questo protocollo per determinare le dimensioni della covata e la vitalità embrionale è utilizzato da molti laboratori di C.elegans. La diminuzione delle dimensioni brute e della vitalità embrionale può indicare difetti in importanti processi di sviluppo come la miosi, la fecondazione e l'embriogenesi. Questa tecnica fornisce istruzioni chiare per i ricercatori principianti di C.elegans.

È relativamente semplice da configurare ed eseguire ed è un ottimo punto di partenza quando si lavora con nuovi ceppi mutanti. La sfida più grande per questa tecnica è l'identificazione dell'embrione rispetto all'embrione non fecondato. I nuovi ricercatori dovrebbero praticare l'identificazione di embrioni, ovociti e i diversi stadi larvali prima di iniziare questi esperimenti.

Per iniziare, etichettare il retro della piastra, trasferire un singolo ermafrodito allo stadio L4 fino alla piastra. Assicurarsi che nessun embrione o altro verme venga trasferito sulla piastra. Lasciare che i vermi si sviluppino in adulti e deporre la progenie per 24 ore alla temperatura di coltura standard di 20 gradi Celsius.

Segna il piatto il terzo giorno. Il giorno successivo, etichettare un set di nuove piastre e trasferire il singolo verme del giorno sulla nuova piastra. Lasciare che i vermi depongano embrioni per 24 ore a 20 gradi Celsius.

Segna il piatto il quarto giorno. Il terzo giorno, etichettare una serie di nuove piastre e trasferire il giorno due singoli vermi sulla nuova piastra. Lascia che i vermi depongano la progenie per 24 ore a 20 gradi.

Segna il piatto il quinto giorno. Disegna un motivo a griglia su un coperchio di 35 millimetri usando un pennarello fine. Posizionare il coperchio grigliato sotto la piastra di prova per il conteggio per tenere traccia dei vermi precedentemente contati.

Utilizzando un contatore di cellule differenziali, contare le larve vive e gli embrioni non schiusi all'interno del singolo quadrato. Per i vermi sui bordi quadrati contare in base alla posizione della testa del verme. Conta i vermi con le teste che toccano i bordi superiore e sinistro del quadrato.

Registrare il numero di larve vive ed embrioni non nati in un quaderno di laboratorio. Il quarto giorno, segna la piastra del secondo giorno contando le larve vive e gli embrioni non nati e registrandoli in un quaderno di laboratorio. Il quinto giorno, segna la piastra del giorno tre contando le larve vive e gli embrioni non schiusi e registrali in un quaderno di laboratorio.

Dopo aver etichettato il retro della piastra, trasferire un singolo verme ermafrodita L4 sulla piastra. Assicurarsi che nessun embrione o altro verme venga trasferito sulla piastra. Trasferire un singolo verme maschio L4 sulla piastra contenente un L quattro ermafrodito.

Lasciare che i vermi si accoppiano e depongano la prole per 24 ore a 20 gradi Celsius. Segna il piatto per le larve vive rispetto agli embrioni non schiusi il terzo giorno. Il giorno dopo, etichetta una serie di nuove piastre e trasferisci l'ermafrodita e il maschio sulla nuova piastra.

Assicurarsi che l'ermafrodita abbia raggiunto l'età adulta. Permettere agli ermafroditi di deporre la progenie per 24 ore a 20 gradi Celsius. Segna il piatto per le larve vive rispetto agli embrioni non nati il quarto giorno.

Il terzo giorno, etichetta una serie di nuove piastre e trasferisci l'ermafrodita e il maschio sul nuovo piatto. Lascia che i vermi depongano la progenie per 24 ore a 20 gradi. Assegna un punteggio al piatto per gli embrioni vivi rispetto a quelli non schiusi il quinto giorno.

Utilizzando un contatore di cellule differenziali, contare le larve vive e gli embrioni non nati dal piatto del primo giorno e registrarli in un quaderno di laboratorio. Il quarto giorno, conta la progenie viva e gli embrioni non nati dalla piastra del secondo giorno e annotali in un quaderno di laboratorio. Controlla il piatto del giorno uno per i maschi.

Se si è verificato l'accoppiamento, il rapporto genetico atteso tra ermafroditi e maschi è compreso tra 50 e 50. Se il giorno uno piatto non contiene maschi, l'accoppiamento tra il maschio e l'ermafrodito non si è verificato. Scartare questa coppia di accoppiamento e registrare l'osservazione nel quaderno di laboratorio.

Il quinto giorno, conta le larve vive e gli embrioni non schiusi della piastra del giorno tre e annotali in un quaderno di laboratorio. Il test di vitalità embrionale per N2 ha prodotto una percentuale di vitalità del 98,9%, mentre sia him-5 (e1490) che spo-11 (ok79) hanno mostrato una riduzione della vitalità embrionale con una percentuale rispettivamente del 74,9% e dello 0,8%. La dimensione media della covata di N2, him-5 (e1490) e spo-11 (ok79) è stata determinata rispettivamente in 217, 105 e 219.

Il riconoscimento delle varie fasi dello sviluppo di C.elegans è importante per dati accurati e riproducibili. Si consiglia di acquisire familiarità con lo sviluppo di vermi utilizzando immagini e un microscopio da dissezione. Questa procedura è un ottimo primo passo per determinare se un gene è coinvolto in un processo di sviluppo e può essere seguita da analisi citologiche per determinare quale processo viene interrotto.