Name: Anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo da singole molecole per la caratterizzazione della flessibilità locale nelle biomolecole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Scopri l'anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo per caratterizzare la flessibilità locale delle biomolecole a livello di singola molecola. Questo metodo consente di studiare la dinamica proteica con microscopia confocale.

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<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>A20100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100</td></tr><tr><td>Filtro Ultra Centrifugo Amicon, 10 kDa MWCO</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010</td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Millipore Sigma</td><td>A0166-5G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166</td></tr><tr><td>BODIP FL Maleimmide (BODIPY FL N-(2-Amminoetil))Maleimmide)</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>B10250</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250</td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione monouso PD 10</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-0851-01</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Millipore Sigma</td><td>10197777001 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Anidro</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>D12345</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Millipore Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001</td></tr><tr><td>E. coli cellule batteriche C41</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, colonna da 5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>12004037</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Millipore Sigma</td><td>288-32-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513</td></tr> Filtro a membrana <tr><td>IPTG</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6758-1G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758</td></tr><tr><td>MCE, 0,22 &mu; m Dimensione dei pori</td><td>Millipore Sigma</td><td>GSWP02500</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Sistema di scorrimento a camera</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>154534</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534</td></tr><tr><td>OverExpress C41 (DE3) Chimicamente Competent Cells</td><td>Millipore Sigma</td><td>CMC0017-20X40UL</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>329-98-6</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830</td></tr><tr><td>Rhodamine 110</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>419075000</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Millipore Sigma</td><td>7558-79-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264</td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico diidrato</td><td>Millipore Sigma</td><td>13472-35-0</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505</td></tr><tr><td>TCEP, cloridrato, grado reattivo</td><td>Millipore Sigma</td><td>580567-5GM</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>11332465001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001</td></tr></tbody></table>

anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo da singole molecole per la caratterizzazione della flessibilità locale nelle biomolecole

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

L'anisotropia della fluorescenza deriva dall'orientamento relativo dell'assorbimento del fluoroforo e dai momenti di dipolo di emissione. Quando i fluorofori sono esposti alla luce polarizzata, i fluorofori con momenti di transizione di assorbimento allineati con il vettore del campo elettrico della luce incidente sono eccitati preferenzialmente (fotoselezione). Di conseguenza, la popolazione dello stato eccitato diventa parzialmente orientata, con una frazione significativa delle molecole eccitate che hanno i loro momenti di transizione allineati con il vettore del campo elettrico della luce eccitante polarizzata61. I fluorofori ruotano a causa del loro moto browniano. Pertanto, anche il momento di transizione dell'emissione ruota, con conseguente dipendenza dal tempo dall'anisotropia della fluorescenza. Questo effetto può essere utilizzato per misurare i movimenti rotatori delle molecole fluorescenti, rilevare eventi di legame, caratterizzare l'ambiente del fluoroforo e catturare le dinamiche molecolari.
Gli esperimenti su singole molecole sono in grado di determinare l'eterogeneità del campione. Sfruttando la sensibilità di una singola molecola e l'anisotropia della fluorescenza, si aggiunge un'altra dimensionalità alla spettroscopia di fluorescenza multiparametrica. In un tipico microscopio confocale a singola molecola (Figura 2)20,21, l'anisotropia della fluorescenza può essere determinata tramite l'intensità o risolta nel tempo quando si utilizzano laser pulsati.
Per considerare gli effetti depolarizzanti dell'obiettivo ad alta apertura numerica in un microscopio confocale62, la forma corretta dell'anisotropia risolta nel tempo35,63 è data da
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)
dove <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq02.jpg" style="margin: auto;"> e <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq03.jpg" style="margin: auto;"> sono l'intensità di fluorescenza risolta nel tempo nel canale di rivelazione Y-esimo dopo l'eccitazione alla lunghezza d'onda x, per la polarizzazione parallela e perpendicolare L1 e L2 e sono fattori che descrivono la miscelazione tra i segnali paralleli e perpendicolari a causa dell'obiettivo ad alta apertura numerica (NA) utilizzato in queste misure35,62, 64. Le differenze nelle efficienze di rilevamento del canale di rilevamento parallelo, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq04.jpg" style="margin: auto;">e perpendicolare, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq05.jpg" style="margin: auto;">, per il colorante sono corrette con il rapporto delle efficienze di rilevamento, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq06.jpg" style="margin: auto;">. Il GUV è anche indicato come fattore G.
L'anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo può essere modellata utilizzando un decadimento multiesponenziale per tenere conto del fatto che il fluoroforo è legato a una biomolecola più grande come
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq07.jpg" style="margin: auto;">,     (2)
dove r0 è l'anisotropia fondamentale fluoroforo dipendente (tipicamente r0 = 0,38), r∞ è l'anisotropia residua e ρ1 e ρ2 sono rispettivamente tempi di correlazione rotazionale veloci (movimenti locali del fluoroforo) e lenti (moto globale della macromolecola).
Nelle misure di anisotropia di singole molecole (Figura 2), i tempi di arrivo dei fotoni vengono registrati per identificare i singoli emettitori utilizzando l'analisi BIFL (Burst-Integrated Fluorescence Lifetime)33,35. I tempi di arrivo interfotone (Δt) vengono smussati utilizzando una media corrente e quindi tracciati per facilitare la visualizzazione. L'istogramma di questi tempi è dotato di una mezza gaussiana per determinare la media e la deviazione standard dei fotoni provenienti dallo sfondo. Una soglia arbitraria, fissata a multipli della deviazione standard, viene utilizzata per filtrare i singoli eventi e identificare il primo e l'ultimo fotone in ogni lampo. I fotoni all'interno di ogni lampo vengono quindi integrati per ulteriori analisi, che includono il calcolo dell'anisotropia di fluorescenza allo stato stazionario risolta nel tempo e basata sull'intensità utilizzando le equazioni 1 e 2 o tramite uno stimatore di massima verosimiglianza35. A causa del numero limitato di fotoni negli eventi a singola molecola, lo stimatore di massima verosimiglianza considera solo una singola componente esponenziale e non sarà ulteriormente discusso.
In un istogramma bidimensionale di eventi di singole molecole, il tempo medio di fluorescenza (τ) e l'anisotropia (rxy) possono essere correlati dall'equazione di Perrin29,61 per ottenere (ρ) come tempo di rotazione medio.
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq08.jpg" style="margin: auto;">(3)
Valori specifici di ρ possono essere ottenuti con maggiore certezza mediante analisi "sub-ensemble" (se) in cui i fotoni di diversi burst sono integrati in un decadimento combinato di anisotropia di fluorescenza risolto nel tempo che può essere analizzato ottimizzando i parametri dell'equazione 2 al decadimento sperimentale (seTRFA). L'anisotropia risolta nel tempo può risolvere l'eterogeneità e la dinamica associate ai moti rotazionali (locali e globali) delle biomolecole all'interno dell'emissione di fluorescenza che si verifica entro l'intervallo di tempo ns.
Per rilevare le dinamiche all'interno di eventi di singole molecole (su scala submillisecondo), abbiamo introdotto l'analisi della varianza del burst dell'anisotropia risolta nel tempo (traBVA)57. In traBVA, per un lampo di fotoni contenente Mi segmenti di fotoni consecutivi, l'eccesso di varianza di anisotropia (s2) per i lampi è
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq09.jpg" style="margin: auto;">.     (4)
Per un singolo stato anisotropo, la varianza σ2 deriva esclusivamente dal rumore di sparo65 (sn: √N, dove N è il numero di fotoni)
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq10.jpg" style="margin: auto;">(5)
dove m è il numero di fotoni in un burst. Quindi, per identificare una varianza aggiuntiva nell'anisotropia, possiamo definire l'eccesso di varianza anisotropia (S2) dovuto all'eterogeneità conformazionale come la differenza tra le equazioni 4 e 5.
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq11.jpg" style="margin: auto;">(6)
Per catturare le dinamiche che si verificano all'interno dell'osservazione di singole molecole e considerare l'approssimazione della varianza, è possibile utilizzare l'analisi dinamica della distribuzione dei fotoni (daPDA)55,56. Nei daPDA, l'intensità della fluorescenza è modellata seguendo una probabilità condizionata (<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq12.jpg" style="margin: auto;">) espressa come distribuzione binomiale.
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq13.jpg" style="margin: auto;">(7)
Insieme, con una stima del tasso di conteggio di fondo che segue una distribuzione di Poisson
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq14.jpg" style="margin: auto;">(8)
dove <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq15.jpg" style="margin: auto;"> è il numero medio di fotoni di sfondo per una finestra temporale impostata. I conteggi di fondo paralleli <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq16.jpg" style="margin: auto;"> e perpendicolari e <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq17.jpg" style="margin: auto;">, possono essere misurati utilizzando campioni tampone come riferimento. L'anisotropia di fluorescenza determinata sperimentalmente è ottimizzata minimizzando una cifra di merito χ2 con una distribuzione dell'intensità di fluorescenza per canale di polarizzazione che può includere cambiamenti cinetici.
Le routine di analisi e le rappresentazioni dei dati fornite offrono un approccio completo all'interpretazione dei dati raccolti. Sebbene questo protocollo si concentri principalmente sulle misure confocali, che sono limitate nel catturare le variazioni di anisotropia da nanosecondi a millisecondi, è possibile adottare un microscopio a riflessione interna totale per monitorare l'anisotropia di fluorescenza su scale temporali più lunghe, consentendo l'analisi delle serie temporali66. Per le misure confocali a singola molecola, evidenziamo l'uso di istogrammi multidimensionali che creano un'impronta digitale unica dell'insieme osservato. I decadimenti di fluorescenza risolti nel tempo, ricostruiti da popolazioni selezionate, possono tracciare l'evoluzione dell'anisotropia di fluorescenza su scala di nanosecondi (Figura 3). L'analisi della distribuzione dei fotoni 55,56 e l'analisi della varianza del burst (BVA)57,58 possono anche catturare dinamiche su scale temporali intermedie tra decadimenti risolti nel tempo e istogrammi multidimensionali. Sebbene questo protocollo non copra l'uso della spettroscopia di correlazione della fluorescenza di polarizzazione (FCS), con o senza eccitazione pulsata67,68, che può colmare le scale temporali da nanosecondi a millisecondi, gli stessi dati possono essere utilizzati per calcolare FCS69, sebbene ciò esuli dall'ambito del protocollo presentato. Se si intraprendono tali esperimenti, si consiglia di prolungare il tempo di misurazione del campione.
Questo approccio è stato applicato a un sistema complesso come le proteine FoxP umane, fornendo preziose informazioni sui movimenti coinvolti nel loro meccanismo d'azione. Le proteine FoxP sono fattori di trascrizione coinvolti in diversi aspetti fisiologici come lo sviluppo cerebrale e polmonare; È importante sottolineare che diverse mutazioni sono state riconosciute come compromettenti la funzione di queste proteine70,71. Utilizzando il dominio di legame al DNA di FoxP1 come modello, abbiamo generato diversi mutanti a cisteina singola per introdurre un colorante BODIPY-FL come tracker per i movimenti (Figura 4A). Infatti, abbiamo valutato l'effetto della dimerizzazione e del legame al DNA come principali regolatori strutturali di questa proteina. Utilizzando l'approccio smFA, abbiamo generato grafici 2D-smFA e realizzato traBVA e daPDA per ciascun mutante in condizioni monomeriche e dimeriche. Mostriamo un esempio di uno dei singoli mutanti studiati (Figura 4). Il comportamento dell'anisotropia è simile in tutti i mutanti in termini di determinazione di tempi di correlazione rotazionale alti e bassi e, quindi, di insiemi presumibili, disordinati e ripiegati. Tuttavia, è anche altamente eterogeneo in tutti i mutanti in termini di frazione e cinetica di ciascun insieme, evidenziando diversi cambiamenti di transizione da ordine a disordine influenzati dalla dimerizzazione e dal legame con il DNA, e mostra la descrizione ad alta risoluzione delle dinamiche strutturali lungo la catena (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig01.jpg"> 
Figura 1: Gamma dinamica di biomolecole e metodi di anisotropia a fluorescenza. (A) L'anisotropia di piccoli fluorofori legati a varie posizioni lungo la spina dorsale della biomolecola di interesse informa le dinamiche strutturali locali. (B) Scale temporali sondate dai decadimenti dell'intensità della fluorescenza (anisotropia della fluorescenza risolta nel tempo, FA) e istogrammi a singola molecola di dati confocali al microscopio a singola molecola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig02.jpg"> 
Figura 2: Registrazione ed elaborazione dei dati sull'anisotropia di fluorescenza a singola molecola. (A) Le molecole a diffusione libera vengono analizzate utilizzando un microscopio confocale a singola molecola dotato di un singolo laser di eccitazione polarizzato linearmente (blu nel nostro caso). L'emissione di fluorescenza (verde nel nostro caso) viene rilevata da due rivelatori dopo che un polarizzatore di fascio divide il segnale in due polarizzazioni (parallela, <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq18.jpg" style="margin: auto;">, e perpendicolare, <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq19.jpg" style="margin: auto;">, alla sorgente di eccitazione). (B) Ogni fotone rilevato è caratterizzato da tre parametri: micro tempo, macro tempo e tipo di canale. I dati vengono memorizzati in un formato TTTR (Time-Tagged Time-Solved)72. (C) Esplosioni di singole molecole vengono selezionate ed elaborate per estrarre i parametri di fluorescenza, inclusa l'anisotropia di fluorescenza per ogni molecola osservata. (D) I dati sono rappresentati in diversi modi, tra cui grafici bidimensionali dell'anisotropia della fluorescenza rispetto alla durata della fluorescenza e ai decadimenti dell'anisotropia risolti nel tempo. Queste rappresentazioni consentono la determinazione sia visiva che quantitativa della durata della fluorescenza, dei tempi di correlazione rotazionale e dell'eterogeneità del sistema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig03.jpg"> 
Figura 3: Dati rappresentativi per il dimero con scambio di dominio FoxP1. (A) Correlazione dell'anisotropia della fluorescenza (scatter r) rispetto al tempo medio di fluorescenza per molecola come grafico di contorno. Sovrapposizione di una singola equazione di Perrin per due componenti rotazionali come rappresentante della media d'insieme della molecola, considerando ρ1 e ρ2 di 0,2 ns e 8,5 ns, rispettivamente. (B) I decadimenti di fluorescenza risolti nel tempo del sottoinsieme vengono utilizzati per calcolare l'anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo del campione. L'adattamento con l'equazione 2 ha risolto le componenti locali e globali dell'anisotropia di fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig04.jpg"> 
Figura 4: Dinamica di FoxP1 inferiore al millisecondo monitorata utilizzando l'anisotropia di fluorescenza a singola molecola (smFA). (A) Una rappresentazione a fumetti della struttura monomerica di FoxP1. (B) Un istogramma bidimensionale illustra l'eterogeneità dinamica, rivelando due distinti tempi di correlazione rotazionale identificati attraverso l'anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo. L'analisi della varianza burst risolta nel tempo (traBVA) scopre un piccolo sottoinsieme di eventi con varianza eccessiva (Eq. 6) che mostrano una grande anisotropia. L'analisi quantitativa dell'anisotropia dinamica mediante l'analisi della distribuzione dei fotoni (PDA) estrae ulteriormente i tassi di cambio per questo processo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig05.jpg"> 
Figura 5: Screening dei movimenti locali e globali di FoxP1 durante la dimerizzazione. (A) Una rappresentazione in cartone animato confronta il monomerico FoxP1 con la sua forma dimerica. (B) Viene mostrata l'eccesso di varianza media per posizione in condizioni monomeriche e dimeriche, con un eccesso di varianza maggiore che indica cambiamenti più significativi nell'anisotropia. (C) L'analisi dell'anisotropia dinamica mediante l'analisi della distribuzione dei fotoni (PDA) aiuta a determinare le frazioni di popolazione (alta anisotropia nei colori scuri e bassa anisotropia nei colori chiari) in assenza (verde) e presenza (giallo) di DNA. In questo approccio, sono stati stimati i tassi (non mostrati) per le transizioni tra comportamenti locali e globali, rivelando che FoxP1 subisce un parziale dispiegamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo da singole molecole per la caratterizzazione della flessibilità locale nelle biomolecole

We describe a protocol for conducting time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level using confocal microscopy to investigate the ...

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