Anisotropia di fluorescenza risolta nel tempo da singole molecole per la caratterizzazione della flessibilità locale nelle biomolecole

Questa ricerca si propone di studiare la flessibilità locale e la dinamica delle biomolecole a livello di singola molecola, utilizzando l'anisotropia a fluorescenza risolta nel tempo in modalità microscopia confocale. Il rilevamento e la localizzazione di singole molecole hanno permesso l'osservazione di biomolecole, ma la cattura della loro dinamica richiede altri approcci. I metodi di fluorescenza risolti nel tempo aiutano a colmare questa lacuna.

Strumenti comuni per lo studio sperimentale della dinamica biomolecolare, tra cui il fret a singola molecola e l'NMR. A livello di singola molecola, varie analisi, processi, l'emissione fluorescente di fotone per fotone, questi includono l'analisi risolta nel tempo e l'analisi della varianza del burst.

L'uso di più fluorofori per gli esperimenti smFRET può introdurre complessità nel disegno sperimentale e nella realizzazione di campioni di qualità sufficientemente buona. L'uso di una singola etichetta e dell'anisotropia a fluorescenza risolve alcune di queste complessità.

Abbiamo scoperto che la forma monomerica del dominio forkhead della FoxP1 umana si comporta come una proteina disordinata e aumenta la sua popolazione di ripiegamento quando dimerizza.

[Istruttore] Per iniziare, filtrare la soluzione tampone standard preparata attraverso un filtro poroso da 0,22 micrometri. Quindi filtrare il tampone standard attraverso un filtro a carbone per l'acquisizione di singole molecole. Per le sonde fluorescenti, preparare aliquote di piccolo volume del BODIPY Fluorescent Pro preparato. Per la calibrazione della configurazione risolta dalla polarizzazione, in primo luogo, accendere i canali del rivelatore parallelo e perpendicolare e accendere il laser blu. Assicurarsi che la potenza del laser sia impostata su 60 microwatt e aprire il pannello di controllo del software TCSPC o il conteggio dei singoli fotoni correlato al tempo. Quindi mescolare un microlitro di 100 nanomolari di rodamina 110 con 49 microlitri di acqua distillata. Aggiungere una goccia di liquido di immersione sopra la lente dell'obiettivo del microscopio. Posizionare il vetro di copertura sull'obiettivo del microscopio e assicurarsi che la goccia d'acqua sia centrata sulla lente. Aggiungere 50 microlitri della soluzione diluita di rodamina 110 al centro del vetro di copertura per le misure di calibrazione. Regolare il piano dell'immagine in modo che sia all'interno della soluzione e sopra la superficie del vetro. Utilizzando la manopola di messa a fuoco, individuare il secondo punto focale luminoso e regolarlo a 1 1/2 giro. Ora apri il software in modalità Time-Tagged Time-Resolved e fai clic sul pulsante START. Registrare la velocità di conteggio per 120 secondi. Per le misurazioni di fondo, aggiungere 50 microlitri di acqua distillata al centro del vetro di copertura e ripetere l'acquisizione. Registra la velocità di conteggio dei fotoni per 300 secondi e salva il file come water.ptu. Per ulteriori misurazioni del fondo, aggiungere 50 microlitri di tampone standard al centro del vetro di copertura. Registra la velocità di conteggio dei fotoni per 300 secondi e salva il file come standard_buffer.ptu. Ora avvia il software di analisi Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL, e fai clic su Conferma la configurazione dalla finestra automatica. Fare quindi clic su Ottieni parametri da file, quindi fare clic su OK. Per selezionare la misura da analizzare, fare clic su Data Path Array e selezionare il set di dati appropriato. Caricare ora il file water.ptu per la misurazione dell'acqua per gli array, ad esempio Green Scatter, il file standard_buffer.ptu per lo sfondo verde e Rhodamine110.ptu per Green thick. sotto i parametri di selezione di una singola molecola, fare clic su Avanti, quindi su Regola per aprire una nuova finestra popup. Quindi premere Soglia per modificare il tempo di arrivo dell'interfotone e scegliere il tempo dell'evento della singola molecola per il tempo medio di arrivo dell'interfotone. Ora fai clic su numero minimo per impostare il numero minimo di fotoni per singolo evento molecola. Quindi chiudere la finestra popup facendo clic su Invio e OK. Fare clic sui parametri Color Fit per regolare la durata iniziale della fluorescenza per il verde e altri colori utilizzando i parametri di decadimento della fluorescenza. Modificare, richiedere e ritardare i valori regolando i valori da e a e chiudere la finestra popup. Infine, premi Salva per elaborare i file ASCII e salvarli nella cartella selezionata. Trasferire un pre-inoculo notturno di Escherichia coli C41 in 500 millilitri di terreno LB con antibiotico pre-aggiunto a un rapporto di diluizione 1:500. Misurare l'assorbanza della coltura a 600 nanometri per monitorare la crescita della coltura. Quando la densità ottica raggiunge tra 0,5 e 0,7, aggiungere IPTG a una concentrazione finale di 0,5 millimolari per indurre l'espressione proteica e incubare. Centrifugare le cellule batteriche a 3.000 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius quando la coltura raggiunge una densità ottica compresa tra 1,4 e 1,6. Dopo aver scartato il surnatante, conservare il pellet a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Successivamente, aggiungere da 50 a 100 micromolari di proteina FoxP1 a un eccesso molare di dieci volte di DTT o TCEP e incubare. Posizionare una colonna di desalinizzazione PD-10 in una provetta da centrifuga da 50 millilitri utilizzando un adattatore per colonna per la sostituzione del tampone. Aggiungere cinque millilitri di tampone PBS alla colonna per l'equilibratura e centrifugarla a 1.000 g per due minuti. Trasferire la colonna PD-10 in una provetta fresca da 50 millilitri e aggiungere due millilitri di tampone PBS nella colonna. Ora caricare 500 microlitri di proteina FoxP1 nella colonna. Eluire la colonna centrifugando a 1.000 g per due minuti per raccogliere la proteina purificata. Trasferire la proteina in un filtro ultracentrifugo da 10 kilodalton con taglio del peso molecolare. Dopo aver centrifugato a 7.500 g per 10 minuti, raccogliere l'eluato concentrato. Misura la concentrazione proteica. Quindi aggiungere BODIPY e incubare a quattro gradi Celsius per due ore su un rotatore. Scambio ripetuto di tamponi e concentrazione proteica. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, misurare il grado di etichettatura utilizzando la formula. Aggiungere 495 microlitri di acqua ultrapura e cinque microlitri di Tween 20 in un pozzetto di un vetrino da camera e mescolare bene. Dopo un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, lavare delicatamente la camera con acqua ultrapura due volte e asciugarla. Per correggere la fluorescenza di fondo, eseguire le misurazioni di una soluzione tampone. Calibrare la sensibilità relativa dei rivelatori paralleli e perpendicolari acquisendo dati da un colorante a rotazione rapida Per gli esperimenti di anisotropia a fluorescenza a singola molecola su FoxP1 monomerico, aggiungere 100 FoxP1 marcato con BODIPY picomolare e 100 FoxP1 nanomolare non marcato a 500 microlitri di tampone standard in un vetrino da camera. Iniziare le misurazioni e verificare nel software BIFL che il numero di raffiche registrate entro 30 secondi sia compreso tra 60 e 90. Se il campione è più concentrato, diluirlo fino a quando il numero di burst non rientra in questo intervallo. Infine, analizza le misurazioni. L'analisi del tempo di vita dell'anisotropia di fluorescenza a singola molecola ha rivelato una singola distribuzione originata da due distinti tempi di correlazione rotazionale nel dominio di legame del DNA FoxP1, suggerendo la coesistenza di insiemi strutturali ordinati e disordinati. L'analisi della varianza burst ha identificato un sottoinsieme di molecole FoxP1 che mostrano un'elevata anisotropia e varianti eccessive, suggerendo la presenza di cambiamenti conformazionali dinamici. L'analisi della distribuzione dei fotoni ha differenziato tra stati FoxP1 monomerici e dimerici, mostrando distribuzioni di anisotropia e tassi di cambio distinti. La dimerizzazione ha influenzato i movimenti locali e globali in FoxP1 con misure di varianza in eccesso che indicano cambiamenti anisotropi significativi in specifici siti marcati con cisteina. L'analisi dell'anisotropia dinamica ha rivelato che FoxP1 subisce un parziale dispiegamento dopo la dimerizzazione e il legame con il DNA, alterando la frazione di popolazioni strutturate e disordinate.