Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine ​​di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare la dinamica di conferma delle proteine di membrana utilizzando la marcatura a fluorescenza sito-diretta sulla superficie di singole cellule. Ciò si ottiene prima mutando individualmente i residui all'interfaccia dei domini extracellulari e transmembrana con la cistina, come mostrato dal C.It rosso, è quindi necessario determinare se questo residuo può essere marcato con un fluoro quattro che reagisce con cistina. La seconda fase della procedura consiste nell'esaminare se la cistina, la mutagenesi e/o la marcatura del fluoro quattro influenzano la cinetica e/o lo stato di conferma della proteina.

Questa operazione viene eseguita utilizzando la configurazione mostrata. La terza fase della procedura consiste nel confrontare e confrontare le variazioni dell'intensità della fluorescenza con i parametri cinetici della proteina bersaglio. Qui viene mostrata una tipica traccia di fluorescenza.

La fase finale della procedura consiste nell'etichettare le coppie di cisteina mutate con i quattro di Fluor del donatore o con i quattro di Fluor dell'accettore del donatore per misurare i tassi di fotodistruzione in tandem con le misurazioni del morsetto di tensione per determinare i vincoli di distanza. Questa figura mostra i tassi di distruzione della foto del donatore in assenza di accettore in nero la distruzione della foto del donatore in presenza dell'accettore è in rosso. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano che i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza, che sono il risultato di cambiamenti di conferma delle proteine, possono essere correlati alla funzione delle proteine di membrana attraverso la fluorimetria a morsetto di tensione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del trasporto ionico di membrana, come ad esempio il modo in cui i cambiamenti nello stato di conferma della proteina facilitano il trasporto di piccole molecole e ioni attraverso la membrana plasmatica. Iniziare la procedura clonando la pompa di sodio potassio in un vettore adatto per post xop, espressione di ovociti Lavis. Il passo successivo è quello di effettuare mutazioni della cisteina nei residui situati all'interfaccia tra i domini transmembrana ed extracellulari, come descritto nell'articolo di accompagnamento.

Al termine, verificare l'inserimento della mutazione mediante sequenziamento del DNA dopo aver trascritto il DNA plasmatico in mRNA come descritto nell'articolo di accompagnamento, quantificare la resa di mRNA utilizzando uno spettrofotometro prima dell'intervento chirurgico. La rana deve essere digiunata per 12 ore per evitare il vomito durante l'operazione. Per iniziare l'intervento il giorno successivo, immergere la rana nella soluzione anestetica fino a quando la rana non risponde a un pizzicamento del dito del piede.

Rimuovere la rana dalla soluzione anestetica e posizionarla con il lato dorsale rivolto verso il basso sul lato assorbente di un assorbente per pannolini. Metti un tovagliolo di carta bagnato sulla rana per mantenerla umida. Inoltre, se gli occhi della rana sono aperti, mantienili umidi con una soluzione salina.

Fai una piccola incisione a microfono su un lato della linea mediana della rana. Individua l'ovaia e portala all'esterno della rana. Evitare di toccare l'ovaio con la pelle.

Rimuovere l'ovaia e metterla in una capsula di Petri contenente una soluzione di ringer. Controllare che il tessuto rimanente non sanguini prima di rimetterlo all'interno della cavità smica. In caso di sanguinamento, applicare pressione con un cotton fioc sterile fino all'arresto.

Termina l'intervento suturando l'incisione utilizzando un modello di sutura interrotto. Rimetti la rana nel suo alloggiamento per riprenderla dall'anestesia usando le forbici. Dividi il lobo ovarico isolato in parti più piccole.

Trasferire i grumi nella soluzione di ringer più calcio con collagenasi. Quindi, agitare delicatamente la soluzione digestiva per due ore a 18 gradi Celsius. Quando la maggior parte dei citi è separata, lavare gli ovociti con una soluzione di ringer meno calcio.

Quindi incubare gli ovociti per 10 minuti in soluzione di ringer meno calcio a temperatura ambiente. A questo punto, lavare accuratamente i citi in una soluzione di ringer più calcio. Quindi trasferire gli ovociti nella soluzione di ringer più il calcio per la conservazione prima dell'iniezione.

Per il passaggio successivo, recupera l'mRNA sintetizzato dal congelatore a meno 20 gradi Celsius. Aggiungere 25 nanogrammi di mRNA a un volume finale di 50 nanolitri. Quindi iniettare l'mRNA nei citi dopo l'iniezione.

Mettere gli ovociti in una soluzione di ringer e un milligrammo per millilitro di gentamicina e incubarli a 18 gradi Celsius al buio per tre-sette giorni. Ciò consente alla pompa di sodio potassio di essere espressa all'interno della membrana plasmatica dell'ovocita. Il giorno dell'esperimento, rimuovere gli ovociti dall'incubatrice e metterli nel tampone di carico per 45 minuti e poi nel tampone post-caricamento per 45 minuti.

Ciò aumenta la concentrazione intracellulare di sodio per facilitare la misurazione della pompa di sodio e potassio. Per le misure di fluorescenza, incubare i citi in un tampone post-caricamento che contenga cinque micromolari del fluoroforo desiderato, come TMRM o FM per cinque-10 minuti al buio. Dopo la marcatura della flora four, lavare accuratamente gli ovociti con un tampone post privo di coloranti.

Mantieni gli ovociti al buio per evitare lo sbiancamento delle foto. Per prepararsi alle misure di clamp di tensione a due elettrodi, iniziare riempiendo i microelettrodi con cloruro di potassio a tre molari e testando la resistenza. La resistenza dovrebbe essere compresa tra 0,5 e 1,5 mega ohm.

Per gli esperimenti di scansione della cisteina, equipaggiare il microscopio a fluorescenza con un filtro di eccitazione 5 35 DF 50, un filtro di emissione 5 65 EFLP e uno specchio diic 5 70 DRLP. Quindi, posizionare l'octe in una camera RC 10 sul tavolino del microscopio a fluorescenza. Quindi inserire delicatamente entrambi i microelettrodi nell'octe utilizzando l'amplificatore per mantenere il potenziale di membrana a un valore costante.

Misurare il flusso di ioni attraverso la membrana attivando la proteina utilizzando una tecnica appropriata come lo scambio di soluzione o la modifica del potenziale di membrana. Per le misure di fluorescenza simultanee, utilizzare una sorgente luminosa al tungsteno da 100 watt per eccitare il fluoroforo donatore e per pinnare 0 2 2, A photo DDE per rilevare le variazioni dell'intensità della fluorescenza per la marcatura fluorescente. Dopo la scintigrafia con cisteina.

Misura la variazione dell'intensità fluorescente a corrente stazionaria utilizzando i gradini di tensione controllati dal software P clamp 10. Una seconda parte del protocollo prevede l'esecuzione di misurazioni dell'atrofia anes insieme alle misurazioni della distanza. Per calcolare l'intervallo dei valori quadrati dei kappa, un'atrofia misura la mobilità relativa del fluoro quattro a causa della rotazione.

Per i dettagli sui calcoli, vedere l'articolo di accompagnamento. Per misurare i vincoli di distanza, utilizzare un oloenzima, che ha due residui di cisteina extracellulare accessibili che possono essere etichettati con fluoro quattro. Aggiungere un tampone di post-caricamento contenente un FM micromolare e quattro TMRM micromolari.

Questo è il donatore e l'accettore. I quattro fluoro in un lotto di ovociti aggiungono un solo FM micromolare. Questo è solo il fluoro del donatore.

Quattro o un altro lotto di ovociti incubano entrambi i lotti di ovociti su ghiaccio per 30 minuti al buio. Ciò consente di effettuare misurazioni di enzimi hollo marcati con e senza fluoro quattro accettori. Quindi, equipaggiare il microscopio con un filtro di eccitazione 4 75 DF 40, un filtro di emissione 5 30 DF 30 e uno specchio dicroico 5 0 5 DRLP.

Quindi posizionare l'ovocita nella camera sul tavolino del microscopio a fluorescenza. Mantenere un flusso continuo di soluzione Misurare la dipendenza dal tempo dello sbiancamento del donatore in presenza e assenza della flora accettore. Quattro. Questi risultati possono essere utilizzati per calcolare la distanza tra i due residui sulla pompa di sodio potassio utilizzando la guardia forestale.

Equazione due: le misurazioni del morsetto di tensione dell'elettrodo devono essere effettuate contemporaneamente per garantire che la proteina sia funzionale. Utilizzando la funzione clamp X nel morsetto P 10, è possibile calcolare la media dei risultati della fotodistruzione del fluoro quattro donatore per un minimo di quattro registrazioni del sito. Per misurare il movimento relativo delle subunità proteiche si utilizzano costrutti di doppia cisteina che contengono fluoro quattro accettori e donatori.

L'intensità della fluorescenza in questi residui è insensibile allo stato di conferma della proteina e sarà una funzione della distanza tra i due quattro. Quindi, cambiare il filtro impostato nel microscopio con un filtro di eccitazione 4 75 a F 40, un filtro di emissione 5 95 a F 60 e uno specchio dicroico 5 0 5 DRLP. Quindi posizionare l'OI nella camera sul tavolino del microscopio a fluorescenza.

Successivamente, il donatore viene eccitato con una sorgente luminosa al tungsteno da 100 watt e l'intensità di fluorescenza dell'accettore. Il fluoro quattro viene misurato utilizzando un metodo appropriato come il ligando di tensione o lo scambio di soluzione, attiva la proteina di membrana e misura contemporaneamente la variazione dell'intensità della fluorescenza. Questa figura mostra la correlazione del trasporto ionico attraverso la membrana cellulare e le variazioni dell'intensità della fluorescenza.

La traccia superiore mostra le misure di current clamp in presenza di soluzione di test di sodio e soluzione di test di potassio in presenza di 10 micromolari e 10 millimolari. La traccia inferiore mostra le variazioni dell'intensità di fluorescenza misurate in tandem con le misurazioni della pinza amperometrica. Questa figura mostra due ovociti marcati con TMRM, il fluoro quattro accettore.

L'ovocita a sinistra esprime l'atpa sodico-potassico wild type, mentre l'ovocita a destra esprime l'APA sodico-potassico con un residuo di cisteina accessibile. Le tracce superiori di questa figura mostrano i dati di corrente transitoria all'impulso di tensione. Le tracce inferiori mostrano registrazioni in tempo reale delle variazioni di intensità della fluorescenza all'impulso di tensione.

Questa figura mostra la dipendenza dal tempo del fotosbiancamento della fotodistruzione del donatore è misurata in assenza e presenza del fluoro quattro accettore Il fotosbiancamento avviene più rapidamente senza un fluoro quattro accettore. Ogni traccia è la media di quattro registrazioni del sito. Questa figura mostra il movimento relativo delle subunità in caso di modifiche di conferma.

Le variazioni di fluorescenza sono mostrate nelle tracce rosse e il flusso di corrente è mostrato nelle tracce nere. Un aumento dell'intensità della fluorescenza mostrato a sinistra indica che i piani della flora si avvicinano. Nessuna variazione nell'intensità della fluorescenza mostrata al centro indica che la distanza del Fluor quattro rimane statica.

Una diminuzione dell'intensità della fluorescenza mostrata a destra indica che i quattro Fluor si allontanano ulteriormente durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di correlare i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza cinetica e allo stato stazionario con i cambiamenti di conferma nella proteina.