Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine ​​di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare la dinamica conformazionale delle proteine di membrana utilizzando un'etichettatura fluorescente mirata sulla superficie di singole cellule. Questo viene realizzato mutando inizialmente in modo individuale i residui all'interfaccia tra i domini extracellulari e transmembrana in cisteina, come indicato dalla C rossa. Successivamente, è necessario determinare se questo residuo può essere etichettato con un fluoroforo reattivo verso la cisteina. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'esaminare se la mutagenesi della cisteina, l'etichettatura con il fluoroforo o entrambi influenzano la cinetica e/o lo stato conformazionale della proteina.

Questo viene eseguito utilizzando l'allestimento mostrato. Il terzo passaggio della procedura consiste nel confrontare e analizzare le variazioni dell'intensità di fluorescenza con i parametri cinetici della proteina bersaglio. Qui viene mostrata una traccia tipica della fluorescenza.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'etichettare coppie di cisteine mutate con fluorofori donatori Fluor quattro o con coppie donatore-accettore Fluor quattro, al fine di misurare i tassi di fotodistruzione in combinazione con misurazioni mediante clamp di tensione per determinare i vincoli di distanza. Questo grafico mostra i tassi di fotodistruzione del donatore in assenza di accettore in nero; la fotodistruzione del donatore in presenza di accettore è rappresentata in rosso. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come le variazioni dell'intensità di fluorescenza, risultanti da cambiamenti conformazionali della proteina, possano essere correlate alla funzione delle proteine di membrana tramite fluorometria con clamp di tensione.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del trasporto ionico attraverso le membrane, ad esempio in che modo i cambiamenti dello stato conformazionale della proteina facilitino il trasporto di piccole molecole e ioni attraverso la membrana plasmatica. Iniziare la procedura clonando la pompa sodio-potassio in un vettore adatto all'espressione in oociti di Xenopus. Il passaggio successivo consiste nell'introdurre mutazioni a cisteina in residui localizzati all'interfaccia tra i domini transmembrana ed extracellulari, come descritto nell'articolo associato.

Al termine, verificare l'inserimento della mutazione mediante sequenziamento del DNA dopo aver trascritto il DNA plasmidico in mRNA come descritto nell'articolo correlato, e quantificare il rendimento dell'mRNA utilizzando uno spettrofotometro prima dell'intervento chirurgico. La rana dovrebbe essere sottoposta a digiuno per 12 ore per prevenire il vomito durante l'operazione. Per iniziare l'intervento chirurgico il giorno successivo, immergere la rana nella soluzione anestetica finché non diventa insensibile alla pressione sul dito del piede.

Rimuovere la rana dalla soluzione anestetica e posizionarla con il dorso rivolto verso il basso sul lato assorbente di un pannolino. Collocare un tovagliolo di carta bagnato sulla rana per mantenerla umida. Inoltre, se gli occhi della rana sono aperti, mantenerli umidi con soluzione salina.

Eseguire un'incisione piccola e media lungo un lato della linea mediana del rospo. Individuare l'ovaio ed estrarlo all'esterno del rospo. Evitare di far toccare l'ovaio alla pelle.

Rimuovere l'ovaio e posizionarlo in una piastra di Petri contenente soluzione di Ringer. Controllare il tessuto residuo per verificare la presenza di sanguinamento prima di riposizionarlo all'interno della cavità addominale. In caso di sanguinamento, applicare pressione con un bastoncino sterile fino a quando non si arresta.

Terminare l'intervento chirurgico suturando l'incisione con un punto separato. Restituire la rana al suo contenitore per farla riprendere dall'anestesia utilizzando forbici. Dividere il lobo ovarico isolato in parti più piccole.

Trasferire gli aggregati nella soluzione di Ringer con calcio aggiunto di collaghenasi. Successivamente, agitare delicatamente la soluzione di digestione per due ore a 18 gradi Celsius. Quando la maggior parte dei citi è separata, lavare gli oociti con la soluzione di Ringer senza calcio.

Quindi incubare gli oociti per 10 minuti in soluzione di ringer priva di calcio a temperatura ambiente. A questo punto, lavare accuratamente gli oociti nella soluzione di ringer con calcio. Successivamente, trasferire gli oociti nella soluzione di ringer con calcio per la conservazione prima dell'iniezione.

Per il passaggio successivo, prelevare l'mRNA sintetizzato dal congelatore a meno 20 gradi Celsius. Aggiungere 25 nanogrammi di mRNA a un volume finale di 50 nanolitri. Quindi iniettare l'mRNA nei citi dopo l'iniezione.

Posizionare gli oociti in soluzione di ringer e gentamicina uno milligrammo per millilitro e incubarli a 18 gradi Celsius al buio per tre a sette giorni. Questo consente alla pompa sodio-potassio di essere espressa all'interno della membrana plasmatica dell'oocita. Nel giorno dell'esperimento, rimuovere gli oociti dall'incubatore e posizionarli nel buffer di carico per 45 minuti, quindi nel buffer post-carico per 45 minuti.

Questo aumenta la concentrazione intracellulare di sodio per facilitare la misurazione della pompa sodio-potassio. Per le misurazioni di fluorescenza, incubare le cellule in un buffer post-caricamento contenente cinque micromoli del fluorocromo desiderato, come TMRM o FM, per cinque-dieci minuti al buio. Dopo la marcatura con floruro quattro, lavare gli oociti in modo esaustivo con buffer post privo di colorante.

Mantenere gli oociti al buio per prevenire lo sbiancamento fotoindotto. Per prepararsi alle misurazioni con il metodo del doppio elettrodo voltammetrico, iniziare riempiendo i microelettrodi con cloruro di potassio tre molare e verificando la resistenza. La resistenza deve essere compresa tra 0,5 e 1,5 megaohm.

Per esperimenti di scanning della cisteina, dotare il microscopio a fluorescenza di un filtro di eccitazione 5 35 DF 50, un filtro di emissione 5 65 EFLP e uno specchio dicromico five 70 DRLP. Successivamente, posizionare l'octe in una camera RC 10 sul piano del microscopio a fluorescenza. Quindi inserire delicatamente entrambi i microelettrodi nell'octe utilizzando l'amplificatore per mantenere il potenziale di membrana a un valore costante.

Misurare il flusso ionico attraverso la membrana attivando la proteina mediante una tecnica appropriata, come lo scambio di soluzione o la variazione del potenziale di membrana. Per misurazioni fluorescenti simultanee, utilizzare una sorgente luminosa al tungsteno da 100 watt per eccitare il fluoroforo donatore e per pin 0 2 2, A photo DDE per rilevare le variazioni dell'intensità fluorescente nel caso di marcatura fluorescente. Successivamente alla scansione dei cisteini.

Misurare la variazione dell'intensità fluorescente a corrente stazionaria utilizzando gradini di tensione controllati dal software P clamp 10. Una seconda parte del protocollo prevede l'acquisizione di misure di atropia insieme a misure di distanza. Per calcolare l'intervallo dei valori di kappa quadrato, un'atropia misura la mobilità relativa del fluoro quattro dovuta alla rotazione.

Consultare l'articolo associato per i dettagli relativi ai calcoli. Per misurare i vincoli di distanza, utilizzare un enzima oloenzimatico, che presenta due residui di cisteina extracellulari accessibili che possono essere marcati con fluorofori. Aggiungere tampone post-caricamento contenente un micromolare di FM e quattro micromolari di TMRM.

Questi sono il donatore e l'accettore. Aggiungere fluoro quattro a un lotto di ovociti un micromolare di FM soltanto. Questo è semplicemente il fluoro donatore.

Quattro a un altro lotto di ovociti, incubare entrambi i lotti di ovociti sul ghiaccio per 30 minuti al buio. Questo consente di effettuare misurazioni di enzimi hollo marcati con e senza un fluorocromo accettore. Successivamente, dotare il microscopio di un filtro di eccitazione 475 DF 40, un filtro di emissione 530 DF 30 e uno specchio dicromatico 505 DRLP.

Quindi posizionare l'ovocita nella camera sul palco del microscopio a fluorescenza. Mantenendo un flusso continuo della soluzione, misurare la dipendenza temporale dello sbiancamento del donatore in presenza e in assenza dell'accettore flora. Quattro. Questi risultati possono essere utilizzati per calcolare la distanza tra i due residui sulla pompa sodio-potassio utilizzando il metodo di Förster.

Le misurazioni della tensione con il metodo del doppio elettrodo devono essere effettuate contemporaneamente per assicurare che la proteina sia funzionale. Utilizzando la funzione clamp X in P clamp 10, mediare i risultati della foto-distruzione del fluorocromo donatore quattro per un minimo di quattro registrazioni in siti diversi. Per misurare il movimento relativo delle subunità proteiche, utilizzare costrutti a doppia cisteina che contengono fluorocromi accettore e donatore quattro.

L'intensità della fluorescenza in questi residui è insensibile allo stato conformazionale della proteina e dipenderà dalla distanza tra i due gruppi. Successivamente, sostituire il set di filtri nel microscopio con un filtro di eccitazione 4 75 a F 40, un filtro di emissione 5 95 a F 60 e uno specchio dicromatico 5 0 5 DRLP. Quindi posizionare l'OI nella camera sul palchetto del microscopio a fluorescenza.

Successivamente, il donatore viene eccitato mediante una sorgente luminosa al tungsteno da 100 watt e l'intensità di fluorescenza dell'accettore. Il fluoroforo quattro viene misurato utilizzando un metodo appropriato, come il legame di voltaggio o lo scambio di soluzione, attivando contemporaneamente la proteina di membrana e misurando in tempo reale la variazione dell'intensità di fluorescenza. Questa figura mostra la correlazione tra il trasporto di ioni attraverso la membrana cellulare e le variazioni dell'intensità di fluorescenza.

La traccia superiore mostra misurazioni in condizione di blocco della corrente in presenza di soluzione di prova al sodio e soluzione di prova al potassio contenenti rispettivamente 10 micromolari e 10 millimolari di ing. La traccia inferiore mostra le variazioni dell'intensità di fluorescenza misurate in parallelo con le misurazioni in condizione di blocco della corrente. Questa figura mostra due ovociti marcati con TMRM, il fluorocromo accettore.

L'oocita a sinistra esprime la proteina sodio-potassio ATPasi di tipo selvaggio, mentre l'oocita a destra esprime le ATPasi sodio-potassio con un residuo di cisteina accessibile. I tracciati superiori di questa figura mostrano i dati della corrente transitoria in risposta a un impulso di tensione. I tracciati inferiori mostrano registrazioni in tempo reale delle variazioni di intensità della fluorescenza in risposta a un impulso di tensione.

Questa figura mostra la dipendenza temporale del fotoblesamento: la distruzione fotoindotta del donatore viene misurata in assenza e in presenza del fluoroforo accettore. Il fotoblesamento avviene più rapidamente in assenza del fluoroforo accettore. Ogni traccia rappresenta la media di quattro registrazioni effettuate sul sito. Questa figura mostra il movimento relativo delle subunità in seguito a cambiamenti conformazionali.

Le variazioni della fluorescenza sono mostrate nei tracciati rossi e il flusso di corrente è mostrato nei tracciati neri. Un aumento dell'intensità di fluorescenza mostrato a sinistra indica che i piani della flora si avvicinano. Nessuna variazione dell'intensità di fluorescenza mostrata al centro indica che la distanza tra i Fluor quattro rimane costante.

Una diminuzione dell'intensità di fluorescenza mostrata a destra indica che i Fluor fours si allontanano durante il tentativo di questa procedura. È importante ricordare di correlare le variazioni dell'intensità di fluorescenza nello stato cinetico e nello stato stazionario ai cambiamenti conformazionali della proteina.