Regolazione delle modalità di contrattilità e deformazione di assemblaggi attivi basati su actina in vitro: dalle reti attive bidimensionali alle gocce di cristalli liquidi

Questa ricerca si concentra sui materiali biologici morbidi e mira ad esplorare i meccanismi fisici sottostanti che regolano la forma e l'organizzazione e i materiali ispirati alle cellule biologiche.

I sistemi di modelli biologici e in vitro sono intrinsecamente complessi con molte insidie e la preparazione dei campioni è fondamentale per la loro riproducibilità. Questo protocollo è progettato per migliorare la riproducibilità in questi sistemi.

Questi risultati aprono la strada al rilevamento, alla caratterizzazione dei meccanismi e alla comprensione della funzione delle forze fisiche e dei biomateriali. Questo può essere generalizzabile a vari biopolimeri e organelli.

[Narratore] Per iniziare, preparare il campione da caricare aggiungendo cinque microlitri di tampone 10XF in una provetta da microcentrifuga e aggiungere un volume di acqua distillata deionizzata in modo tale che il volume finale del campione sarà di 50 microlitri dopo l'aggiunta dei componenti rimanenti. Pipettare nella soluzione un microlitro di beta-mercaptoetanolo al 25%, un microlitro di 225 milligrammi per millilitro di glucosio, un microlitro di una miscela di glucosio ossidasi e 85.000 unità per millilitro di catalizzatore. Quindi aggiungere un microlitro di ATP 25 millimolare e 10 microlitri di metilcellulosa al 2%, 15 centipoise e mescolare accuratamente pipettando. Per iniziare la polimerizzazione dell'actina, mescolare l'actina non marcata con l'actina marcata e aggiungere la miscela di actina alla soluzione tampone F preparata. Pipettare la soluzione su e giù per garantire una miscelazione corretta. Lasciare polimerizzare l'actina a temperatura ambiente nella provetta per microcentrifuga. Successivamente, per preparare una cella di flusso, posizionare due pezzi di nastro biadesivo paralleli l'uno all'altro lungo la larghezza del vetrino del microscopio per formare i confini del canale della cella di flusso. Posizionare il vetrino coprioggetti sul canale del nastro assicurandosi che sia perpendicolare al vetrino del microscopio. Premere sull'area del vetrino coprioggetto che è a contatto con il nastro biadesivo per creare una buona tenuta ed eliminare le sacche d'aria. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il nastro in eccesso dal vetrino del microscopio e dal vetrino coprioggetti in modo che l'unico nastro visibile si trovi all'interno del canale del campione. Per preparare una camera di campionamento del cilindro per due campioni di deplaner, sciacquare prima il vetrino di copertura con etanolo, acqua ed etanolo. Asciugalo con aria filtrata. Applicare uno strato sottile di resina epossidica da cinque minuti per far aderire il cilindro di clonazione del vetro al vetrino coprioggetti. Aggiungere 3,5 microlitri di soluzione di tensioattivo oleoso in una provetta per microcentrifuga trasparente o di colore chiaro. Senza mescolare, pipettare cinque microlitri della soluzione di actina sulla parte superiore dello strato di tensioattivo oleoso. Chiudere il tubo. Tenere la parte superiore della provetta per microcentrifuga e muovere il bordo inferiore per formare una schiuma iniziale con emulsione visibile e continuare a sbattere fino a formare micro emulsioni uniformi. Prima di caricare la cella a flusso, miscelare una piccola quantità di resina epossidica per cinque minuti. Per caricare una cella a flusso, pipettare da uno a tre microlitri di soluzione di tensioattivo oleoso nel canale del campione della cella a flusso per creare un piccolo tappo che bagna il canale. Inclinare la cella di flusso per rimuovere l'eventuale traferro che si forma a causa del menisco del tensioattivo oleoso che si ritira prima di aggiungere il campione. Pipettare immediatamente la sospensione di emulsione della soluzione campione all'ingresso della cella di flusso per riempire il canale. Sigillare ogni lato del canale della cella di flusso con resina epossidica per cinque minuti. Per caricare la camera del campione del cilindro per campioni non in emulsione, pipettare cinque microlitri di soluzione di tensioattivo oleoso sul fondo della camera del cilindro di vetro. Inclinare e ruotare lentamente il vetrino coprioggetto per rivestire la superficie e il cilindro inferiore con la soluzione tensioattiva. Rimuovere la soluzione di tensioattivo oleoso in eccesso utilizzando una pipetta per ottenere uno strato sottile impedendo la completa evaporazione dell'olio. Aggiungere immediatamente la soluzione campione nella camera. Coprire la camera con un pezzetto di politetrafluoroetilene, o nastro in PTFE, per evitare l'evaporazione e il flusso. Montare il campione sul tavolino del microscopio. Avviare l'imaging time-lapse dell'actina utilizzando un obiettivo 20x, 40x, 60x o 100x con immersione in olio o acqua per garantire un'apertura numerica sufficientemente elevata per l'imaging ad alta risoluzione. In caso di polimerizzazione in una camera di campionamento, lasciare la polimerizzazione per circa 30 minuti o fino a quando non si verificano allungamenti o movimenti visibili del filamento. Aggiungere un reticolante al campione, quindi aggiungere la miosina come filamenti prepolimerizzati pipettando lentamente circa la metà del volume totale nel campione. Infine, avvia l'imaging time lapse. L'immagine rappresentativa della fluorescenza confocale della rete di actina entangled è mostrata qui. La rete di actina entangled è distribuita uniformemente sulla superficie. I punti luminosi in questa immagine rappresentano sovrapposizioni di filamenti, mentre le regioni scure indicano una presenza minima di actina. Le fluttuazioni termiche portano a variazioni locali di intensità e alla flessione visibile dei filamenti di actina. L'aggiunta di miosina II provoca la flessione e la riorganizzazione della rete di actina con accumulo visibile di punti di miosina a lungo termine. La contrazione della rete dipende dalla concentrazione di miosina e dalla concentrazione di ATP. Nelle reti di actina cross-linkate, la contrazione indotta dalla miosina porta a un movimento coordinato su scale di lunghezza più lunghe rispetto alle reti entangled.