Sintesi di biocompatibili a cristalli liquidi in elastomero Schiume come impalcature cellulari per 3D spaziali colture cellulari

L'obiettivo di questa procedura è quello di preparare scaffold cellulari tridimensionali biodegradabili simili a schiume basati su elastomeri a cristalli liquidi biocompatibili a catena laterale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dei cristalli liquidi e biomedico, come gli effetti delle proprietà degli elastomeri a cristalli liquidi sulla proliferazione e l'allineamento cellulare. Il vantaggio principale di questo metodo di scaffold cellulari bidimensionali è che consente lo studio delle interazioni spaziali cellula-cellula, cosa raramente possibile in ambienti macro 2D.

In generale, chi è nuovo a questo metodo avrà difficoltà con i test di compressione tattile. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo dopo aver dovuto cambiare i supporti in centinaia di piastre di Petri. Ci siamo chiesti se gli elastomeri a cristalli liquidi potessero supportare le cellule muscolari su una rete 3D, per eliminare l'uso di così tante piastre di Petri.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché alcuni passaggi richiedono un'attenta manipolazione delle sostanze chimiche. Inoltre, la sagomatura del modello di schiuma metallica può essere impegnativa. Per prima cosa, riempire una fiala da 20 millilitri con una soluzione al 2% in volume di PFOTES in toluene.

Mescolare la soluzione nella fiala per 24 ore per silanizzare l'interno della fiala. Sciacquare la fiala silanizzata con alcol isopropilico e asciugarla a 140 gradi Celsius per 30 minuti. Mettere 3,64 grammi di epsilon-caprolattone distillato, 0,5 grammi di alfa-cloro-epsilon-caprolattone e 0,25 millilitri di glicerolo nella fiala secca.

Agitare il composto per un minuto. Quindi, aggiungere 4,90 grammi di DL-lattide alla miscela e spurgare l'atmosfera della fiala con azoto gassoso per un minuto. Coprire l'apertura della fiala con un foglio di alluminio e scaldare la miscela a 120 gradi Celsius per circa due ore per sciogliere il DL-lattide.

Agitare la miscela per interrompere eventuali solidi non fusi, quindi aggiungere 66 microlitri di 10-2-etilesanoato alla fiala e agitare di nuovo. Chiudere la fiala con un foglio di alluminio e scaldare la miscela a 120 gradi Celsius per 10 minuti per risciogliere il DL-lattide. Una volta che il DL-lattide si è sciolto di nuovo, agitare energicamente la miscela e spurgare l'atmosfera dell'ampolla con azoto gassoso.

Sigillare la fiala con un setto di gomma. Inserire un ago collegato a una linea del vuoto attraverso il setto e avviare il vuoto. Sigillare a fiamma il collo della fiala, facendo attenzione a non sciogliere il tappo di gomma.

Una volta sigillato il collo, scaldare la miscela di reazione a 140 gradi Celsius per 48 ore. Quindi, lasciare raffreddare il composto a temperatura ambiente. Aprire la fiala e sciogliere la miscela di reazione viscosa in 10 millilitri di diclorometano.

Trasferire il composto in un imbuto separatore. Mettere un pallone contenente 100 millilitri di metanolo in un bagno di ghiaccio secco e acetone per raffreddare il metanolo a circa meno 78 gradi Celsius. Una volta che il metanolo si è raffreddato, fissare l'imbuto separatore sul pallone.

Aggiungere la miscela di reazione al metanolo freddo alla velocità di due gocce al secondo. Raccogli il precipitato bianco risultante su carta da filtro. Essiccare il precipitato in un forno sottovuoto tra i 50 e i 60 gradi Celsius per ottenere il prodotto SBC alfa-cloro a tre bracci.

Per preparare l'alfa colesterolo SBC a tre bracci, l'atomo di cloro pendente viene sostituito da un azide. Una reazione a scatto con il colesterolo 5-esinoato si traduce in un colesterolo pendente come porzione di cristalli liquidi. Per iniziare a preparare l'impalcatura in elastomero a cristalli liquidi, combinare 0,75 grammi di alfa-colesterolo SBC a tre bracci con 0,25 millilitri di HDI e 0,24 millilitri di epsilon caprolattone distillato.

Aggiungere a questo 60 microlitri di 10-2-etilesanoato e agitare il composto. Quindi, ritaglia un pezzo di schiuma metallica di nichel di un centimetro per quattro centimetri. Arrotolare la schiuma di nichel in un cilindro di un centimetro di diametro e un centimetro di altezza per formare un modello per l'impalcatura in schiuma di elastomero a cristalli liquidi.

Posizionare la dima in una fiala di vetro o in un foglio di alluminio e versare la miscela di elastomero a cristalli liquidi sulla dima fino a coprirla completamente. Lasciare riposare la mascherina nella miscela di elastomeri a cristalli liquidi per due minuti, quindi rimuovere l'eccesso con una pipetta. Scaldare il composto e la sagoma a 80 gradi Celsius per una notte.

Quindi, stacca il foglio di alluminio o rompi il vetro. Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere l'elastomero a cristalli liquidi in eccesso per esporre il modello di nichel metallico. Mettere la schiuma in un pallone e aggiungere 70 millilitri di una soluzione acquosa satura di ferro tre cloruro.

Mescolare la schiuma nella soluzione per tre giorni a temperatura ambiente per sciogliere il modello di nichel. Ogni 24 ore, mescolare la schiuma in acqua deionizzata per 30 minuti, quindi riprendere a mescolare in una soluzione fresca di ferro a tre cloruri. Dopo il secondo giorno di agitazione, eseguire un test di compressione tattile sulla schiuma di elastomero a cristalli liquidi.

La resistenza alla compressione tattile indica che la sagoma di nichel è ancora presente nella schiuma. Dopo il terzo giorno, tutto il modello di nichel è stato eliminato e la schiuma risultante appare molto morbida e facile da comprimere completamente. La dima in nichel deve essere completamente eliminata.

È importante sciacquare accuratamente la schiuma di elastomero a cristalli liquidi in cloruro di ferro fino a renderla morbida al tatto quando viene eseguito un test di compressione tattile. Lo scaffold in schiuma elastomerica a cristalli liquidi è ora pronto per essere caratterizzato e utilizzato. Una volta che la schiuma di elastomero a cristalli liquidi è morbida, sciacquarla con etanolo al 70% per sterilizzarla.

Per iniziare la procedura di semina, lavare nuovamente due volte le impalcature in schiuma di elastomero a cristalli liquidi in un millilitro di etanolo al 70% per sterilizzare le superfici in elastomero. Quindi, irradiare gli scaffold con luce UV per 10 minuti. Lavare i ponteggi con un'altra porzione da un millilitro di etanolo al 70%.

Sciacquare gli scaffold con un millilitro ciascuno di acqua sterile e soluzione salina tamponata con fosfati. Caricare gli scaffold sterilizzati in elastomero a cristalli liquidi in piastre di coltura a 24 pozzetti. Preparare e contare una sospensione delle cellule di interesse nel terreno di crescita cellulare appropriato con penicillina e streptomicina.

Diluire la sospensione cellulare a 1,5 volte 10 fino alla quinta cellula per 100 microlitri utilizzando il terreno di crescita. Depositare una goccia di sospensione cellulare diluita sopra ogni impalcatura in elastomero a cristalli liquidi. Incubare gli scaffold in elastomero a cristalli liquidi seminati a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 5% di CO2 per due ore.

Aggiungere altri 0,5 millilitri di terreno di coltura a ciascuna impalcatura e continuare l'incubazione. Ogni 48 ore, lavare le impalcature seminate con un millilitro di PBS e aggiungere un terreno di coltura fresco. Continuare a incubare gli scaffold fino a quando le cellule non sono pronte per la microscopia.

Queste LC smetiche consentono lo studio di costrutti tissutali complessi promuovendo la crescita e la proliferazione cellulare. Al fine di mantenere la vitalità cellulare, le schiume devono essere sterilizzate e la pulizia delle colture deve essere mantenuta in ogni momento. Per prepararsi alla microscopia, fissare le cellule sugli scaffold con una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 15 minuti.

Immergere i campioni tre volte in tre millilitri di PBS per cinque minuti. Collocare un campione di scaffold in una provetta Eppendorf. Colorare il campione con una soluzione di DAPI allo 0,1% in 500 microlitri di PBS per 10 minuti.

Immergere il campione due volte in un millilitro di PBS per cinque minuti. Quindi, visualizza immediatamente il campione con la microscopia confocale. Acquisisci stack di immagini che si estendono sul campione e analizza i dati in un programma di elaborazione delle immagini.

Un SBC a tre bracci con frazioni a cristalli liquidi è stato colato su un modello di schiuma di nichel con HDI come reticolante. Il modello di nichel è stato rimosso mediante incisione per ottenere la schiuma elastomerica a cristalli liquidi. Sono stati eseguiti periodicamente test di deformazione a compressione per monitorare il processo di incisione.

Una volta che il nichel è stato completamente disciolto, il test di deformazione a compressione ha mostrato una riduzione del 70% delle dimensioni quando compresso. Dopo aver rilasciato la compressione, la schiuma elastomerica a cristalli liquidi ha recuperato costantemente le sue dimensioni e la sua forma originali. Questo comportamento è attribuito alle frazioni a cristalli liquidi, poiché schiume elastomeriche simili prive della porzione di colesterolo epsilon-caprolattone non si sono riprese dalla compressione.

L'SCM della morfologia interna della schiuma ha mostrato una rete interconnessa di montanti cavi in schiuma. La morfologia regolare è stata attribuita alla struttura della schiuma di nichel, indicando che la dimensione dei pori e la forma complessiva possono essere controllate selezionando un modello metallico appropriato. La schiuma è stata seminata con cellule di neuroblastoma, che si sono attaccate alle pareti della rete entro due giorni.

30 giorni dopo la semina, la microscopia confocale ha rivelato che le cellule si estendevano sulla rete di elastomeri a cristalli liquidi e avevano formato più strati dispersi in tutta la schiuma di elastomero. È stato osservato un allungamento dei nuclei cellulari correlato all'allineamento cellulare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro tre o quattro settimane se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e preparare scaffold cellulari in elastomero a cristalli liquidi con dimensioni e morfologie dei pori specifiche. Durante il tentativo di questa procedura, è importante caratterizzare completamente ogni prodotto e monitorare la vitalità e l'espansione cellulare. Inoltre, una corretta tecnica di colorazione è importante per acquisire facilmente immagini di microscopia confocale.

Seguendo questa procedura, gli elastomeri a cristalli liquidi possono anche essere esposti a stimoli esterni, come stress o campi magnetici ed elettrici, per rispondere a ulteriori domande su come l'ordinamento molecolare anisotropo degli elastomeri a cristalli liquidi influisce sulla risposta cellulare. Le implicazioni di questa tecnica si applicano allo studio dei processi patologici, in quanto fornisce una piattaforma per studiare dinamicamente gli effetti di agenti esterni sull'attività simulata della malattia e sui successivi processi di riparazione. Sebbene questa schiuma elastomerica a cristalli liquidi smectica possa fornire informazioni sulle interazioni cellula-cellula, può essere utilizzata anche con altri materiali, come semiconduttori o nanostrutture metalliche.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in campo biomedico per progettare piattaforme sperimentali a lungo termine che rispecchiano i sistemi viventi.