In-situハイブリダイゼーション

In situハイブリダイゼーションは、培養細胞内または化学的に保存された組織切片中のDNAまたはRNAを見つけるために使用される技術です。

RNA in situハイブリダイゼーションは、特定のmRNA転写産物を検出および定量することにより、遺伝子が発現している場所をモニターするために使用されます。

標的mRNAは、DNAテンプレートのin vitro転写によって作成されるか、化学反応によって合成される一本鎖相補的RNAプローブによって検出されます。

プローブは、放射性同位元素、蛍光色素、またはビオチンやジゴキシゲニンなどの他のレポーター分子で標識されており、標識された抗体によって結合して検出できます。

RNA in situハイブリダイゼーションには、組織固定、透過化、ハイブリダイゼーション、検出の4つの主要なステップがあります。

まず、新鮮な組織を採取し、化学的に処理して、組織内の生化学反応を止め、その構造的完全性を維持します。この保存技術は組織固定と呼ばれます。

次に、プローブが標的RNAにアクセスして結合するために、組織内のタンパク質と脂質を除去する必要があります。

タンパク質を分解し、細胞膜を透過化するために、サンプルを0.2モルの塩酸とプロテイナーゼなどの酵素で処理し、界面活性剤を使用して脂質を分解します。

次に、標的RNAを、RNA-プローブハイブリッドの融点のすぐ低い温度でプローブとハイブリダイズします。これにより、プローブは相補的なmRNAでアニーリングすることができます。結合していないプローブと緩く結合したプローブは、数回の洗浄を行うことで除去します。

ハイブリダイズプローブの検出方法は、ラベルの種類によって異なります。放射性プローブは写真フィルムに曝露されますが、蛍光プローブは蛍光顕微鏡で見ることができます。

他の標識では、レポーター分子に対する抗体は蛍光色素または比色色素で標識されています。

ハイブリダイズプローブを検出すると、目的の遺伝子が発現している場所を示す特定のmRNAの分布が明らかになります。