5.12
In situハイブリダイゼーションは、培養細胞内または化学的に保存された組織切片中のDNAまたはRNAを見つけるために使用される技術です。
RNA in situハイブリダイゼーションは、特定のmRNA転写産物を検出および定量することにより、遺伝子が発現している場所をモニターするために使用されます。
標的mRNAは、DNAテンプレートのin vitro転写によって作成されるか、化学反応によって合成される一本鎖相補的RNAプローブによって検出されます。
プローブは、放射性同位元素、蛍光色素、またはビオチンやジゴキシゲニンなどの他のレポーター分子で標識されており、標識された抗体によって結合して検出できます。
RNA in situハイブリダイゼーションには、組織固定、透過化、ハイブリダイゼーション、検出の4つの主要なステップがあります。
まず、新鮮な組織を採取し、化学的に処理して、組織内の生化学反応を止め、その構造的完全性を維持します。この保存技術は組織固定と呼ばれます。
次に、プローブが標的RNAにアクセスして結合するために、組織内のタンパク質と脂質を除去する必要があります。
タンパク質を分解し、細胞膜を透過化するために、サンプルを0.2モルの塩酸とプロテイナーゼなどの酵素で処理し、界面活性剤を使用して脂質を分解します。
次に、標的RNAを、RNA-プローブハイブリッドの融点のすぐ低い温度でプローブとハイブリダイズします。これにより、プローブは相補的なmRNAでアニーリングすることができます。結合していないプローブと緩く結合したプローブは、数回の洗浄を行うことで除去します。
ハイブリダイズプローブの検出方法は、ラベルの種類によって異なります。放射性プローブは写真フィルムに曝露されますが、蛍光プローブは蛍光顕微鏡で見ることができます。
他の標識では、レポーター分子に対する抗体は蛍光色素または比色色素で標識されています。
ハイブリダイズプローブを検出すると、目的の遺伝子が発現している場所を示す特定のmRNAの分布が明らかになります。
In situハイブリダイゼーション(ISH)は、標識プローブを使用して、細胞、組織、または組織切片内の特定のDNAまたはRNA分子を検出し、位置を特定するために使用される技術です。 この技術は1969年に核酸の研究に初めて使用されました。現在、科学研究や臨床現場、特に診断目的において不可欠なツールとなっています。
プローブとラベルの種類
プローブは、細胞内の対応するヌクレオチド配列に結合するDNAまたはRNAの相補鎖です。in situハイブリダイゼーションでは、一本鎖DNAプローブ、二本鎖DNAプローブ、アンチセンス RNAプローブまたはリボプローブ、合成オリゴデオキシヌクレオチド プローブなどの多くの異なるプローブが使用されます。プローブの選択は、プローブの感度、特異性、安定性、組織サンプルへの浸透のしやすさなど、いくつかの要因によって決まります。
これらのプローブは、検出目的で放射性同位体、蛍光色素、またはその他の抗原分子で標識できます。3H、35S、および32Pは広く使用されている放射性標識プローブですが、非放射性標識にはビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセインなどがあります。 これらの標識は、末端標識、ニックトランスレーション、またはランダムプライマー合成法を介してプローブDNA分子に結合できます。 オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡検査、免疫組織化学などの検出方法は、ハイブリダイズしたプローブに結合した標識に基づいてターゲットを視覚化するために使用されます。
in situハイブリダイゼーションのメリットとデメリット
in situハイブリダイゼーションの主な利点の 1 つは、凍結組織にも適用できるため、入手が困難な組織を最大限に利用できることです。さらに、免疫組織化学などの他の技術と組み合わせて、サンプル中のタンパク質や活性なmRNAを検出できます。ただし、DNAおよびRNAのコピーが少ないサンプルを扱う場合、in situハイブリダイゼーションを使用してターゲットを特定するのは難しい場合があります。
In situハイブリダイゼーションは、培養細胞内または化学的に保存された組織切片中のDNAまたはRNAを見つけるために使用される技術です。
RNA in situハイブリダイゼーションは、特定のmRNA転写産物を検出および定量することにより、遺伝子が発現している場所をモニターするために使用されます。
標的mRNAは、DNAテンプレートのin vitro転写によって作成されるか、化学反応によって合成される一本鎖相補的RNAプローブによって検出されます。
プローブは、放射性同位元素、蛍光色素、またはビオチンやジゴキシゲニンなどの他のレポーター分子で標識されており、標識された抗体によって結合して検出できます。
RNA in situハイブリダイゼーションには、組織固定、透過化、ハイブリダイゼーション、検出の4つの主要なステップがあります。
まず、新鮮な組織を採取し、化学的に処理して、組織内の生化学反応を止め、その構造的完全性を維持します。この保存技術は組織固定と呼ばれます。
次に、プローブが標的RNAにアクセスして結合するために、組織内のタンパク質と脂質を除去する必要があります。
タンパク質を分解し、細胞膜を透過化するために、サンプルを0.2モルの塩酸とプロテイナーゼなどの酵素で処理し、界面活性剤を使用して脂質を分解します。
次に、標的RNAを、RNA-プローブハイブリッドの融点のすぐ低い温度でプローブとハイブリダイズします。これにより、プローブは相補的なmRNAでアニーリングすることができます。結合していないプローブと緩く結合したプローブは、数回の洗浄を行うことで除去します。
ハイブリダイズプローブの検出方法は、ラベルの種類によって異なります。放射性プローブは写真フィルムに曝露されますが、蛍光プローブは蛍光顕微鏡で見ることができます。
他の標識では、レポーター分子に対する抗体は蛍光色素または比色色素で標識されています。
ハイブリダイズプローブを検出すると、目的の遺伝子が発現している場所を示す特定のmRNAの分布が明らかになります。
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