方法論記事

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

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DOI：

10.3791/66608

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2024年4月5日

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1Leeds Institute of Cardiovascular and Metabolic Medicine, University of Leeds

この記事について

サマリー

ここでは、ヒト皮下脂肪組織(hSATMVEC)から微小血管内皮細胞を単離、培養、および表現型決定するためのプロトコールについて説明します。さらに、hSATMVEC-脂肪細胞クロストークの実験モデルについても説明します。

要約

微小血管内皮細胞(MVEC)は、血管緊張の制御、血栓症の調節、血管新生など、多くの重要な役割を担っています。内皮細胞(EC)の遺伝子型と表現型の有意な不均一性は、それらの血管床と宿主の病状によって異なります。組織特異的な血管床や個々の患者グループからMVECを分離する能力は、さまざまな病状におけるMVEC機能を直接比較する機会を提供します。本稿では、心埋め込み型電子デバイス(CIED)の挿入時に採取した皮下脂肪組織(SAT)を用いて、機能的なヒト皮下脂肪組織MVEC(hSATMVEC)の純粋集団を単離する方法と、hSATMVEC-脂肪細胞クロストークの実験モデルについて述べる。

hSATMVECは、抗CD31抗体でコーティングされた磁気ビーズとのインキュベーションと磁気カラムの通過により、SATの酵素消化後に単離されました。hSATMVECをゼラチンコーティングプレート上で成長させ、継代しました。実験は継代2〜4の細胞を使用しました。細胞は、少なくとも継代5までEC形態の古典的な特徴を維持した。フローサイトメトリー評価では、単離されたhSATMVEC(CD31+/CD144+/CD45-)の純度は99.5%であることが示されました。対照群から単離されたhSATMVECの集団倍加時間は約57時間で、細胞増殖イメージングキットを用いて活発な増殖を確認しました。単離されたhSATMVECの機能は、インスリン刺激に対する反応と血管新生チューブ形成能を用いて評価されました。その後、細胞のクロストークを研究するためにhSATMVECと脂肪細胞の皮下共培養モデルを確立し、hSATMVECが脂肪細胞の機能に及ぼす下流効果を実証しました。

hSATMVECは、CIED挿入時に採取したSATから単離することができ、実験的表現型およびhSATMVEC-脂肪細胞のクロストーク研究の両方に十分な純度を持っています。

概要

内皮細胞(EC)は、血管壁の内面を単層として覆う扁平上皮細胞です。それらは、血管緊張の制御、血栓症の調節、炎症反応の調節、血管新生1への寄与など、多くの重要な役割を担っています。心血管代謝生理学における内皮細胞の重要性を考えると、内皮細胞は、病態生理学の理解を深め、心血管代謝疾患の新しい薬理学的治療法を検討するために実験的に頻繁に使用されます。

しかし、内皮細胞の形態、機能、遺伝子発現、および抗原組成には、それらの血管床の起源に応じて非常に不均一性があります2。アテローム性動脈硬化症の研究には、大動脈由来の内皮細胞が最適ですが、血管新生の研究には、微小血管内皮細胞(MVEC)と呼ばれる小血管由来の内皮細胞がより適しています2。内皮の不均一性の分子基盤を理解することは、血管床特異的治療に関する貴重な洞察を提供する可能性があります。微小血管内皮機能も、糖尿病、心血管疾患、全身感染症など、多くの疾患で大きく異なります3,4。したがって、定義された患者グループから内皮細胞を単離する能力により、それらの内皮細胞機能と細胞クロストーク5を直接比較することができます。

この論文では、心臓埋め込み型電子機器(CIED)挿入時に採取された皮下脂肪組織(hSATMVEC)からヒトMVECを分離する新しい方法について説明します。皮下脂肪組織(SAT)の酵素消化後に単離されたhSATMVECを成長させ、ゼラチンコーティングプレート上で継代した。次に、hSATMVECの表現型を検証し、日常的な内皮細胞アッセイでの使用を実証するために、hSATMVECにうまく適用されたさまざまな表現型アッセイについて説明します。最後に、hSATMVECs-脂肪細胞クロストークの実験モデルにおけるhSATMVECsの応用について述べます。

プロトコル

記載されている技術で使用されるヒト組織のサンプルは、Leeds Teaching Hospitals NHS Trust(英国リーズ)の日常的な臨床診療に従って、ガイドラインで示されたCIEDの挿入を受けている患者から採取されています。研究プロトコルは、他のすべての文書とともに、参加者の登録前に地元の倫理委員会(11/YH/0291)によって承認されました。この研究は、ヘルシンキ宣言の原則に準拠して実施されました。

1. 患者集団

  1. CIED 移植中に、大胸筋を覆う SAT から新鮮な皮下脂肪組織 (SAT) を取得します。
  2. SATサンプルを無菌条件下で分離し、細菌汚染を防ぐために、厳格な無菌条件下で層流フードで収集した後、組織サンプルを処理します。

2. 内皮細胞の単離と培養

注:hSATMVECアイソレーションの概略図を 図1に示します。

  1. hSATMVECの単離には、大胸筋を覆うSATからのCIED移植中に得られた新鮮な皮下脂肪組織(SAT)を最低250mg使用します( 図1を参照)。
    注:新鮮なSATを大量に使用すると、単離中のhSATMVECの収量が増加し、単離とhSATMVEC培養が成功する可能性が最も高くなります。
  2. 直ちにSATを1.5 mLの微量遠心チューブ内の氷冷磁気活性化セルソーティング(MACS)組織保存溶液に入れてから、ラボに移します。
    注:分離が成功する可能性を最大限に高めるには、hSATMVEC分離をできるだけ早く実行する必要があります。ただし、SATは、必要に応じて分離する前に氷上に最大24時間保存できます。
  3. 1 mg/mLのコラゲナーゼ/ディスパーゼワーキング溶液を以下のように調製します。
    1. まず、500 mgのコラゲナーゼ/ディスパーゼ凍結乾燥粉末を5 mLの滅菌水に再構成して、100 mg/mLの濃度のコラゲナーゼ/ディスパーゼストック溶液を形成します。
    2. hSATMVEC単離ごとに、100 μLのコラゲナーゼ/ディスパーゼストック溶液を10 mLの冷たいHanks'Balanced Salt溶液に希釈して、1 mg/mLの作業溶液にします。
  4. 層流キャビネットで、2つのメスを使用して、ペトリ皿の蓋に500 μLの1 mg/mLコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液で組織を~1mm3 個刻み、粉砕して清潔な50 mL遠心チューブに移します。
  5. シャーレの蓋を4.5 mLの新鮮な1 mg / mLコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液で洗い、50 mLの遠心チューブに加えます。.20 rpmのチューブローテーターで37°Cで30分間消化します。10 mLの完全EC増殖培地MVを添加して、消化プロセスを停止します。
  6. 消化した混合物を粉砕し、70 μmのセルシーブに通します。10mLの0.5%リン酸緩衝生理食塩水-ウシ血清アルブミン(PBS-BSA)緩衝液でふるいをすすぎます。サンプルを300 x g で室温で10分間遠心分離し、上清を捨てます。このステップを、さらに5 mLの0.5% PBS-BSAで繰り返します。
  7. 次に、死細胞除去キットを使用して死細胞を除去します。これを行うには、細胞ペレットを200 μLの死細胞除去ビーズ(使用前のボルテックス)で、1.5 mLの微量遠心チューブ内で室温(RT)で15分間インキュベートします。
  8. 30 μmフィルター付きLSカラムをセパレーターマグネットに取り付け、その下に15 mLの遠心チューブを置きます。マグネティックカラムを1 mLの死細胞除去結合バッファーで1 mL洗浄してから、サンプル/ビーズ懸濁液を添加し、重力下で受動的に通過させます。
  9. 次に、0.5 mLの結合バッファーを加えてカラムを洗浄し、受動的にカラムを通過させます。この洗浄を4回繰り返します。
  10. 溶出液を生細胞画分として回収し、細胞を 300 x g で RT で 10 分間遠心した後、得られたペレットを 0.5% PBS-BSA の 400 μL で洗浄して再懸濁します。
  11. 20 μLの抗CD31コーティング磁気ビーズを懸濁細胞に加え、4°Cで20分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットを0.5% PBS-BSAの500 μLに再懸濁します。
  12. 30 μmフィルター付きのMSカラムをセパレーターマグネットに取り付け、その下に15 mLの遠心チューブを置きます。カラムを 500 μL の 0.5% PBS-BSA でプライミングします。この手順を 2 回繰り返します。
  13. 細胞マイクロビーズ懸濁液を添加し、重力下で通過させます。カラムを 500 μL の 0.5% PBS-BSA で 3 回洗浄します。カラムの下の遠心分離管内のフロースルーには、CD31- 画分が含まれています。
  14. CD31+ フラクション(hSATMVECsを含むフラクション)を回収するには、MSカラムをセパレーターマグネットから取り外し、新しい15 mL遠心チューブに入れます。0.5% PBS-BSA 1 mL を添加し、カラムプランジャーを 1 回の滑らかな操作で塗布して、捕捉した hSATMVEC を放出します。
  15. サンプルを300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞ペレットを1 mLの完全EC増殖培地MVに再懸濁し、1 mLの細胞溶液を2%ゼラチンコーティングされた24ウェルプレート(Passage 0)の1つまたは2つのウェル(ペレットサイズによる)に分割します。
    注:単離後の最初の数日間に付着細胞がほとんどなくても心配しないでください。
  16. メディアは3日ごとに交換します。細胞を37°Cで5%CO2で培養します。単離された細胞が~80%のコンフルエント度(2〜4週間)に達したら、それらを6ウェルプレートの1つのウェルに継代します(継代1)。
    注:その後の継代では、1つのコンフルエントドナーウェルからレシピエントウェルに細胞を再播種することができます。実験は、フローサイトメトリーを使用して細胞が>99%の純度を示した後、継代2〜4世代の細胞で行った(セクション3を参照)。細胞は、少なくとも継代5まで典型的な内皮形態を維持した。

3. フローサイトメトリー

  1. フローサイトメトリーの前に、hSATMVECを目視で確認し、それらがコンフルエントで形態学的に代表的であることを確認します。6ウェルプレートの1ウェルの細胞を用いて、継代2におけるhSATMVECのフローサイトメトリー評価を行います。
  2. PBSで細胞を2回洗浄し、500μLのPBSをウェルに加え、毎回吸引します。次に、300 μL/ウェルの温かいトリプシン/EDTA(0.25%)溶液を加えます。37°Cで5% CO2 と2分間インキュベートします。
  3. 取り外したら、トリプシン/EDTA溶液を700 μLの完全EC増殖培地MVで中和し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
  4. 細胞懸濁液を400 x g でRTで8分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を廃棄します。次に、細胞ペレットを1 mL MACSバッファーに再懸濁し、未染色コントロールと染色サンプル(ウェルあたり500 μL)を標識した2本の1.5 mL微量遠心チューブに分けます。
  5. 各微量遠心チューブに500 μLのMACSバッファーを追加した後、再度400 x g でRTで8分間遠心分離します。
  6. 上清を捨て、未染色のコントロール用に100 μLのMACSバッファーに細胞ペレットを再懸濁し、染色したサンプル用に100 μLの染色カクテル(補足表1)に再懸濁します。CD45-FITC(汎白血球マーカー)、CD144-PEおよびCD31-PerCP(内皮細胞によって発現される)で細胞を染色します。
  7. 懸濁細胞を5秒間短時間ボルテックスし、次いで4°Cで10分間インキュベートします。次に、各チューブに1 mLのMACSバッファーを加え、再度400 x g でRTで8分間遠心分離し、上清を捨てます。
  8. 最後に、細胞ペレットを500 μLのMACSバッファーに再懸濁し、新鮮な1.5 mLの微量遠心チューブに移します。ラベル付きのチューブを蓋付きのアイスボックスに入れ、分析の準備が整います。
    注:含まれているすべてのフローサイトメトリー分析は、Beckman Coulter Cytoflex 4レーザーフローサイトメーターシステム(488 nm励起レーザーのみを使用)で実施しました。
  9. 各フルオロチョメの最大発光波長とフィルターを次のように設定します:CD45-FITC-最大発光520 nm、フィルター525/50;CD144-PE - 最大発光578 nm、フィルター585/40;CD31-PerCP - 最大蛍光675 nm、フィルター655-730。
  10. 図2に示すように、サンプルあたり10,000個の細胞のデータを一重項ゲート(P2)に記録します。P1 が主要なセル クラスターを囲んでいること、およびこれらのセルのほとんどが P2 一重項ゲートにあることを確認します。未染色のコントロールが、一重項の割合としてCD45-CD144+CD31+細胞が最小限であることを確認してください。
  11. 染色したサンプル中のCD45-CD144+CD31+細胞シングレットの割合を記録します。

4. 内皮細胞の倍加時間と細胞増殖(図3)

  1. 継代2と3で、血球計算盤を使用して各サンプルの生存可能なhSATMVECの数を数えます。各セルカウントの日時を記録します。
  2. これらの点間の母集団の倍増の数を、倍増時間 = (持続時間 x log(2))/(log (最終濃度)-log(初期濃度))の式に従って計算します。
    注:オンライン計算機は https://doubling-time.com/compute.php で入手できます。
  3. 市販の細胞増殖イメージングキットを使用して、hSATMVECの増殖を評価します。24ウェルプレートにウェルあたり20,000細胞の密度でhSATMVECを播種し、完全なEC増殖培地MVに一晩放置して回収します。
  4. 翌日、最終濃度10 μMの完全EC増殖培地MVで希釈した各ウェルに5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)を加え、37°C(5%CO2)で2時間インキュベートします。
  5. EdU含有メディアを取り出し、各ウェルをPBSで2回洗浄します。細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定し、各ウェルをPBSで2回洗浄し、0.5% Triton X-100をトリス緩衝生理食塩水(TBS)緩衝液(TBS)バッファーに500μL加えます。室温で20分間インキュベートします。
    注:これにより細胞膜が透過し、Alexa Fluor 488標識アジドが細胞に侵入できるようになります。
  6. Alexa fluor 488ラベル付きアジドカクテルは、ウェル数に応じて、製造元の指示に従って準備します(6を参照)。各ウェルをPBSで2回洗浄した後、100 μLのAlexa fluor 488標識アジドカクテルを加え、光から保護されたRTで30分間インキュベートします。
    注:Alexa fluor 488で標識されたアジドカクテルは、クリック反応でEdUと反応します。
  7. Alexa fluor 488ラベル付きアジドカクテルを取り出し、PBSで2回洗います。ウェルあたり500 μLのヨウ化プロピジウムを添加し、室温で20分間インキュベートします。
    注:このステップでは、核(増殖性および非増殖性の両方)を赤く対比染色します。
    ヨウ化プロピジウムを除去し、PBSで2回洗浄し、各ウェルを500 μLのPBSに残してイメージングします。
  8. 488 nmのアジドに対して495/519 nmの励起/発光で、10倍の倍率で4つの高倍率フィールドの各ウェルをイメージングします( 図3Cを参照)。
    注:図中の画像は、生細胞解析システムを使用して、倍率10倍、露光時間800msで撮影されました。
  9. 増殖細胞の数をカウントし(緑)、各高出力フィールド内の全細胞の割合(%)で表します(ウェルあたり平均4領域)。

5. 内皮細胞管形成

  1. マトリゲル(基底膜マトリックス;BMM)を氷の上で一晩解凍します。翌日、プレートを氷上に置き、必要に応じて24ウェルプレートの各ウェルに160 μLのBMMを加えます。プレートを傾けて、BMMで各ウェルを完全にカバーします。プレートを5% CO2 を入れた37°Cのインキュベーターに置き、細胞を調製しながらセットします。
  2. hSATMVECをウェルあたり100,000細胞(培地1mL中)で播種します。ウェルの側面でピペットを動かし、マトリックスが外れないようにゆっくりとピペットするように注意してください。プレートを5%CO2 とともに37°Cで4時間インキュベートします。
    注意: この時点で、プレートを画像化する準備が整いました。10倍の倍率で生細胞解析システム上での位相イメージングの結果と図は、5つの異なるウェル領域で使用されました( 図3Dを参照)。
  3. 各高出力フィールド内のチューブ全体の数をカウントし、各サンプルの平均値を計算します。

6. hSATMVECのインスリン刺激

  1. hSATMVECを6ウェルプレートで37°C、5%CO2で培養します。コンフルエントになったら、完全な内皮細胞増殖培地MVを取り出し、PBSで2回洗浄します。
  2. 500 μLの血清飢餓培地(サプリメントを含まない内皮細胞増殖培地MV)を各ウェルに加え、5% CO2 を用いて37°Cで4時間インキュベートします。この間に、血清飢餓培地で調製したインスリン濃度の増加(0〜150μM)の500μLアリコートを調製します。.
  3. 血清を4時間飢餓状態にした後、ウェルから培地を取り出し、各ウェルに1 mLのインスリン含有培地(濃度が増す)を加え、5% CO2で37°Cで10分間インキュベートします。
  4. 冷たいPBSで2回洗浄した後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むタンパク質溶解バッファー100 μLを細胞のタンパク質溶解に添加します。BCAアッセイを用いてタンパク質を定量します。
    注:以下で説明する実験では、細胞溶解物を氷浴中で30分間インキュベートし、20,000 x g で15分間遠心分離しました。電気泳動に先立ち、タンパク質サンプルを煮沸して、タンパク質を95°Cで5分間変性させました。タンパク質をNuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelで分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写しました。イムノブロット分析は、関連するリン酸化タンパク質抗体および総タンパク質抗体(製造元の指示に従って)を使用して、標準プロトコルに従って実施しました。適切なIg/HRP二次抗体を使用して一次抗体を検出しました(製造元の指示に従って)。タンパク質のレベルは、各サンプルのバンドの強度に基づくデンシトメトリーを使用して定量化しました。ß-アクチンは、適切な場合、ローディング制御として使用されました。

7. hSATMVEC-脂肪細胞共培養のセットアップ(図4)

注:以下の結果では、単一の男性白人ドナーからの継代2で市販のヒト白色皮下前脂肪細胞をすべての脂肪細胞アッセイで使用しました。プレアプリアドポサイトは、最初にベンダー提供のバイアル(継代0)から、クライオSFM凍結培地を含む12のクライオバイアル(継代1)に増殖しました。

  1. 各24ウェル共培養プレートには、前駆脂肪細胞のクライオバイアルが1つ必要です(継代1)。各バイアルとプレートを、12〜15 mLの温かいPGM-2培地(10% FBS、30 μg/mL L-グルタミン、および15 ng/mL GA-1000 SingleQuotsを含む)を含むT75フラスコに急速に解凍します。90%がコンフルエントになるまで、3日ごとにメディアを交換します。
  2. 90%がコンフルエントになったら、ヒトの白い皮下前脂肪細胞をPBSで洗浄し、1 mLのトリプシン/ EDTA溶液(0.25%)を追加します。.室温で2分間放置し、光学顕微鏡で剥離を確認します。23 mLのPGM-2培地を添加してトリプシン/EDTAを中和し、24 mLのプレアプリアドポサイト懸濁溶液を調製します。
  3. 1 mLの懸濁したヒト皮下白色プレアプリアドサイト溶液を24ウェル共培養コンパニオンプレートの各ウェルに入れ、コンフルエント(通常2〜3日)まで成長させます。
  4. コンフルエントまで成長しながら、前脂肪細胞分化培地(PDM)を調製します。PDMを調製するには、インスリン、デキサメタゾン、インドメタシン、およびイソブチル-メチルキサンチンの独自の混合物をPGMベース培地に添加して、2倍のPDMストックを作成します。2x PDMをPGMで1:1の比率で希釈して、1x PDMを作成します。
  5. コンフルエントになったら、培地を各ウェルに1 mLの1x PDM培地に変更することにより、ヒト皮下白色前駆脂肪細胞を分化します(0日目)。ヒト皮下白色前駆細胞を37°C、5%CO2 で10日間(培地交換なし)、完全に分化させるため、放置します。光相顕微鏡を使用して分化をモニターします( 図4Bを参照)。
    注:分化した脂肪細胞は継代できず、10日目から12日目までのアッセイに使用できます。脂肪細胞の分化は、レプチン、アディポネクチン、およびPPAR-γのmRNA増幅によって測定できます。
  6. 分化の6日目に、トランズウェルインサート(0.4 μMメンブレン)上の500 μL完全EC増殖培地MVに、インサートあたり5 x 104 細胞の密度でhSATMVECを播種します。トランズウェルインサートを500 μLの完全EC増殖培地MV()を含むウェルに入れ、5% CO 2で37°Cでコンフルエンスまで増殖します。
  7. 10日目に、脂肪細胞が完全に分化したら、各ウェルからPDM培地の半分を取り出し、自身の培地(ECGM-MV)にコンフルエントhSATMVECを含むトランズウェルインサートを各ウェルに移します( 図4Aを参照)。
  8. 細胞を24時間共培養した後、トランズウェルインサートを取り出し、脂肪細胞の機能を評価するアッセイを実施します。
    注:この時点で、脂肪細胞は、必要に応じてタンパク質またはRNAの分離のために溶解することもできます。

8.脂肪細胞2-(N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ)-2-デオキシグルコース(2-NBD)-グルコースの取り込み

  1. 共培養で24時間後、hSATMVECを含む細胞インサートを取り出します。次に、各ウェルの培地に2-NBD-グルコースを添加して、最終濃度を20 μMにします。光から保護し、5% CO2で37°Cで30分間インキュベートします。
  2. PBSで細胞を2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の500μLを使用して脂肪細胞を室温で15分間固定します。
    注:この時点で、脂肪細胞を画像化する準備が整いました。含まれている図では、位相イメージングと緑色光(励起440-480 nm/発光504-544 nm)が、4つの高倍率フィールド( 図4Cを参照)で10倍の倍率で生細胞解析システムで得られました。
  3. ImageJ (または他の同様のソフトウェアパッケージ) のしきい値を使用して、全領域の緑の割合を定量化することにより、グルコース取り込みのレベルを定量化します。

結果

hSATMVECの純度と表現型
対照患者(心血管代謝疾患の既往歴がない人)から単離されたhSATMVECは、フローサイトメトリーで99.5%のCD31+CD144+CD45-でした(図2)。単離されたhSATMVECは、ECに典型的な丸石のような形態をしていました(図3A)。hSATMVECの平均集団倍加時間は56.6時間±8.1時間(平均±SEM、n = 10)であり(図3B)、hSATMVECでの活発なDNA複製は細胞増殖イメージングキットを使用して確認されました(図3C)。

hSATMVECは、機能しているMVECのように振る舞い、マトリゲル島でチューブを形成しました(図3D)。インスリンシグナル伝達Akt-eNOS経路に関与する主要なタンパク質の相対的発現を 図3Eに示します。eNOとAktはどちらも、β-アクチンに正規化されたリン酸化タンパク質/総タンパク質の比率として表されるインスリン誘導リン酸化の増加を示しました(図3E)。

hSATMVEC-脂肪細胞共培養
hSATMVEC-脂肪細胞共培養の実例となるモデルを 図4Aに示します。ヒトの皮下白色前駆脂肪細胞がより分化するにつれて、脂質液胞(図4B)の発達に気付くでしょう。これは、オイルレッドO染色(図4B)によって定量化できます。

図 4Cに示すのは、20μM 2-NBDグルコースと30分間インキュベートした後の分化脂肪細胞の分化した脂肪細胞の位相コントラストおよび蛍光イメージング(励起440-480 nm/蛍光504-544 nm)です。グルコースの取り込みは、全細胞面積に対する緑色の領域の割合を測定することで定量化できます。

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図1:hSATMVECの採取と処理を示す概略図 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:培養hSATMVECのフローサイトメトリー解析の典型的な出力 (A)特定の細胞集団密度の周りの培養hSATMVECのゲーティング(赤枠)を示す側方散乱領域(SSC-A)と前方散乱領域(FSC-A)の散布図。(B)前方散布幅(FSC-Width)とFSC-Aの散布図(赤枠)は、特定の細胞集団密度の周りの培養hSATMVECのゲーティングを示しています。(C)CD45-FITCに対するゲート細胞の蛍光を示すヒストグラム。(D)CD144-PE(x軸)とCD31-PerCP(y軸)の蛍光強度の散布図。(E)CD144-PEに対する依存性細胞の蛍光を示すヒストグラム。(F)CD31-PerCPに対する依存性細胞の蛍光を示すヒストグラム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:hSATMVECの表現型 (A)hSATMVECの合流点付近の光顕微鏡画像で、石畳のような外観を示す。(B) hSATMVEC doubling time - HATECの光学顕微鏡を24時間間隔で撮影し、細胞増殖の程度を実証。(C)hSATMVECの増殖。対照被験者からのヨウ化プロピジウムとEdU / Alexa-fluor 488を使用したhSATMVECの蛍光顕微鏡。(D)対照被験者からのhSATMVECチューブ形成(4倍拡大で撮影された画像)。(E)HATECのインスリン刺激 - リン酸化Akt(セリン473)から総Akt(左パネル)、リン酸化eNOS(セリン1177)から総eNOS(右パネル)への相対的発現を示し、インスリン濃度の増加とB-アクチンに標準化されたウェスタンブロット。データはSEM±平均として表示され、サンプルサイズは各パネルの下にあります。略語:5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)、ヒト皮下脂肪組織微小血管内皮細胞(hSATMVEC)、平均の標準誤差(SEM)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:hSATMVEC-脂肪細胞共培養 (A)hSATMVEC-脂肪細胞共培養の模式図。(B)脂肪細胞の分化。左のパネルは0日目のプレアディポサイトを示し、右のパネルはPDMの添加後の10日目の分化した脂肪細胞を示しています。下の図は、オイルレッドO.(C)グルコース取り込みアッセイで染色した脂肪細胞および前駆脂肪細胞に保存された脂質の量を示しています。左のパネルは、20 μM の 2-NBD グルコースと 30 分間共培養およびインキュベーションした後の脂肪細胞の位相イメージングを示しています。右のパネルは、グルコースの取り込み量(全面積の緑の割合)を定量できる緑色のイメージングを示しています。±略語:10日目(D10)、ヒト皮下脂肪組織微小血管内皮細胞(hSATMVEC)、前脂肪細胞分化培地(PDM)この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表1:フローサイトメトリーのためのカクテルの染色。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この研究では、CIED の定期的な移植中に SAT から採取した hSATMVEC を分離する手法について説明します。単離されたhSATMVECは高純度で、EC特異的な膜貫通タンパク質CD144およびCD31を発現し、白血球CD45の有意な発現を示さないことを実証しました。さらに、再現性と信頼性のある方法で、単離されたhSATMVECが増殖し、インスリンシグナル伝達と血管新生に関与する細胞内機構の研究に実験的に使用できることを示します。それらを単独で培養できるだけでなく、hSATMVEC-脂肪細胞のクロストークを研究するために共培養にも使用できます。

基礎研究やトランスレーショナル研究に使用される内皮細胞は、一般的に大動脈やヒトの臍帯静脈、微小血管系などの大きな血管から供給されます。これらの情報源は両方とも、それぞれ独自の制限を持っています7,8。大きな血管からの内皮細胞は、アクセスが困難(大動脈組織の場合)または新生児組織に由来し、生理機能および環境曝露が異なる可能性がある9。CIED移植中に採取した組織から単離された内皮細胞を使用することで、特定の現実世界の患者グループ内での細胞生理学の調査と実験が可能になります。CIEDは、徐脈性不整脈、心不全、心室性頻脈性不整脈の一次および二次予防の患者など、さまざまな適応症に埋め込まれています10。これらの患者は、糖尿病、肥満、冠動脈疾患など、複数の併存疾患を抱えていることが多く、これらは心血管研究の世界的な主要な焦点となっています11,12,13。さらに、この論文の実例となるデータは制御患者に関連していますが、これらの手法を適用して、進行性心不全および/または2型糖尿病患者を含むさまざまな患者からSATMVECを分離および研究しました。

まれではありませんが、細胞単離を試みた後、hSATMVECの収量が不十分になるという問題に遭遇します。このリスクは、SATMVECを分離するためにSATの開始量を増やすことで大幅に減らすことができます。さらに、これはSATで心血管代謝疾患、特に糖尿病の人々からより頻繁に遭遇します。

この手法の1つの制限は、単離されたhSATMVECが限られた数の通過しか経つことができないことです。私たちの経験では、Passage 5以降、患者の表現型に関係なく、hSATMVECの増殖は著しく遅くなります。さらに、この手法を使用して単離されたhSATMVECは、人口がまばらすぎるとうまく増殖しません。したがって、hSATMVECは1:6を超える比率で通過しないことをお勧めします。1ページに記載されているように。私たちは、液体窒素で保存したhSATMVECを最大4年間解凍し、再蘇生させることに成功しており、私たちの経験では、より低い継代数で凍結保存した方が蘇生の可能性が高くなります(通常、hSATMVECは2番で凍結保存します)。

CIED挿入時に採取された組織は自由に入手でき、患者に害を及ぼすことなく採取できます。したがって、これらの患者グループからの内皮細胞のアクセスが容易で比較的非侵襲的な供給源は、標的研究を実施する上で大きなメリットがあります。この論文の代表的な画像は「対照」患者(つまり、CIED移植の適応があるにもかかわらず、心不全や糖尿病の診断を受けていない患者)から得られたものですが、心不全、糖尿病、およびこれらの病状の組み合わせを持つ患者からSATMVECを分離、培養、共培養することに成功しました。さらに、これらの技術は骨格筋を含む他の微小血管床にも適用でき、現在、骨格筋MVECと筋細胞のクロストークのモデルを最適化しています。

hSATMVECは、CIED挿入時に採取したヒト組織から単離することができ、心血管代謝疾患の有無にかかわらず、微小血管機能障害や内皮細胞-脂肪細胞のクロストークを実験的に使用するのに十分な純度です。

開示事項

SSは、アストラゼネカ社から非財政的支援、講演料、謝礼を受けています。RCはヤンセン・オンコロジー社から講演料を受領しています。OIBはノバルティスからスピーカー料を受け取っています。

謝辞

Biotechnology and Biological Sciences Research Councilの助成金(BBSRC BB/R000352/1)の支援を受けて、フローサイトメトリー施設を使用してくださった生物科学部バイオイメージング学科(英国リーズ大学)に大変感謝しています。SSは、British Heart Foundation Clinical Research Training Fellowship(FS/CRTF/20/24071)の支援を受けました。CLは、British Heart Foundationの博士課程の学生(FS/19/59/34896)の支援を受けました。LDRは、Diabetes UK RD Lawrence Fellowship賞(16/0005382)によって支援されました。RMCは、British Heart Foundation Intermediate Clinical Research Fellowship(FS / 12/80/29821)の支援を受けました。MTKは、英国心臓財団の心臓血管および糖尿病研究の教授(CH / 13/1/30086)であり、英国心臓財団のプログラム助成金(RG / F / 22 / 110076)を保持しています

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
170L CO2インキュベーターGSバイオテック170G-014
2-NBDG(2-(N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ)-2-デオキシグルコース)InvitrogenN13195
4% PARAFIX緩衝組織学的固定剤VWRケミカルズPRC/R/38/1
Akt(tAkt)ウサギ  1:1000細胞シグナル技術9272
BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm、オレンジ、50個入りMedisave393230
Bovine Serum Albumin solution、7.5%MerckA8412-100ML
CD144 (VE-Cadherin) 抗体、抗ヒト、PE、REAfinityMiltenyi Biotec130-118-495
CD31 抗体、抗ヒト、PerCP-Vio 700、REAfinityMiltenyi Biotec130-110-811
CD31 MicroBead Kit、ヒト、1 kitMiltenyi Biotec130-091-935
CD45 抗体、抗ヒト、FITC、REAfinityMiltenyi Biotec130-110-769
細胞抽出BufferInvitrogenFNN0011
Centrifuge 5804 REppendorf5805000060
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dyeInvitrogenC10337Cell Proliferation Imaging kit
Collagenase/Dispase, 500 mgRoche/Merck11097113001
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrixコーニング 354230基底膜マトリックス
コーニング 100 mm TC 処理カルチャーディッシュコーニング 
Costar 24ウェルクリアTC処理マルチウェルプレート、個別包装、滅菌コーニング 3526
Costar 6ウェルクリアTC処理された複数のウェルプレート、個別に包装された滅菌コーニング 3516
CytoFLEX S– 4レーザーフローサイトメーターベックマン
死細胞除去キットMiltenyi Biotec130-090-101
ダルベッコ&プライム;S Phosphate Buffered SalineMerckD8537-500ML
EASYstrainer Cell Sieve for 50 mL tubes, 70 & micro;m メッシュ、ブルー、滅菌、50/個入りGreiner Bio-One542070
内皮細胞増殖培地 MVPromoCellC-22020
エッペンドルフ セーフロック マイクロ試験管メルクEP0030120094
エチレンジアミン四酢酸溶液メルクE8008-100ML
ファルコン 24 ウェル TC 処理細胞ポリスチレン透過性サポート コンパニオンプレート、蓋付き、滅菌、1 /パック、50 /ケースアップルトンウッズCF537
ファルコン透過性サポート 24 ウェルプレート用 0.4 & マイクロ;m 透明 PET メンブレン、滅菌済み、1/パック、48/ケースAppleton WoodsCF521
Freezing Medium Cryo-SFMPromoCellC-29912
ゼラチン溶液、2% 水MerckG1393-100ML
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)、100mLFisher Scientific11570486
Gibco TrypLE Select Enzyme (1x)、フェノールレッドなしFisher Scientific
ハンクス&プライム;バランス塩溶液メルクH6648-500ML
ヒト皮下前脂肪細胞ロンザPT-5020
インキュサイトズームエッセンバイオサイエンス生細胞分析システム
インスリン溶液 ヒトメルクI9278-5ML
LS カラム、25/個入りミルテニー バイオテック130-042-401
MACS マルチスタンドMiltenyi Biotec130-042-303
MACS 組織保存ソリューションMiltenyi Biotec130-100-008
MACSmix チューブ ローテーターMiltenyi Biotec130-090-753チューブ ローテーター
MS カラム、25/個入りMiltenyi Biotec130-042-201
NuPAGE 4–12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOX
OctoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109
PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKit LonzaPT-8002
Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000Cell Signalling Technology9570
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit  1:1000Cell Signalling Technology4060
プレセパレーションフィルター30µm, 50/pkMiltenyi Biotec130-041-407
ヨウ化プロピジウム (PI)/RNase 染色液細胞シグナル技術4087
QuadroMACS セパレーターMiltenyi Biotec130-090-976
メス 使い捨て滅菌スタイル 10VWRI501
スクリューキャップチューブ、15 ml、(LxØ): 120 x 17 mm、PP、印刷付きSarstetd62.554.502
スクリューキャップチューブ、50 ml、(LxØ):114 x 28 mm、PP、印刷付きSarstedt62.547.254
スクリューキャップチューブ、50 ml、(LxØ):114 x 28 mm、PP、印刷付きSarstetd62.547.254
Total eNOS Mouse 1:1000BD Biosciences610297
Triton X-100、BioUltra、分子生物学用Merck93443-500ML
β-アクチン(C4)マウス1:5000クルーズバイオテクノロジー SC-47778
43016712563029サンタ

参考文献

  1. Bierhansl, L., et al. Central role of metabolism in endothelial cell function and vascular disease. Physiology. 32 (2), 126-140 (2017).
  2. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), a006429(2012).
  3. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int J Biol Sci. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  4. Brown, O. I., Bridge, K., Kearney, M. T. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases in glucose homeostasis and diabetes-related endothelial cell dysfunction. Cells. 10 (9), 2315(2021).
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  7. Bouïs, D., et al. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
  8. Ades, E. W., et al. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99 (6), 683-690 (1992).
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