Name: 複雑な生体試料から選択的グリコシル化ペプチドを豊かにするためにレクチンHPLC法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: 学ぶレクチンHPLC法を用いてヒト血漿からグリコシル化ペプチドを選択的に濃縮する手法。トリプシン消化と質量分析を組み合わせ、バイオマーカー発見に有用なグリコペプチドプロファイルを解析できます。

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この作品は、がんイニシアティブ、5U24CA126477 - 04の臨床プロテオミクス技術によってサポートされていました。

1）レクチンコンジュゲートPOROSカラムを準備します。 <ol><li> 1.2 - 手順1.1の間にPOROS - ALのビーズの吸入を防ぐためにマスクを着用します。 POROSビーズの所望の量（100 mgのbeads/300μlの最終容量）を秤量し、清潔なエッペンドルフチュー​​ブに移す。 </li><li> 1 mLのリン酸緩衝食塩水（PBS）を加えてビーズを洗浄してください。 3分、最高速度で遠心の遠心分離によってペレットのビーズ。上清を除去し、洗浄を繰り返します。 </li><li>非抱合型レクチンの所望の量（1 - 4 mgの/ 200μlのビーズ）を秤量し、清潔なエッペンドルフチュー​​ブに移す。 5を形成するためにPBSを追加 - 20 mg / mLのソリューション。このソリューションの準備25μlの。 </li><li> POROSビーズに、残りのレクチン溶液を移す。最終濃度50mMに、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを追加。ロッカー上にチューブを置き、一晩室温で反応する。 （注：シアノ水素化ホウ素ナトリウムは毒性があり、ドラフト内で処理する必要が汚染された廃棄物は適切に処分する必要があります。。） </li><li>ステップ1.2のようにペレットPOROSビーズ。上清を除去し、後の共役ソリューションとして保存。 </li><li> 1 mLの焼入れバッファー（1 Mトリス- Cl、pH7.4）でビーズを洗浄する。ステップ1.2と安全にペレットのビーズは、上清を捨てる。 </li><li> 1 mLの焼入れBufferでPOROSビーズの残りの反応部位をブロックする。最終濃度50mMに、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを追加。ロッカー上にチューブを置き、30分間室温でインキュベートする。 </li><li>ステップ1.2のようにペレットのビーズと上清を捨てる。 </li><li> 1 mLの1 M NaClでビーズを洗浄してください。ペレットは、ビーズと上清を捨てる。 5回の洗浄の合計4回を繰り返します。ビーズは今パックする準備が整いました。 </li><li> POROSビーズに結合させたタンパク質の量を決定するために、事前にコンジュゲートとポスト共役レクチンソリューションのタンパク質濃度のアッセイを行います。濃度の違いは、ビーズに結合させたタンパク質の量です。ビーズ体積あたりの結合タンパク質の量は、ビーズ上のレクチンの濃度に等しい。ターゲットのレクチンの濃度は2 -20 mg / mLの間です。 </li></ol> 2）PEEK製カラムにレクチンコンジュゲートPOROSビーズパッキング<ol><li>包装システムを組み立て（説明が続く）と金属製のリングスタンドでそれをサポートしています。パッキングシステムは、エンドカラムカプラー1、フリット、カラム（2 × 50 mm）の、最後のカラムカプラ2、列のコネクタ、エンドカラムカプラー3カラム（4.5 × 50 mm）を、圧力制限器、下から上に、構成されています最後のカラムカプラ4とエンドフィッティング。上部の列には、梱包材のための貯水池として機能します。 </li><li>バッファの任意のボリューム（10mMトリス緩衝液、pH7.4、150mM塩化ナトリウム、10mMの塩化カルシウム、10mMの塩化マグネシウム）でPOROSビーズを再懸濁します。つの列（〜200μlのベッドボリューム）を梱包の場合、400μlのBuffer Aに懸濁する</li><li>アッパーカラム（リザーバー）に共役POROSビーズを転送する。バッファーがカラムの上部に到達するまで貯留するバッファに追加します。ゆっくりとカラムに気泡を回避しよう、列の一番上にエンドフィッティングを置きます。 HPLCシステムに上部のカラムのエンドフィッティングを接続します。 </li><li>システムを介してバッファを流してカラムをパック。 0.5mL /分の流速で始まります。 4mL /分または最大圧力（3000 psi）のどちらかに達するまで、0.5mL /分毎分によって流量を増加させる。バッファの少なくとも35 mLをカラムを通過するまで、可能な最大流量で継続する。 </li><li>ポンプの電源をオフにし、カラムの圧力が&lt;20 psiにドロップすることができます。 </li><li>ゆっくりと、上から、包装システムを分解。最後のカラムカプラ2に達したときに、慎重に取り外します。いくつかのパックされた材料は、塔頂から押出されるべきである。かみそりの刃または類似の鋭いエッジで、静かに列の最上部でさえあるビーズ表面を残して、押し出しビーズを拭き取ってください。これを行う間、ビーズに圧力をかけないでください。 </li><li>リングスタンドから充填したカラムを外します。新しいエンドのカプラーに新しいフリットを置き、オープン（旧トップ）コラムの端にフリット/エンドカプラーでこれを接続するための充填カラムを裏返します。 </li><li>適切な列にラベルを付けます。それを使用する準備が整いました。使用しないときは、列を4で0.02％のアジ化ナトリウム℃で6ヶ月までのCを含むPBSに格納されていない可能性があります。 </li></ol> 3）プログラムのHPLC法<ol><li>あなたのHPLCのプログラミングの詳細については、製造元のソフトウェアの仕様に応じて異なります。我々はMichromパラダイムMG4 HPLCを使用してください。このマシン上で、メソッドは画面の上部にある&quot;設定&quot;タブの下に構築され、アクセスされます。次のメソッドをプログラム： <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>タイム</td><td>流量（μL/分） </td><td> ％ </td><td> ％のB </td></tr><tr><td>午後12時</td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td>午前9時00分</td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 9時01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13時50分</td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td>夜01時51分</td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td>午前19時50分</td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> 10mMトリス緩衝液（pH7.4）、150mMの塩化ナトリウム、10mMの塩化カルシウム、10mMの塩化マグネシウム：バッファ バッファーB：0.5 M酢酸 UV検出器は、0:00から午前19時50分に280 nmで読み込むようにプログラムする必要があります。 。50 AU - y軸は低吸光度レベルが、 例えば 、0を検出するために調整する必要があります。 </li><li>オートサンプラが使用可能な場合は、フラクションコレクションのための次のスケジュールをプログラムする。クロマトグラフィーを行うときに示されるようにそうでなければ、手で画分を集めた。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>分数</td><td>試料注入から収集するまでの遅延</td><td>コレクションの持続時間（分） </td></tr><tr><td>フロースルー</td><td> 2.8 </td><td> 4.1 </td></tr><tr><td>バインド</td><td> 9 </td><td> 2.6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4）HPLC用サン​​プルを調製<ol><li>このプロトコルで使用する前に、ヒト血漿は、MARSの列（;サンタクララ、カリフォルニア州アジレント）を用いて14最も豊富なタンパク質の枯渇してください。枯渇した血漿、ヒトラクトフェリンおよび酵母インベルターゼは、前述の1としてトリプシン消化し ​​、脱塩し、個別にする必要があります。 </li><li>レクチン特異ラクトフェリン標準を準備するには、第3の方法を使用してAALまたはSNAの列のいずれかを介してラクトフェリンをトリプシン消化50μgの上でクロマトグラフィーを行う。結合画分は、レクチン固有のラクトフェリンの糖ペプチドが含まれます。パート6のようにパート4.4のようなサンプル、および脱塩を中和する。得られた試​​料の使用準備が整う1 mLの緩衝液Aでサンプルを再懸濁します。 </li><li> 3つの実験が実行される複製。三人複製用にサンプルを準備するには、30μlのMARS枯渇、トリプシン消化、プラズマ同等物（PE）のトリプシン消化インベルターゼとレクチン特異ラクトフェリン（どちらAAL - LACまたはSNA - LAC）を1μlの3 pmolのを追加。 PEは、処理血漿（MARS欠乏およびトリプシン消化）の所定量が由来するnon-processed/intact/originalプラズマの体積として定義されています。 330μlの最終容量に到達するためのサンプルにバッファに追加します。 </li><li>溶出液を収集するサンプルバイアルに、中和バッファー（1 MトリスpH8.0）を追加します。作業対象とバイアルの数とボリュームは、オートサンプラの制約に依存するであろう。 MG4パラダイムの場合は、1バイアルは、フロースルーと二人溶出液を収集する収集します。それは、約1.5 mLのトリス緩衝液で溶出液を1 mLを中和するために必要になります。ターゲット中和pHが7.0から8.0であり、pH指示薬の紙でテストのテストの最終pH。 </li></ol> 5）クロマトグラフィーを実行<ol><li>続くすべてのブランクとサンプルの実行は、パート1に記載の方法を使用します。列とバッファが使用中に室温でいます。バッファーは室温で保存されている間、列は、4℃で保存されています。 </li><li> HPLCシステムのいずれかにAALまたはSNAレクチンカラムを取り付けて2行の空のメソッドを（のみバッファを注入する）を実行します。レクチンカラムはレクチン固有のラクトフェリン（パート2）に対応していることを確認してください。 </li><li> HPLCの実行7の合計のために、各注入試料との間に空白を注入し、3つのプラズマのサンプルをクロマトグラフ。ブランクランからの画分は、収集する必要はありません。 </li></ol> 6）脱塩画分を集め各分画のために次のように1つ1 mLのウォーターズオアシスHLB SPEカートリッジを使用します。 <ol><li>真空マニホールドに必要なカートリッジの数を取り付けます。 </li><li> 1％ギ酸（ - 20 lnHgマニホールド上に真空計が5をお読みください）​​に1 mLの80％ACNで各カートリッジを濡らす。 </li><li> 1.5 mLの0.1％ギ酸（ - 20 lnHgマニホールド上に真空計が5をお読みください）​​でカートリッジを平衡化する</li><li>つのカートリッジの上に一つのサンプルのボリューム全体をロードする（マニホールド上に真空ゲージは2をお読みください - 2.5 lnHgを、と流速は1 mL /分を超えないようにしてください） </li><li> 3 × 1 mLの0.1％ギ酸でカートリッジを洗浄してください（マニホールド上に真空計が5をお読みください - 20 lnHgを） </li><li> 0.1％ギ酸で1 × 1 mLの80％アセトニトリルで標識したエッペンドルフチュー​​ブに溶出ペプチド/糖ペプチド。シングルコレクションチューブが各カートリッジに使用されるべきである - （2.5 lnHgを、そして流速は1mL /分を超えないようにしてくださいマニホールド上の真空計は、2をお読みください。）。 </li><li>それぞれのコレクションチューブに60μlの0.5 M炭酸水素アンモニウムを添加することにより溶出液を中和する。ターゲットneutralized pHは7.0から8.0です。pH指示薬の紙でテスト最終pH。 </li><li> 〜2時 ​​間@ 35℃のために（ 例えば、サーモSavantのSpeedVac）真空遠心分離でそれらを実行することによって溶出されたペプチド/〜50μLの糖ペプチドを濃縮する</li></ol> 7）PNGase F消化<ol><li>それを確実にするために、テストサンプルのpHは7.0の間です - 8.0。必要に応じて、pHを上げるために50 mM重炭酸アンモニウムを追加。それは50〜100μlの間になるまでであれば、最終的なサンプル量は&gt; 100μlを、speedvacサンプ​​ルです。 </li><li> 37℃で一晩各サンプルチューブとインキュベートする0.5μlの（250 U）グリセロールフリーPNGase Fを追加します。 </li></ol> 8）郵便番号のヒントのサンプル<ol><li> PNGase F消化サンプルから始めて、次のようにそれぞれをziptip。 </li><li> 10μlの100％アセトニトリル、10μlの80％アセトニトリル、0.1％ギ酸が続くとウェットziptip。 </li><li> 20μlの0.1％ギ酸でziptipを平衡化させます。 </li><li> ziptipの行列を上下に10回、それをピペッティングすることによりziptipにサンプルをロードします。 </li><li> 10μlの0.1％ギ酸、5回ピペッティングしてziptipを洗ってください。 </li><li> 10μlの80％アセトニトリル、0.1％ギ酸できれいなエッペンドルフチュー​​ブにサンプルを溶出させる。 </li><li>溶出を繰り返すと、同じチューブに次の10μlを加える。 </li><li> &lt;2μlのためにサンプルをSpeed​​vac。 </li><li> 20μlの0.1％ギ酸でサンプルを再懸濁します。現在、サンプルLC-MS/MSによる分析のための準備が整いました。 </li></ol> 9）代表的な結果： 20 mg / mlの - POROSの接合は、通常2の範囲内で、ビーズレクチン濃度が得られます。これは、アフィニティークロマトグラフィーに最適です。 トリプシン消化MARS欠乏ヒト血漿のレクチンクロマトグラフィーが一般的に結合画分の糖ペプチドを豊かに。糖ペプチドがPNGase前LC-MS/MSにF -扱われるように、それらはアスパラギンがに変換されているN -結合コンセンサス配列、NXS / T（Xは任意の残留物がプロリンである）、を有するペプチドとして同定されていますこれらの特性を持つPNGase Fのペプチドの作用によってアスパラギン酸は、脱グリコシル化ペプチド（または&quot;deglycopeptides&quot;）とみなされます。結合画分に回収されたペプチドの30〜50％がdeglycopeptidesであるのに対し、平均でAALまたはSNAクロマトグラフィーからのフロースルー（FT）割合は、2〜4％のdeglycopeptidesが含まれています。通常は、QSTARエリートを使用して、1000年から1300年のペプチドは、FTの割合で識別される、および200から400ペプチドを結合画分で識別されます。二つ以上の別個のインベルターゼdeglycopeptidesは、FTフラクションと結合画分（表1）、2つ以上の別々のラクトフェリンのdeglycopeptidesで観察されるべきである。 <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="表1" /> 表1。

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

このプロトコルは糖鎖特異的に糖ペプチドを単離および同定するための迅速な方法を提供する。グリコシル化は、特に開発や病態の間に、生体内で広範囲に変化するにつれ、この手法は、質問の様々な対処するために必要となる場合があります。特に、我々は選択的バイオマーカー探索への第一歩として、癌関連エピトープで変更された糖ペプチドを豊かにする方法を使用しています。

<table><tbody><tr><td>ヒト血漿</td><td></td><td></td><td>院内で調製</td></tr><tr><td>ヒトラクトフェリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>使用前にトリプシン消化を行う</td></tr><tr><td>酵母インベルターゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>使用前にトリプシン消化を行う</td></tr><tr><td>Oass HLB SPEカートリッジ</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>容量 1 cc</td></tr><tr><td>ZipTip ピペットチップ</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore, 10 ml ピペット用 C18</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99%</td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99%</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96%</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98%</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99.7%</td></tr><tr><td>pH指示紙</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>範囲 0-14</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99.9%</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99%</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>カルシウムおよびマグネシウム不含</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>グリセロールフリー</td></tr><tr><td>真空ろ過フラスコ</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>孔径 0.2 mm</td></tr><tr><td>POROS-AL ビーズ</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt; レクチン</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt; アグルチニン</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>シアノホウ素化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>5.0 M 溶液</td></tr></tbody></table>

複雑な生体試料から選択的グリコシル化ペプチドを豊かにするためにレクチンhplc法

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

糖鎖は翻訳後修飾の重要なクラスです。一般的に分泌し、細胞外分子に見られる、糖鎖構造は細胞の内部状態を通知。腫瘍細胞上の糖鎖は、豊富なシアル酸およびフコース部分を持っている傾向がある。我々は、これらの癌関連糖鎖の変異体は、初期段階の疾患の診断を目指したバイオマーカー開発のために利用されることを提案する。したがって、我々は、レクチン、特定の糖鎖構造に結合するタンパク質から形成された親和性のマトリックスでのクロマトグラフィーを組み込んだ質量分析ベースのワークフローを開発しました。それぞれ、シアル酸およびフコースに結合するレクチンニワトコ黒（SNA）とヒイロチャワンタケ（AAL）は、共有結合POROSビーズ（アプライドバイオシステムズ社）に結合し、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）用PEEK製カラムに充填した。 （;アジレントMARS - 14）簡単に言うと、プラズマは、マルチプルアフィニティ除去システム​​を使用してfourteen最も豊富な蛋白質の枯渇した。枯渇したプラズマは、SNAまたはAAL HPLCによるトリプシン消化し、フロースルーと結合した画分に分離した。画分をN -結合型グリカンを除去するPNGaseFで処理し、QSTARのエリートのLC-MS/MSで分析した。データは、マスコットのソフトウェアを用いて分析した。実験的なデザインは、サッカロマイセスセレビシエ-レクチンキャプチャの特異性を監視するために使用されてからポジティブコントロール-フコシル化とシアル酸ヒトラクトフェリンの糖ペプチドとコントロールの高マンノース糖陰性が含まれています。このワークフローの主な機能は、HPLCのフォーマット、それらの脱アミドAsn-Xxx-Ser/ThrのモチーフからキャプチャしたとPNGaseF処理糖ペプチドの正の同定、および糖タンパク質の標準を使用して、品質評価から得られる再現性が含まれています。プロトコル最適化はまた、カラムの容量に、出発物質の最も効率的なキャプチャと溶出バッファーを識別し、完全な脱グリコシル化を確保するためにPNGaseF処理を監視するのに適切な比率を決定するが含まれています。今後の方向性は、乳がん患者と対照個体からのプラズマの質量分析ベースの検出実験を実行するには、このワークフローを使用して含まれています。

レクチン抱合POROSビーズはHPLCに使用した。糖ペプチドの基準は、ポジティブとネガティブコントロールとして役立った。 MARS - 14欠乏、トリプシン消化したヒト血漿をクロマトグラフィー及びフロースルー（FT）と結合した分画はESI-LC-MS/MS分析のために収集された。 FTに比べて糖ペプチドを結合画分に濃縮した。

複雑な生体試料から選択的グリコシル化ペプチドを豊かにするためにレクチンHPLC法

糖鎖は、翻訳後修飾の重要なクラスである。通常、分泌分子や細胞外分子に見られる糖鎖構造は、……をシグナルとして伝達する。

この手順では、ヒト血漿から特異的に糖鎖付加された糖ペプチドを単離します。血漿をトリプシンで消化し、ペプチド、糖ペプチド、および糖ペプチド標準品の混合物を得ます。レクチンクロマトグラフィー用の陽性および陰性コントロールを血漿にスパイクします。サンプルを、高速液体クロマトグラフィーに基づくレクチンアフィニティークロマトグラフィーに供します。使用するレクチンは、それぞれ異なるフコースおよびシアル酸に結合し、ペプチドおよび非標的糖ペプチドはフロースルー分画としてカラムから溶出します。カラムに結合した分画を溶出させるために、酢酸を使用します。これは、特異的に修飾された糖ペプチドを濃縮したものです。こんにちは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の産婦人科・生殖科学科およびサン・ラモア・マススペクトロメトリー・コアファシリティのスーザン・フィッシャー研究室のペニー・ドレイクです。そして、同じくサンダー・ムーア・マススペクトロメトリー・コアファシリティおよびフィッシャー研究室のエリック・ヨハンセンです。本日は、ヒト血漿およびその他の複雑な混合物から糖ペプチドを濃縮するためのレクチンクロマトグラフィーの手順について解説します。当研究室では、この手順を数多くの応用が可能な汎用ツールとして利用しています。例えば、乳がんバイオマーカー探索のワークフローにおいて重要な役割を果たしています。それでは始めましょう。この手順を開始するにあたり、ビーズの吸入を防ぐためにマスクを着用してください。次に、100 mgのporro beadsを計量し、清潔なeinor tubeに移します。1本のカラムを充填するのに、約300 µLのビーズが必要です。さらに、非共役レクチンを計量し、清潔なエッペンドルフチューブに移します。ここではレクチンのSNAおよびA A Lを使用します。PBSをレクチンに加え、5～20 mg/mLの溶液を作成します。このプレコンジュゲート溶液を25 µL分取して取り置いておきます。次に、1 mLのPBSを加え、マイクロ遠心機を用いて最大速度で遠心分離し、porro speedsを洗浄します。3分間後に上清を除去し、洗浄を繰り返します。ここからはドラフトチャンバー内で操作を行い、残りのレクチン溶液を洗浄済みのporro speedsに移します。そして、最終濃度が50 millimolarになるように水素化ホウ素ナトリウムを加えます。水素化ホウ素ナトリウムは毒性があるため、廃棄物は適切に処理してください。密閉チューブをパラフィルムで固定し、室温で一晩ロッカースタッカーに置いて反応させます。レクチンがビーズに一晩結合した後、再度ビーズを遠心分離してペレット化します。上清を除去し、ビーズ上の残りの反応部位をブロックするための後接合溶液として保存してください。まず、pH 7.4の1 M CLを含むクエンチバッファー1 mLを用いて、遠心分離によりビーズを洗浄します。次に、クエンチバッファーと、最終濃度が50 mMとなるように調整した水素化ホウ素ナトリウムを1 mL加えます。チューブをロッカーステアラーに設置し、室温で30分間インキュベートします。クエンチが完了しました。以前と同様に、ビーズを遠心分離します。上清を除去し、1 Mの塩化ナトリウム1 mLを用いてビーズを5回洗浄し、その都度上清を廃棄します。コンジュゲーション前後のレクチン溶液に対してタンパク質定量分析を行い、その差からポロビーズにコンジュゲートされたタンパク質量を決定します。目標とするレクチン濃度は、ビーズ量あたりにコンジュゲートされたタンパク質量として計算し、2〜20 mg/mLの間とします。コンジュゲート済みporroビーズをカラムに充填する準備が整いました。ビーズをカラムに充填するために、金属製リングスタンドで支持された2本のカラムからなる充填システムを組み立てます。上部のカラムは充填剤のリザーバーとして機能します。パッキングシステムは、下から順に、圧力制限器、ターゲットカラムの端カラムカプラー1、端カラムカプラー2、カラムコネクター、端カラムカプラー3、リザーバーカラム、端カラムカプラー4、およびエンドフィッティングで構成されています。次に、300 µLのporro speedsを600に再懸濁します。1回分（1カラム分）をパッキングするために、ビーズをカラムの上部リザーバーに移します。カラムの頂点に達するまでバッファAを加えます。エンドフィッティングをカラムの上部に静かに設置します。カラム内での気泡の混入を避けるようにします。上部カラムのエンドフィッティングをHPLCシステムに接続します。バッファーAまたはPBSをシステム内に流し、カラムを充填します。流速0.5 milliliters per minuteで開始します。流速を1分ごとに0.5 milliliters per minuteずつ上げ、4 milliliters per minuteに達するか、または最大圧力に達するまで継続します。その後、少なくとも35 millilitersのバッファーがカラムを通過するまで、可能な最大流速で維持します。完了後、ポンプの電源を切り、カラムの圧力が 20 PSI 以下に下がるまで待ちます。カラムの充填が終わりましたら、上部から順に充填システムをゆっくりと分解してください。末端のカラムカップラー2に到達したら、慎重に取り除きます。カミソリを使用して、カラム上部から突き出ている充填物を静かに拭き取ります。この際、ビーズに圧力をかけないようにしてください。その後、リングスタンドから充填カラムを取り外します。新しいフリットを新しいエンドカプラーに装着し、充填したカラムを反転させて、オープン側にあるFRプラスエンドカプラーに接続します。これで、HPLCランに使用する準備が整いました。使用しない場合は、0.5% sodium azideを含むPBS中で、4°Cで最大6ヶ月間保存することが可能です。HPLCのプログラミングの詳細は、使用する装置構成やメーカーのソフトウェアの仕様によって異なります。ここでは、この装置でmicrome paradigm MG 4 HPLCを使用しています。メソッドは、画面上部の「setup」タブから作成およびアクセスします。提示された方法は、付属の書面プロトコルに詳細に記載されています。オートサンプラープログラムを使用する場合も、同様に書面プロトコルの指示に従ってください。これまでと同様にバッファーAを使用し、HPLCのランニングにはバッファーBを使用してください。また、バッファーおよびカラムは室温に保持してください。UV検出器を、0分から19分50秒まで280 nmで測定するように設定します。Y軸を調整し、0から50吸光度単位の範囲で低吸光度レベルを検出できるようにします。次に、サンプルを調製します。テストサンプルは、Marsカラムを用いて14種類の最豊富タンパク質を除去したヒト血漿から調製されています。除去済み血漿サンプルと2つの標準物質を用います。ヒトラクトフェリンと酵母インベルターゼを、既述の方法に従って個別にトリプシン消化し、脱塩します。サンプルを中和させるために、EITを回収するためのサンプルバイアルにあらかじめ中和緩衝液を用意しておきます。パラダイムMGの場合、1本のバイアルでフロースルーを回収し、3本のバイアルで溶出液を回収します。1 mLのEITを中和するには、約1.5 mLの緩衝液が必要です。目標とする中和後のpHは7.0〜8.0です。最終的なpHをpH指示紙で必ず確認してください。本プロトコルの後半に記載する方法に従って、サンプルの脱塩を行ってください。また、最良の結果を得るために、サンプルを1 mLのバッファーAで再懸濁してください。データの比較および統合を行うため、3回の実験反復（リプリケート）を実施します。3回分のサンプルを調製するには、3 picaMolesのtrypsin、消化済みinvertase、および1 µLのHPLC精製されたlactoferrin特異的レクチンを、30 µLのMars depleted trypsin消化プラズマ等量物（pe）に添加します。これにより、1回のリプリケートあたり約50 µgのプラズマタンパク質が使用されることになります。バッファーAをサンプルに加え、最終容量を330 µL（1回のリプリケートあたり110 µL）にします。まず、AALまたはSNAレクチンカラムのいずれかを使用し、バッファーAのみを注入してブランク法を2回実行してください。使用するレクチンカラムが、標準物質および事前に精製されたクロマトグラフとして使用したlactoferrin特異的レクチンと一致していることを確認してください。3つの血漿サンプルを、各サンプルの間にブランクを注入しながら、合計7回のHPLCランで分析します。ブランクランのフラクションを回収する必要はありません。ここでも、脱塩およびP-N-G-A-F消化後の溶出液を回収するサンプルバイアルに中和バッファーを入れておき、サンプルを確実に中和させてください。これで、サンプルは質量分析に供する準備が整います。ラクトフェリン標準品および実験サンプルの各HPLC分画の脱塩のため、1 mL Waters Oasis HLB SPEカートリッジを各分画に使用します。まず、必要な数のカートリッジを真空マニホールドに取り付けます。各カートリッジを1%ギ酸含有80%アセトニトリル1 mLで湿潤させます。マニホールド上の真空計の数値が5～20インチ水銀（inches Hg）であることを確認します。0.1%ギ酸を1.5 mL用いてカートリッジを平衡化します。ここでも、マニホールド上の真空計の数値が5～20インチ水銀であることを確認してください。サンプルの全量を1つのカートリッジにロードします。このとき、マニホールドの真空計の数値は2〜2.5インチであるはずです。流速は1 mL/minを超えないようにしてください。各カートリッジにつきラベル付きの回収チューブを1本ずつ使用し、0.1% formic acid 1 mLでカートリッジを3回洗浄する。0.1% Formic acidを含む80% Acetonitrile 1 mLでグリコペプチドを溶出させ、各回収チューブに0.5 molar ammonium bicarbonate 60 µLを加えてEITを中和させる。目標とする中和後のpHは7.0〜8.0である。最後に、pH指示紙を用いて最終的なpHを確認してください。Thermo Savant SpeedVacなどの真空遠心濃縮機を用い、35 °Cで約2時間処理し、溶出したペプチドを約50 µLまで濃縮します。濃縮後、再度サンプルのpHを測定し、7.0から8.0の間であることを確認してください。必要に応じて、50 mMの炭酸水素アンモニウムを加えてpHを調整してください。最終サンプル量が高100 µLを超える場合は、真空遠心濃縮を行い、50～100 µLになるまで濃縮します。最後に、各サンプルチューブに250 unitsのグリセロールフリー peptide n glycosate F（P-N-G-A-F）を加え、37 °Cで一晩インキュベートして、ペプチドからN結合型糖鎖を除去します。P-N-G-S-Fによる一晩のインキュベーション後、開始前に逆相C 18マトリックスを含むzip tipピペットチップを用いてサンプルの脱塩を行います。洗浄および溶出のため、パラフィルム上に0.1%ギ酸と、0.1%ギ酸を含む80%アセトニトリルの2つの液滴を作成します。液滴を用いることで、サンプル間のペプチドのクロスコンタミネーションを防ぎます。また、ZipTipサンプルごとに新しい液滴を準備してください。まず、ZipTipをアセトニトリル溶液で濡らします。次に、0.1%ギ酸10 µLを用いて3回ピペッティングし、ZipTipを平衡化させます。ピペッティングを10回行い、サンプルをロードします。次に、0.1% formic acidを10 µL用い、チップを5回洗浄します。最後に、1% Formic acid中の80% acetonide trialでサンプルを2回溶出させ、溶出したペプチドをエッペンドルフチューブに回収します。真空遠心濃縮機を用いてサンプル量を 2 µL 未満まで減少させ、最後に 0.1% ギ酸 20 µL でサンプルを再懸濁します。これでサンプルは LC-MS/MS 解析が可能な状態になります。ポロ接合により、通常、ビーズ上のレクチン濃度は 2 〜 20 mg/mL の範囲となり、これはアフィニティークロマトグラフィーにとって最適な濃度です。トリプシン消化したMars除去済みヒト血漿のレクチンクロマトグラフィーでは、通常、結合画分に糖ペプチドが濃縮されます。本ワークフローでは、N-結合型糖ペプチドを同定します。これらは、Xがプロリン以外の任意のアミノ酸である非結合のコンセンサス配列NXSまたはNXTを含んでいます。PNGase F処理により、非結合の糖鎖が除去され、糖鎖が付着していたアスパラギン残基が脱アミノ化されます。脱アミド化により、脱糖鎖化ペプチドまたは脱糖鎖ペプチドは、未修飾のペプチドから1 Daltonsの質量シフトが生じます。したがって、DEG糖ペプチドは、N結合型コンセンサス配列を含むペプチドとして同定され、そのコンセンサス配列内のアスパラギン残基が脱アミド化され、未修飾のアスパラギン残基と比較して1プラスの質量差として観察されます。ここでは、2つの例示スペクトルでこの概念を説明します。上のスペクトルは、EnLinkコンセンサス配列を含む未修飾ペプチドのフラグメンテーションを示しています。下のスペクトルは、EnLinkコンセンサス配列内のアスパラギン残基が脱アミド化した同一ペプチドのフラグメンテーションを示しています。脱アミド化ペプチドのY7、Y8およびB3フラグメントから得られた、丸で囲まれた分子イオンは、未修飾ペプチドの対応するイオンと比較して質量が1 Dalton増加しています。この質量シフトは、下段のスペクトルのペプチドに脱アミド化されたアスパラギン残基が含まれていることを示しています。通常、QStar eliteを使用すると、フロースルー分画で1,000から1,300個のペプチドが同定され、結合分画で200から400個のペプチドが同定されます。平均して、a lまたはSNAクロマトグラフィーのフロースルー分画には2〜4%の糖ペプチドが含まれていますが、結合分画で回収されたペプチドの30〜50%は糖ペプチドです。質量分析において、脱糖鎖化および脱アミド化した分子が観察されるため、ここでは「糖ペプチド」ではなく「deg 糖ペプチド」という用語を使用します。しかしながら、サンプル中の DEG 糖ペプチドの大部分は、PN GF 処理によって脱糖鎖化および脱アミド化した、元々は結合していなかった糖ペプチドであると考えられます。結合サンプルにおいて deg 糖ペプチドが濃縮されていることはこの仮説を支持しており、D 糖ペプチドの検出を、本レクチンアフィニティークロマトグラフィープロトコルで捕捉された糖ペプチドの指標として利用することを可能にします。フロースルー画分において2種類以上の異なるinvertase dグリコペプチドが、結合画分において2種類以上の異なるlactoferrin deグリコペプチドが観察されるはずです。以上で、レクチンカラムの調製およびHPLC形式でのレクチンアフィニティークロマトグラフィーの実施方法について説明しました。この手順を行う際は、高品質なグリコペプチドサンプルを使用し、実験を通じてサンプルのpHを監視し、グリコペプチド標準品を用いてクロマトグラフィーの品質を確認することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。

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Research

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