個々のシナプス前終末でのドーパミン放出はFFNsと可視化

蛍光偽神経伝達物質。FFN 511は、脳切片に適用した際に、シナプスの物理的モノアミントランスポーターの基質として機能する蛍光モノアミンです。FN 511はモノアミントランスポーターを介してドパミン作動性シナプス小胞に取り込まれ、S層などのモノアミンニューロンのシナプス前末端からの伝達物質放出を直接可視化するために使用できます。末端からの伝達物質の放出は、切片内において点状の蛍光信号の減少として観察されます。

このビデオでは、FFN 511で染色し、多光子レーザー顕微鏡を用いて撮像した、厚さ250 µmの冠状断サギッタルスライスをバイブラトームを用いて作製します。iCal放出の周波数依存的な不均一性を明らかにするデテニング実験について示します。こんにちは、私はコロンビア大学神経学部のDavid s LabのHUです。

こんにちは。Soldier LabのMinervaです。今日は、蛍光偽神経伝達物質を用いて脳切片内のドーパミン末端を標識する手順を説明します。当研究室では、ドーパミンの放出を研究するためにこの手法を用いています。

それでは、手順を開始します。急性サジタル切片を調製する前に、人工脳脊髄液（aCSF）に酸素を供給し、脳の摘出前まで少なくとも15分間、氷で冷却しておく必要があります。解剖中は、aCSFを氷冷状態かつ酸素供給状態で維持してください。マウスから脳全体を摘出し、クレイジーグルーを用いてバイブレーション・トレイに固定し、バイブレーション・カッターに設置します。脳の摘出から固定までは2分以内に完了させてください。

冷却した酸素飽和A CSFで満たしたトレイに、+1.54から+0.623の間で250 µmの厚さに冠状断で切断した脳切片を配置します。3枚のホールスライスが得られ、これを針を用いて6枚のハーフスライスに切断できます。脳切片を、室温の酸素飽和A CSF中で少なくとも1時間インキュベートします。

酸素飽和A CSFを用いて、10 millimolar FFN 511ストック溶液をA CSFに添加し、10 micromolar FFN 511ローディング溶液を調製します。その後、A CSFを用いて100 micromolar A-D-V-A-S-E-P 7溶液を調製します。スライスに個別に添加する前に、両方の溶液を少なくとも15分間酸素飽和させます。各脳スライスをFFN 511ローディング溶液中で、室温で30分間インキュベートします。

次に、負荷したスライスを、酸素飽和させた100 µM adversを含むaCSFで室温で30分間インキュベートし、細胞外組織に結合したdiを除去します。これでスライスのイメージング準備が整いました。FFN 511染色のイメージングは、Prairie Ultimaマルチフォトンレーザースキャニング顕微鏡を用いて行います。FFN 511を負荷したスライスをレコーディングチャンバーに設置し、酸素飽和させたaCSFを1～2 mL/minの流速で灌流させます。その後、スライスの上のナイロン糸で構成された白金ハープを配置し、動きを最小限に抑えます。

動きをさらに最小限に抑えるため、イメージングの前にスライスをチャンバー内で少なくとも10分間安定させてください。10倍の水浸対物レンズを用いて明視野照明下で背側線条体（dorsal stri AUM）を可視化して特定し、刺激実験を行うために、この領域にバイポーラツイストタングステン電極を配置および設置します。アイドリング中のイメージング領域は300 µm以内に位置しています。

刺激用双極電極の2つのチップの間に、63倍の水浸紫外線対物レンズを用いて、FFN 511で標識されたSal終末としてラベル付けされた視野画像FFN 511のこの領域を中央に配置します。FFN 511は、Spectral Physics社製のmi taiレーザーを用いて760 nanometersで励起されます。SAL終末の最適な蛍光はバンドパスフィルターを通して観察されます。75 by 75 micrometerの関心領域（ROI）を用い、512 by 512 pixelの解像度で12 bit形式の画像をキャプチャします。ここに、FFN 511で標識されたSalドーパミン終末の例示画像を示します。

FFN 511ラベルは、高濃度の塩化カリウム・アンフェタミン硫酸塩による脱染色、または塩化カリウム脱染色実験における電気刺激によって脱落させることができます。高カリウム脳脊髄液（CSF）溶液を脳切片に適用すると、FFN 511ラベルは4分以内に脱落します。電気刺激によるFFN 511の脱染色の経時的変化を追跡するために、XYZT画像を記録します。刺激前に少なくとも5分間、切片の移動が最小限であること、および画像取得後のレーザーによる光退色がないことを確認するため、対照となるタイムシリーズ画像を取得してください。

1、4、または20 Hzの周波数での刺激を開始しながら、XYZTイメージングを継続します。刺激は、マスター8パルスジェネレーターによってトリガーされたIsoflex刺激アイソレーターを用い、バイポーラ電極により線条体に局所的に印加されます。このビデオでは、サル脳切片におけるエキソサイトーシス中のFFN 511の減衰を示しています。準備段階において、サルへのFFN 511の導入が完了すると、線条体における豊富なラベル化、皮質におけるまばらなラベル化、および脳梁におけるラベル化の欠如が観察されます。

これらの代表的な画像に示されているように、塩化カリウム投与前と70 millimolarの塩化カリウム投与2分後の比較から、ドパミン末端の選択的標識が高濃度の塩化カリウムによって消失することがわかります。また、アンフェタミンによってもFFN 511標識の消失させることが可能です。この画像は、アンフェタミン投与前の線条体におけるFFN 511標識を示しています。

この画像は、20 µM のアンフェタミンで脱標識（detraining）してから20分後の線条体を示しています。局所電気刺激による FFN 511 標識の脱標識は、刺激前、および 4 Hz での刺激開始後217秒と514秒時点での線条体における FFN 511 標識を示すこれらの画像に例示されています。正規化された蛍光強度の経時変化を示すこのグラフは、FFN 511 の脱標識がカルシウムおよび周波数依存的であることを示しています。白抜きの三角形で表されるコントロール群には刺激を与えていません。白抜きの円で表される塩化カドミウムによる脱標識は、非刺激コントロールと同等でした。

色付きの円で示された各刺激周波数の減衰曲線に対して単一指数関数によるフィッティングを行い、半減期をtau × 0.693として算出しました。ここでは、急性脳切片内のドーパミン末端に蛍光フォース神経伝達物質 FFN five 11 をロードする方法と、高カリウム刺激および誘発刺激によってこれを放出させる方法について説明しました。これは、個々のシナプス末端レベルで神経伝達物質の放出を光学的に検討するために開発された最初の手法です。

この手順を行う際は、切片を非常に健全な状態に保つことが重要です。また、ロード時間、バックグラウンドの漂白、および動きによるアーティファクトに注意してください。切片の状態が良好であれば、切片作成後最大4時間まで、良好なFFN 5/11のロードおよびイメージングが可能です。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。