個々のシナプス前終末でのドーパミン放出はFFNsと可視化

蛍光偽神経伝達物質。FFN 511は、脳切片に適用した際にシナプス前膜のモノアミン輸送体の基質として機能する蛍光モノアミンです。FFN 511はモノアミン輸送体を介してドーパミン作動性シナプス小胞に取り込まれ、S層などのモノアミン作動性ニューロンのシナプス前末端からの伝達物質放出を直接可視化するために使用できます。末端からの伝達物質放出は、切片内における点状の蛍光信号の減少として観察されます。

このビデオでは、振動切片機を用いて厚さ 250 µm の冠状断サギタリス切片を作製し、FFN 511 で染色後、多光子レーザー顕微鏡を用いて撮像します。iCal 放出の周波数依存的な不均一性を明らかにするデチューニング実験について説明します。こんにちは、コロンビア大学神経科学科の David s Lab の HU です。

こんにちは、Soldier LabのMinervaです。今日は、蛍光偽神経伝達物質を用いて脳切片中のドーパミン末端を標識する手順をご紹介します。私たちの研究室では、ドーパミン放出を研究するためにこの手法を用いています。

それでは、始めていきましょう。急性脳切片を調製する前に、人工脳脊髄液（A CSF）に酸素を飽和させ、氷で少なくとも15分間冷却する必要があります。脳の摘出まで、A CSFを氷冷し、酸素飽和状態に維持してください。解剖の際、マウスから全脳を摘出し、瞬間接着剤を用いてバイブレーション台に固定します。脳の摘出から固定までは2分以内に完了させる必要があります。

冷却した酸素飽和A CSFで満たしたトレイに、+1.54から+0.623の範囲で厚さ250 µmの冠状断の直線的な脳切片を配置します。3枚のホールスライスが得られ、これらを針を用いて6枚のハーフスライスに分割できます。脳切片を室温の酸素飽和A CSF中で少なくとも1時間インキュベートします。

酸素飽和A CSFを用いて、10 mMのFFN 511ストック溶液をA CSFに添加し、10 µMのFFN 511ローディング溶液を調製します。その後、A CSFを用いて100 µMのA-D-V-A-S-E-P 7溶液を調製します。スライスへの個別添加前に、両溶液を少なくとも15分間酸素飽和させます。各脳スライスをFFN 511ローディング溶液とともに、室温で30分間インキュベートします。

次に、負荷した切片を、酸素飽和させた100 µM advers含有 A CSF中で室温で30分間インキュベートし、細胞外組織に結合したdiを除去します。これで切片のイメージング準備が整いました。FFN 511染色のイメージングは、Prairie Ultima多光子レーザー走査顕微鏡を用いて切片上で行います。FFN 511を負荷した切片を記録チャンバーに設置し、酸素飽和させた A CSFを1〜2 mL/minの流速で灌流します。その後、切片の上にナイロン弦付きのプラチナハープを置き、動きを最小限に抑えます。

実験中の動きをさらに最小限に抑えるため、イメージング前にスライスをチャンバー内で少なくとも10分間静置し、安定させてください。10倍の水浸対物レンズを用いて明視野照明下で背側線条体AUMを視認し、位置を特定します。刺激実験を行うために、双極ねじれタングステン電極をこの領域に配置および設置してください。想定されるイメージング領域は300 µm以内に位置しています。

刺激用双極電極の2つのチップの間に、63倍の水浸紫外線対物レンズを用いて、FFN 511で標識されたSal末端が示されている視野画像FFN 511の中心部にこの領域を配置します。FFN 511は、Spectral Physics社のmi taiレーザーを用いて760 nmで励起させます。Sal末端の最適な蛍光はバンドパスフィルターを通して観察されます。512 x 512ピクセルの解像度で、75 x 75 µmの関心領域（ROI）を設定し、12ビット形式で画像をキャプチャします。FFN 511で標識されたSalドーパミン末端の代表的な画像をここに示します。

FFN 511ラベルは、高濃度の塩化カリウムアンフェタミン硫酸塩、または塩化カリウム脱色実験における電気刺激によって脱色されます。高カリウム含有CSF溶液を脳切片に適用すると、FFN 511ラベルは4分以内に脱色されます。電気刺激によるFFN 511の脱色を追跡するために、XYZT画像を記録してください。切片の移動を最小限に抑え、レーザーによる光退色が生じていないことを確認するため、刺激前に少なくとも5分間、ザックのコントロールタイムシリーズ画像を取得してください。

1、4、または20 Hzの周波数で刺激を開始しながら、XYZTイメージングを継続します。刺激は、マスター8パルスジェネレーターによってトリガーされたisof lex刺激アイソレーターを用い、バイポーラ電極で線条体に局所的に適用されます。このビデオでは、サギ（sal）脳スライスにおけるエキソサイトーシス中のFFN 511の拡散を示しています。準備段階でFFN 511のサギへのローディングが完了すると、線条体での豊富な標識、皮質でのまばらな標識、および脳梁での標識なしが観察されます。

これらの代表的な画像に示されているように、ドパミン末端の選択的標識は、高濃度の塩化カリウムによって消失させることができます。ここでは、塩化カリウムの投与前と、70 mMの塩化カリウム投与から2分後の様子が示されています。また、アンフェタミンによってもFFN 511標識のCSF脱標識を行うことが可能です。こちらの画像は、アンフェタミン投与前の線条体におけるFFN 511標識を示しています。

この画像は、20 µMのアンフェタミンで脱染色させた20分後の線条体を示しています。局所電気刺激によるFFN 511ラベルの脱染色については、刺激前、および4 Hzでの刺激開始後217秒と514秒における線条体のFFN 511ラベルを示すこれらの画像で説明されています。正規化された蛍光強度の経時変化を示すこのグラフは、FFN 511の脱染色がカルシウムおよび周波数依存的であることを示しています。白抜きの三角形で示されるコントロール群には刺激を与えていません。白抜きの円で示される塩化カドミウムを用いた脱染色は、未刺激のコントロール群と同等でした。

色付きの円で示された各刺激周波数に対する減衰曲線は、単一指数関数でフィッティングされ、半減期はtauに0.693を乗じて算出されました。ここでは、急性切片中のドーパミン末端に蛍光フォース神経伝達物質 FFN five 11 をロードする方法と、高カリウム刺激によってそれを放出させ、刺激を誘発する方法について説明しました。これは、個々のシナプス末端レベルで神経伝達物質の放出を光学的に調べるために開発された最初の手法です。

この手順を行う際は、切片の状態を非常に良好に保つことが重要であり、負荷時間、背景の漂白、および動きによるアーティファクトに留意してください。良好なFFN five 11の負荷およびイメージングは、切片作成後4時間まで可能です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っております。