Name: 個々のシナプス前終末でのドーパミン放出はFFNsと可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶ 蛍光ドーパミン類似物質FFN 511を用いて、マウス脳切片のシナプス前終末からのドーパミン放出を可視化する手法。多光子レーザー顕微鏡でリアルタイムに神経伝達物質の動態を観測し、神経科学の研究に活用できます。

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D.サムズはG.ハロルド＆レイラY.が慈善財団と科学と工学のコロンビア大学の取り組みをマザーズに感謝。 D.サムズとD.スルザーは、神経科学賞でマックナイトの技術革新のためにマックナイト財団に感謝 D.スルザー感謝NIDA、NIMH、および回Picowerとパーキンソン病の基礎。 H.チャンはNARSADに感謝。 RHエドワーズは、マイケルJフォックス財団、国立パーキンソン財団、NIDAとNIMHに感謝。 我々は、全反射顕微鏡のセットアップと技術サポートのために6 - OHDA注入やアドバイス、有用な議論のためのマークのSonders、画像解析のプログラミングのためのメレクシュウ、とJan Schmoranzerのためにロバートバークに感謝。

このメソッドは、で報告された研究で使用されて<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">Gubernator ら、Science 324（5933）。 1441-1444（2009） 。</a> 1。急性線条体スライスの準備<ol><li>急性線条体スライスを準備する前に、一つは酸素を人工脳脊髄液（ASCF）と前脳の抽出には少なくとも15分間氷でそれを冷やし必要があります。 ACSFの氷冷を維持し、解剖時の酸素。 ACSF（mMで）：NaClの125、KClを2.5、NaHCO 3の 26のCaCl 2 2.4、硫酸マグネシウム1.3、KH 2 PO 4 0.3、グルコース10、HEPES 5、pHが7.3から7.4、290から295 mOsm。 </li><li>麻酔なしで雄マウスを刎ねる。 </li><li>マウスから脳全体を抽出し、そしてクレイジー®接着剤を使用してビブラトーム上に配置ビブラトームトレイにマウントします。脳の抽出と取り付けは2分以内に行う必要があります。この時間の間に、ACSFの氷冷を維持し、組織の健康を保つために酸素をしてください。 </li><li>ブレグマ1.54の間に0.62 1〜250μmの厚さで冠状線条体の脳切片をカット。三全体のスライスは、針6の半分のスライスにカットすることができますが得られます。 </li><li>プローブ負荷の前に少なくとも1時間室温で酸素化されたACSFの脳切片をインキュベートします。スライスは良いFFN511ローディングを表示し、スライスの調製後4時間まで撮影のためにアクティブのまま。 </li></ol> 2。ローディングFFN511 <ol><li> FFN511ローディング液（ACSFで10μMFFN511）を準備し、また、ACSFで100μMADVASEP - 7を準備する。すべてのソリューションを新たに調製し、スライスにロードするために少なくとも15分前に酸素化されるべきである。 </li><li>個別に室温で30分間FFN511ローディングソリューションでスライスをインキュベートする。 </li><li>その後、室温2で30分間酸素100μMADVASEP - 7 ACSFでロードされたスライスをインキュベートすることにより、細胞外組織に結合した色素を取り除く。スライスは、現在のイメージングのための準備が整いました。 </li></ol> 3。脳スライスのイメージングFFN511 スライスのFFN511のイメージングは​​、多光子レーザー走査型顕微鏡を用いて行われる。我々は（我々は以前にツァイスLSM 510 NLO多光子レーザー走査型顕微鏡を使用していたし、いくつかの結果はツァイスの顕微鏡で得られた）プレーリーウルティマ多光子レーザー走査顕微鏡を使用しています。 <ol><li>録音室でFFN511負荷スライス（RC - 27L、ワーナー）を配置し、分あたり1-2 mlの流量で酸素化されたACSFで表面かん流する。その後、実験時の動きを最小限に抑えるために、スライスの上にナイロン弦とプラチナのハープを置きます。さらなる動きを最小限に抑えるために、スライスは、イメージングの前にチャンバー内で少なくとも10分間安定化させることができます。 </li><li>視覚化し、10倍の水浸対物レンズの下で明視野発光と背側線条体を探します。 </li><li>この地域の場所や位置バイポーラツイストタングステン電極刺激実験を行う場合。理想的な撮像領域を刺激バイポーラ電極の2つのヒントの間に300μmの内に位置しています。視野の中心にこの地域を置きます。 </li><li> 63x（0.9 NA）水浸紫外線の目標の下に画像FFN511標識線条体の端末。 FFN511はスペクトル物理学と線条体端末の最適な蛍光からマイタイのレーザーと760 nmで励起され、バンドパスフィルタ（480〜520 nm）を介して見られている。画像は512 × 512ピクセルの解像度での関心の75 × 75μmの領域と12ビット形式でキャプチャされています。刺激脱色実験については、z平面上の1μm以下で区切られたz軸のシフト、5-7画像のz -シリーズ、、を補正するためには、各期間に取得されます。 </li></ol> 4。 FFN511脱色 FFN511ラベルは、KClの高濃度（我々は70 mMのKClを使用）、（+）-アンフェタミン硫酸（AMPH、20μM）、または電気刺激によりいずれかを脱色することができます。における高カリウムのACSF液を脳のスライスに適用される塩化カリウム、脱色実験、、2分以内にFFN511ラベルdestains。レコードには、XYZ - Tの画像を時間をかけてFFN511脱色を追跡する。以下では、電気刺激に依存するドーパミン端末脱色について説明します。 <ol><li>時間をかけてFFN511脱色を追跡するために、XYZ - Tの画像が記録されます。スライスの最小限の動きを（z軸に4μm未満）を確実にしていないレーザーによる退色、Zスタックの制御の時系列画像は、刺激前に少なくとも5分間取得する必要があります。そうでなければ、レーザーパワーを調整する。 </li><li> 1、4または20 Hzの周波数で刺激を開始しながら、これらのコントロールのイメージに続いて、XYZ - Tのイメージングを続ける。 1、4または20 Hz（300μ× 1 mA）を少なくとも刺激は双極電極を使用してマスター- 8パルスジェネレータ（AMPI、エルサレム、イスラエル）によって引き起こされるアイソフレックスの刺激アイソレータによって局所的に線条体に適用されます。最小限にリリースサイトの脱分極の変化は、我々は、サイクリックボルタンメトリーによって決定される最大刺激強度の150％を適用し刺激プロトコルを使用している。 </li><li>画像解析のための適切なソフトウェアを使用してください。私たちの研究室では、我々は、時間3で涙点蛍光と変化を定量化するためにイメージJ（ウェインRosband、国立衛生研究所、ロックビル、MD）とIDLのカスタムで作成されたソフトウェア（リサーチシステムズ、ボルダー、CO）を使用します。 </li></ol> Represenative結果図1は、線条体スライスにFFN511読み込みが完了であることを示しています。 10倍と60倍対物レンズを用いて代表的なイメージは、図1に示されています。ドーパミン端末の選択的標識は、20μMのアンフェタミンによって脱色することができます。 図2は、高塩化カリウムによってFFN511ラベリングの脱色を示しています。 図3は、地元の電気刺激によってFFN511ラベリングの脱色を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="図1" /> 1 FFN511ラベルライブ皮質-線条体急性スライス内のドーパミンの端子図急性ライブ皮質-線条体スライスのFFN511によって（）ラベル：。線条体に豊富なラベリング（STR）、皮質（CTX）におけるスパースなラベリング、およびでないラベル脳梁（CC）。スケールバー：100μmのアンフェタミンによる線条体からFFN511の（B）脱色。。左のパネル：アンフェタミンの前に、右のパネル：20μMのアンフェタミンの20分後。スケールバー：10μmである。 <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。高KClをしてFFN511ラベルの脱色。 FFN511標識はACSFで70 mMのKClの2分間のアプリケーション内で脱色されています。スケールバー：10μmの。 <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：周波数依存性の線条体におけるFFN511ラベルの脱色。（）4 Hzで局所刺激は端末からの脱色となりました。刺激は、t = 0で始まった。スケールバー：5μmの（B）4 HzでFFN511の脱色は、Ca 2 + -及び周波数に依存する。。コントロールにはない刺激（3スライスから153涙点）を受信しません。塩化カドミウム（200μM）で脱色すると非刺激対照（5スライスから475涙点）と同一であった。各刺激の周波数のための脱色曲線は単一指数減衰関数と半減期により適合させた（T 1 / 2）τX 0.693（1 Hzと計算値：9スライスから765涙点、4 Hzの7のスライスから410涙点、 20 Hzの：6スライスから416涙点）。線条体の脳のスライス標本におけるエキソサイトーシスの間にFFN511脱色の2光子顕微鏡からのビデオ顕微鏡写真を参照してください。

<ol><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
<li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li>
<li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

このビデオでは、我々は光学的に蛍光ドーパミンの類似体を用いて神経伝達を可視化する方法を示しています。 FFN511は、我々が開発したFFNsの第1世代です。それは、科学に示すように（皮質のシナプス小胞に細胞質からモノアミン神経伝達物質を運ぶ神経細胞の小胞モノアミントランスポーター（VMAT2）、そして特にラベル線条体におけるドーパミンの端末と推定されるカテコールアミンおよび/またはセロトニンの端末をターゲットにして設計されましたが、紙）FFN511は比較的疎水性であるため、適切なローディング期間は特異性のための非常に重要です。我々はその40分より長くするためのインキュベーションは、線条体切片における豊富な非特異的染色をもたらす発見。特異性は、素直に機能的なシナプス小胞内にFFNの放出を引き起こすはずKClの高濃度を、使用して脱色によって決定することができる。 15分未満のためFFN511へのスライスの曝露は、端末の染料の不十分な負荷に起因する微弱な蛍光シグナルになります。このプロトコルでは、我々は細胞外組織に結合した色素を除去するために100μMADVASEP - 7を使用してください。この手順は必要ありませんが、それが省略された場合、ACSFで洗い流し時間は延長する必要があります。要約すると、選択した準備に応じて、最適なラベルを決定するために濃度およびローディング期間を変更する必要があります。

<table><tbody><tr><td>FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)</td><td>コロンビア大学 - Dalibor Sames研究室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADVASEP-7 </td><td>CyDex</td><td>AR-OA7-005</td><td></td></tr><tr><td>RC-27L 記録室</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>PELCO PrepEze 6ウェルホルダー</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>36157-1</td><td>スライス培養用</td></tr><tr><td>Master-8 パルス刺激装置および Iso- Flex 刺激アイソレーター</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

個々のシナプス前終末でのドーパミン放出はffnsと可視化

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

神経系は、シナプス小胞融合の間に神経伝達物質の放出を介してニューロン間の信号を送信する。直接個々のシナプス前終末から神経伝達物質の取り込みと放出を観察するために、我々は、シナプス小胞モノアミントランスポーターの基質として蛍光偽の神経伝達物質を設計した。線条体での画像のドーパミンの放出にこれらのプローブを使用して、我々は、シナプス可塑性に関連するいくつかの観測を行った。我々は、刺激ごとに神経伝達物質を放出するシナプス小胞の割合は、刺激周波数に依存していたことがわかった。動力学的に別個の&quot;リザーブ&quot;シナプス小胞の人口は、これらの実験条件下で観察されなかった。シナプス前終末の周波数に依存する不均一性は、シナプス前選択の周波数に依存するコーディングのためのメカニズムを示し、D2ドーパミン受容体に部分的に依存していたことが明らかになった。 ホイ張とNiko G.のGubernatorはこの作品にも同様に貢献しています。

光学的に蛍光ドーパミンの類似体を用いて神経伝達を測定するための新しい手段。

個々のシナプス前終末でのドーパミン放出はFFNsと可視化

神経系は、シナプス小胞の融合に伴う神経伝達物質の放出を介して、ニューロン間で信号を伝達します。神経伝達物質の取り込みを観察し、...

蛍光偽神経伝達物質。FFN 511は、脳切片に適用した際に、シナプスの物理的モノアミントランスポーターの基質として機能する蛍光モノアミンです。FN 511はモノアミントランスポーターを介してドパミン作動性シナプス小胞に取り込まれ、S層などのモノアミンニューロンのシナプス前末端からの伝達物質放出を直接可視化するために使用できます。末端からの伝達物質の放出は、切片内において点状の蛍光信号の減少として観察されます。このビデオでは、FFN 511で染色し、多光子レーザー顕微鏡を用いて撮像した、厚さ250 µmの冠状断サギッタルスライスをバイブラトームを用いて作製します。iCal放出の周波数依存的な不均一性を明らかにするデテニング実験について示します。こんにちは、私はコロンビア大学神経学部のDavid s LabのHUです。こんにちは。Soldier LabのMinervaです。今日は、蛍光偽神経伝達物質を用いて脳切片内のドーパミン末端を標識する手順を説明します。当研究室では、ドーパミンの放出を研究するためにこの手法を用いています。それでは、手順を開始します。急性サジタル切片を調製する前に、人工脳脊髄液（aCSF）に酸素を供給し、脳の摘出前まで少なくとも15分間、氷で冷却しておく必要があります。解剖中は、aCSFを氷冷状態かつ酸素供給状態で維持してください。マウスから脳全体を摘出し、クレイジーグルーを用いてバイブレーション・トレイに固定し、バイブレーション・カッターに設置します。脳の摘出から固定までは2分以内に完了させてください。冷却した酸素飽和A CSFで満たしたトレイに、+1.54から+0.623の間で250 µmの厚さに冠状断で切断した脳切片を配置します。3枚のホールスライスが得られ、これを針を用いて6枚のハーフスライスに切断できます。脳切片を、室温の酸素飽和A CSF中で少なくとも1時間インキュベートします。酸素飽和A CSFを用いて、10 millimolar FFN 511ストック溶液をA CSFに添加し、10 micromolar FFN 511ローディング溶液を調製します。その後、A CSFを用いて100 micromolar A-D-V-A-S-E-P 7溶液を調製します。スライスに個別に添加する前に、両方の溶液を少なくとも15分間酸素飽和させます。各脳スライスをFFN 511ローディング溶液中で、室温で30分間インキュベートします。次に、負荷したスライスを、酸素飽和させた100 µM adversを含むaCSFで室温で30分間インキュベートし、細胞外組織に結合したdiを除去します。これでスライスのイメージング準備が整いました。FFN 511染色のイメージングは、Prairie Ultimaマルチフォトンレーザースキャニング顕微鏡を用いて行います。FFN 511を負荷したスライスをレコーディングチャンバーに設置し、酸素飽和させたaCSFを1～2 mL/minの流速で灌流させます。その後、スライスの上のナイロン糸で構成された白金ハープを配置し、動きを最小限に抑えます。動きをさらに最小限に抑えるため、イメージングの前にスライスをチャンバー内で少なくとも10分間安定させてください。10倍の水浸対物レンズを用いて明視野照明下で背側線条体（dorsal stri AUM）を可視化して特定し、刺激実験を行うために、この領域にバイポーラツイストタングステン電極を配置および設置します。アイドリング中のイメージング領域は300 µm以内に位置しています。刺激用双極電極の2つのチップの間に、63倍の水浸紫外線対物レンズを用いて、FFN 511で標識されたSal終末としてラベル付けされた視野画像FFN 511のこの領域を中央に配置します。FFN 511は、Spectral Physics社製のmi taiレーザーを用いて760 nanometersで励起されます。SAL終末の最適な蛍光はバンドパスフィルターを通して観察されます。75 by 75 micrometerの関心領域（ROI）を用い、512 by 512 pixelの解像度で12 bit形式の画像をキャプチャします。ここに、FFN 511で標識されたSalドーパミン終末の例示画像を示します。FFN 511ラベルは、高濃度の塩化カリウム・アンフェタミン硫酸塩による脱染色、または塩化カリウム脱染色実験における電気刺激によって脱落させることができます。高カリウム脳脊髄液（CSF）溶液を脳切片に適用すると、FFN 511ラベルは4分以内に脱落します。電気刺激によるFFN 511の脱染色の経時的変化を追跡するために、XYZT画像を記録します。刺激前に少なくとも5分間、切片の移動が最小限であること、および画像取得後のレーザーによる光退色がないことを確認するため、対照となるタイムシリーズ画像を取得してください。1、4、または20 Hzの周波数での刺激を開始しながら、XYZTイメージングを継続します。刺激は、マスター8パルスジェネレーターによってトリガーされたIsoflex刺激アイソレーターを用い、バイポーラ電極により線条体に局所的に印加されます。このビデオでは、サル脳切片におけるエキソサイトーシス中のFFN 511の減衰を示しています。準備段階において、サルへのFFN 511の導入が完了すると、線条体における豊富なラベル化、皮質におけるまばらなラベル化、および脳梁におけるラベル化の欠如が観察されます。これらの代表的な画像に示されているように、塩化カリウム投与前と70 millimolarの塩化カリウム投与2分後の比較から、ドパミン末端の選択的標識が高濃度の塩化カリウムによって消失することがわかります。また、アンフェタミンによってもFFN 511標識の消失させることが可能です。この画像は、アンフェタミン投与前の線条体におけるFFN 511標識を示しています。この画像は、20 µM のアンフェタミンで脱標識（detraining）してから20分後の線条体を示しています。局所電気刺激による FFN 511 標識の脱標識は、刺激前、および 4 Hz での刺激開始後217秒と514秒時点での線条体における FFN 511 標識を示すこれらの画像に例示されています。正規化された蛍光強度の経時変化を示すこのグラフは、FFN 511 の脱標識がカルシウムおよび周波数依存的であることを示しています。白抜きの三角形で表されるコントロール群には刺激を与えていません。白抜きの円で表される塩化カドミウムによる脱標識は、非刺激コントロールと同等でした。色付きの円で示された各刺激周波数の減衰曲線に対して単一指数関数によるフィッティングを行い、半減期をtau × 0.693として算出しました。ここでは、急性脳切片内のドーパミン末端に蛍光フォース神経伝達物質 FFN five 11 をロードする方法と、高カリウム刺激および誘発刺激によってこれを放出させる方法について説明しました。これは、個々のシナプス末端レベルで神経伝達物質の放出を光学的に検討するために開発された最初の手法です。この手順を行う際は、切片を非常に健全な状態に保つことが重要です。また、ロード時間、バックグラウンドの漂白、および動きによるアーティファクトに注意してください。切片の状態が良好であれば、切片作成後最大4時間まで、良好なFFN 5/11のロードおよびイメージングが可能です。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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Biology

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