大動脈リングアッセイ

大動脈環アッセイの全体的な目標は、3Dマトリックス内のマウス大動脈全体から血管が発芽する柔軟な実験システムを提供することです。これは、最初にマウスから胸部大動脈を解剖し、次に残った周囲の組織を注意深く洗浄することによって達成されます。きれいな大動脈または大動脈リングのスライスは、ドームに成形された基礎マトリックス抽出物またはBMEを各48ウェルプレートの個々のウェルに配置します。

BMEの追加ドロップは、リングを3D構造で囲みます。マトリックスには、任意の実験試薬を含めることができます。数日間のインキュベーション後、血管が大動脈環から発芽するのを観察し、試験化合物の血管新生能を評価することができます。

こんにちは、イスラエルのベオン・シェバにあるベオン・ユニバーシティ・オブ・ザ・ネガティブの臨床生化学部のE・ルイス博士の研究室のカレン・バインです。今日は、マウス大動脈リングアッセイの手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて、様々な材料が血管形成に及ぼす影響を研究しています。

それでは始めましょう。この手順を開始するには、地下マトリックス抽出物またはBMEを氷上または摂氏4度で解凍します。解凍後は、BMEが再び固まらないように、引き続き冷たく保

実験の日に、標準的なケタミンとキシラジン注射によって6〜7週齢のマウスを安楽死させ、首の動脈から急速に出血し、続いて頸部脱臼を引き起こします。滅菌層流フードで動物を70%エタノールで拭くことから手順を開始します。次に、解剖スコープの下で作業しながら、滅菌鉗子と解剖ハサミを使用して皮膚の垂直切開を行い、腹膜壁を開きます。

切開は、胸郭も切断され、横隔膜が除去される上部胸骨を露出させるように行う必要があります。すべての臓器を慎重に脇に押して、大動脈が露出した状態で脊椎の横にある胸部大動脈を完全に露出させ、大動脈と脊椎の間に細い滅菌ピンセットを挿入します。ピンセットを広げて開き、大動脈をベッドから徐々に持ち上げ、胸部を大動脈の残りの部分から分離します。

大動脈が分離されたので、鋭利なハサミを使用して、腎血管のすぐ近くで心臓の近くで終わる端から始めてマウスから切り取ります。切除した胸部大動脈を、冷たい滅菌PBSで満たされたペトリ皿に入れます。.大動脈が除去されたので、大動脈リングは2つの滅菌ピンセットを使用して、双眼鏡の下で作業して準備することができます。

周囲の脂肪組織から胸部大動脈をきれいにします。大動脈を傷つけないように注意し、端だけを持ってください。大動脈は、最終的に洗浄されるまで脱水を防ぐために、PBSを含むペトリ皿に繰り返し浸す必要があります。

胸部大動脈がきれいになったので、外科用ブレードを使用し、双眼鏡の下で作業して、大動脈を1ミリメートルのリングに均等にスライスします。切断面の下に配置された定規を目安に、切れ味を保つために新しい刃を使用し、時々交換してください。大動脈の端は使用されません 各リングをカットした後、ピンセットを使用して、冷たいPBSを含む新しい皿に非常に優しく移します。

すべてのリングを同じPBS含有プレートに配置して、アッセイがランダム化されるようにします。大動脈の各セグメントは血管新生の電位が多少異なるため、リングを氷の上に置いておきます。次に、プリクールピペットチップを使用してアッセイプレートを調製します。

150マイクロリットルの冷たいBMEの滴の周りの48ウェルプレートの各ウェルに追加すると、滴はドーム運動の途中で固化します。BMEは、物質の輸送、細胞の走化性、そして最も重要なことに、ネオ血管形成につながる細胞の分化と移動を可能にします 周辺井戸はPBSで満たされています BMEの脱水を避けるために、BMEドロップが摂氏37度で20〜30分間固化するようにします。BMEが固まったら、損傷を防ぐためにピンセットを使用してペトリ皿から大動脈リングを慎重に持ち上げ、ピンセットの先端の間に形成される脂質の滴の内側にリングを移す必要があります液体の表面張力の結果として、各ドームの上部中央に単一の大動脈リングを置き、各リングの上部に摂氏37度で10分間インキュベートします。 さらに150マイクロリットルのBMEを加え、20〜30分間インキュベートします。

摂氏37度で、リングはBMEとアッセイに包まれています。材料をプレートに追加して、アッセイを開始できます。Pres は、以前に調製したヒト内皮血清遊離培地を、実験材料または内皮細胞増殖サプリメントのいずれかをネガティブコントロールのポジティブコントロールとして

メディウムのみを使用してください。500マイクロリットルのpresサプリメント培地を各ウェルに加え、摂氏37度で6〜12日間インキュベートします。このインキュベーション期間中、顕微鏡でプレートを検査し、大動脈から発芽する血管と、さらに分岐する血管によって同定された高度な成熟血管を探します。

リング組織から伸びて、標準的な位相コントラストステレオスコープで6日目から12日目の間にリングを3次元的に撮影する必要があります。さらに、6日目から12日目までのさまざまな日に上清を収集し、1日またはEloquaで使用するために4度で保存し、将来の使用のためにマイナス20度またはマイナス80度で保存します。上清は、vgfのElizaや一酸化窒素レベルのグリースアッセイなど、さまざまな手法で分析できます。

これらの画像は、ウェルにリングを配置し、培養物、画像の最上列に見られる培地、または血管発芽のポジティブコントロールとして使用されるECGSのいずれかでインキュベートしてから12日後に収集されました。下部パネルにあります。各画像は、12個のリングのうち4個の代表的なスナップショットであり、通常、条件ごとにアッセイで使用されます。

各別々のウェルの各大動脈リングの角は黒です。このように撮影すると、ECGSにさらされた大動脈輪は血管の成長を示し、矢印は形成された多くの血管のいくつかを指しています。各血管は内皮細胞の鎖として特徴付けられ、時折分岐して成熟していることを示しています。

培養物中に発芽血管は観察できません。トップパネルのミディアムウェル、この手順を行う際に大動脈コーアッセイを実行する方法を示しました。正確に作業し、彼らの条件の下で作業することを忘れないことが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。