大動脈リングアッセイ
2009年11月24日
血管新生は、既存の血管からの血管の出芽は、自然および病理学的プロセスの両方に関連付けられています。ここでは、血管新生増強と阻害剤が直接文化の大動脈輪に追加できる大動脈リングアッセイを示す。発芽しneovessel伸長は6-12日の期間にわたって大動脈リングを調べることによって決定することができます。
大動脈環アッセイの全体的な目標は、3Dマトリックス内のマウス大動脈全体から血管が発芽する柔軟な実験システムを提供することです。これは、最初にマウスから胸部大動脈を解剖し、次に残った周囲の組織を注意深く洗浄することによって達成されます。きれいな大動脈または大動脈リングのスライスは、ドームに成形された基礎マトリックス抽出物またはBMEを各48ウェルプレートの個々のウェルに配置します。
BMEの追加ドロップは、リングを3D構造で囲みます。マトリックスには、任意の実験試薬を含めることができます。数日間のインキュベーション後、血管が大動脈環から発芽するのを観察し、試験化合物の血管新生能を評価することができます。
こんにちは、イスラエルのベオン・シェバにあるベオン・ユニバーシティ・オブ・ザ・ネガティブの臨床生化学部のE・ルイス博士の研究室のカレン・バインです。今日は、マウス大動脈リングアッセイの手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて、様々な材料が血管形成に及ぼす影響を研究しています。
それでは始めましょう。この手順を開始するには、地下マトリックス抽出物またはBMEを氷上または摂氏4度で解凍します。解凍後は、BMEが再び固まらないように、引き続き冷たく保
ちます。実験の日に、標準的なケタミンとキシラジン注射によって6〜7週齢のマウスを安楽死させ、首の動脈から急速に出血し、続いて頸部脱臼を引き起こします。滅菌層流フードで動物を70%エタノールで拭くことから手順を開始します。次に、解剖スコープの下で作業しながら、滅菌鉗子と解剖ハサミを使用して皮膚の垂直切開を行い、腹膜壁を開きます。
切開は、胸郭も切断され、横隔膜が除去される上部胸骨を露出させるように行う必要があります。すべての臓器を慎重に脇に押して、大動脈が露出した状態で脊椎の横にある胸部大動脈を完全に露出させ、大動脈と脊椎の間に細い滅菌ピンセットを挿入します。ピンセットを広げて開き、大動脈をベッドから徐々に持ち上げ、胸部を大動脈の残りの部分から分離します。
大動脈が分離されたので、鋭利なハサミを使用して、腎血管のすぐ近くで心臓の近くで終わる端から始めてマウスから切り取ります。切除した胸部大動脈を、冷たい滅菌PBSで満たされたペトリ皿に入れます。.大動脈が除去されたので、大動脈リングは2つの滅菌ピンセットを使用して、双眼鏡の下で作業して準備することができます。
周囲の脂肪組織から胸部大動脈をきれいにします。大動脈を傷つけないように注意し、端だけを持ってください。大動脈は、最終的に洗浄されるまで脱水を防ぐために、PBSを含むペトリ皿に繰り返し浸す必要があります。
胸部大動脈がきれいになったので、外科用ブレードを使用し、双眼鏡の下で作業して、大動脈を1ミリメートルのリングに均等にスライスします。切断面の下に配置された定規を目安に、切れ味を保つために新しい刃を使用し、時々交換してください。大動脈の端は使用されません 各リングをカットした後、ピンセットを使用して、冷たいPBSを含む新しい皿に非常に優しく移します。
すべてのリングを同じPBS含有プレートに配置して、アッセイがランダム化されるようにします。大動脈の各セグメントは血管新生の電位が多少異なるため、リングを氷の上に置いておきます。次に、プリクールピペットチップを使用してアッセイプレートを調製します。
150マイクロリットルの冷たいBMEの滴の周りの48ウェルプレートの各ウェルに追加すると、滴はドーム運動の途中で固化します。BMEは、物質の輸送、細胞の走化性、そして最も重要なことに、ネオ血管形成につながる細胞の分化と移動を可能にします 周辺井戸はPBSで満たされています BMEの脱水を避けるために、BMEドロップが摂氏37度で20〜30分間固化するようにします。BMEが固まったら、損傷を防ぐためにピンセットを使用してペトリ皿から大動脈リングを慎重に持ち上げ、ピンセットの先端の間に形成される脂質の滴の内側にリングを移す必要があります液体の表面張力の結果として、各ドームの上部中央に単一の大動脈リングを置き、各リングの上部に摂氏37度で10分間インキュベートします。 さらに150マイクロリットルのBMEを加え、20〜30分間インキュベートします。
摂氏37度で、リングはBMEとアッセイに包まれています。材料をプレートに追加して、アッセイを開始できます。Pres は、以前に調製したヒト内皮血清遊離培地を、実験材料または内皮細胞増殖サプリメントのいずれかをネガティブコントロールのポジティブコントロールとして
補充します。メディウムのみを使用してください。500マイクロリットルのpresサプリメント培地を各ウェルに加え、摂氏37度で6〜12日間インキュベートします。このインキュベーション期間中、顕微鏡でプレートを検査し、大動脈から発芽する血管と、さらに分岐する血管によって同定された高度な成熟血管を探します。
リング組織から伸びて、標準的な位相コントラストステレオスコープで6日目から12日目の間にリングを3次元的に撮影する必要があります。さらに、6日目から12日目までのさまざまな日に上清を収集し、1日またはEloquaで使用するために4度で保存し、将来の使用のためにマイナス20度またはマイナス80度で保存します。上清は、vgfのElizaや一酸化窒素レベルのグリースアッセイなど、さまざまな手法で分析できます。
これらの画像は、ウェルにリングを配置し、培養物、画像の最上列に見られる培地、または血管発芽のポジティブコントロールとして使用されるECGSのいずれかでインキュベートしてから12日後に収集されました。下部パネルにあります。各画像は、12個のリングのうち4個の代表的なスナップショットであり、通常、条件ごとにアッセイで使用されます。
各別々のウェルの各大動脈リングの角は黒です。このように撮影すると、ECGSにさらされた大動脈輪は血管の成長を示し、矢印は形成された多くの血管のいくつかを指しています。各血管は内皮細胞の鎖として特徴付けられ、時折分岐して成熟していることを示しています。
培養物中に発芽血管は観察できません。トップパネルのミディアムウェル、この手順を行う際に大動脈コーアッセイを実行する方法を示しました。正確に作業し、彼らの条件の下で作業することを忘れないことが重要です。
というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、制御された環境下でマウスの大動脈から血管の芽生えを可能にすることで血管新生を研究するために設計された大動脈リングアッセイを紹介します。このアッセイでは、新生血管の成長に対する新生血管化合物の直接的な追加を可能にし、数日間にわたる新生血管の成長の効果を評価することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 血管新生
- 血管生物学
- 実験的アッセイ
背景
- 血管新生は生理学的および病理学的プロセスの両方にとって重要です。
- 大動脈リングアッセイは血管形成を研究するためのモデルを提供します。
- 血管新生を理解することで、さまざまな疾患への洞察が得られます。
- このアッセイでは3Dマトリックス内で異なる化合物のテストが可能です。
研究の目的
- 血管新生を研究するための柔軟なシステムを開発すること。
- 血管新生促進剤と阻害剤の効果を評価すること。
- in vitroで大動脈リングからの血管の芽生えを観察すること。
使用された方法
- マウスから胸部大動脈の解剖。
- 大動脈リングの準備と3Dマトリックスへの配置。
- 実験用試薬による大動脈リングのインキュベーション。
- 6-12日間の新生血管の成長の観察。
主要な結果
- 大動脈リングからの血管の芽生えの成功。
- さまざまな化合物の血管新生ポテンシャルの評価。
- 異なる実験条件に対するアッセイの柔軟性の実証。
- 血管新生のメカニズムへの洞察。
結論
- 大動脈リングアッセイは血管新生を研究するための貴重なツールです。
- 制御された環境下で血管新生因子の直接的なテストを可能にします。
- 結果は血管発達と関連疾患の理解に貢献できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The aortic ring assay provides a physiologically relevant organotypic model for evaluating angiogenic and anti-angiogenic compounds in early discovery. By enabling direct compound testing in a 3D matrix with quantifiable neovessel outgrowth, it supports mechanistic de-risking of vascular targets and pathway validation. This assay bridges in vitro endothelial screens and in vivo models, improving predictive confidence in lead identification for cardiovascular, oncology, and ischemic disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing compound effects on sprouting from intact aortic tissue.
- Operational Value: Enables functional validation of angiogenic targets using a native vascular explant system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with measurable effects on vessel formation in a disease-relevant context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for dose-response screening of angiogenic modulators.
- Operational Value: Standardizes readouts through phase-contrast imaging and supernatant collection for biomarker analysis.
- Scalability Value: Supports 6-replicate testing per condition to address biological variability and ensure assay robustness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through use of murine aorta, reflecting in vivo-like angiogenic responses.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling longitudinal monitoring of neovessel outgrowth.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by identifying compounds with consistent pro- or anti-angiogenic activity across replicates.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a functional readout that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking compound treatment to phenotypic changes in vessel sprouting and maturation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized BME embedding and randomized ring placement to minimize positional bias.
- Analytics: Generates quantitative outputs via image analysis of sprout length/branching and ELISA-based measurement of angiogenic factors in supernatants.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling angiogenic responses in a tissue-contextual system.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening diverse compound libraries across therapeutic areas involving vascular pathology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by observing direct effects on neovessel formation from native tissue.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized ring preparation, BME doming, and replicate testing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic validation of vascular activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on angiogenic efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and tissue handling under sterile conditions.
- Dependent on consistent BME quality and proper gelation at 37°C for dome formation.
- Necessitates standardized imaging protocols and blinded analysis to minimize observer variability.
- Involves optimization of compound dosing and incubation times based on solubility and stability in aqueous medium.
- Limited by biological variability between aortic segments, necessitating replicate testing for statistical confidence.
