Name: マウスにおけるプログラム電気刺激 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学ぶマウスにおけるプログラム電気刺激法で、不整脈誘導と心臓伝導特性の評価を行う方法です。心腔内電図記録により不整脈原性基質を同定し、前臨床研究に有用です。

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XHTWは、医学研究でWMケック財団特別若い学者であり、そしてまた、NIH / NHLBIの助成金R01 - HL089598とR01HL091947、および筋ジストロフィー協会の助成金＃69238でサポートされています。この作品は、ハートのCaMKIIシグナリングのための財団Leducqアライアンスによって部分的にサポートされています。 NLは、心臓リズム学会と2009年から2012年米国心臓協会ポスドクフェローシップから心臓ペーシングと電気生理学における2009年から2010年ミシェルMirowski国際フェローシップの受賞者です。

パート1。外科的準備<ol><li>プログラム電気刺激の実験はマウスで生存の手術として行われる場合には無菌状態が必要になります。定期的な明確な手術手技で十分となるしかし、実験の最も一般的なタイプは、自然界にある端末です。 </li><li>マウスは0.5 L /分100％のイソフルラン2％を使用してO 2麻酔です。 </li><li>バリカンは、ネックラインからミッド胸の高さに毛を剃るために使用されます。 </li><li>その手足は、加熱板（インダスインスツルメンツ、ヒューストン、テキサス州）に組み込まれているECG電極の上にテープで麻酔マウスは、仰臥位に配置されます。と外科領域は10％ポビドンヨードで消毒されています。推奨されるシステムは、体温が37.0℃で± 1.0℃に維持されるように、thermoanalyzerシステムによって制御される加熱パッドに接続されて直腸温度プローブが含まれています</li></ol>パート2。右心房と心室にカニュレーションし、EPカテーテルの挿入<ol><li>マウスが完全に麻酔であることをつま先ピンチで確認後、1 / 2インチの切開は、鎖骨のレベルで尾側末端と正中線の右側に行われます。 </li><li>皮下組織、唾液腺、およびリンパ組織は、右頸静脈を可視化する鈍的切開によって分離されています。 </li><li>静脈の近位端は、6から0縫合糸で結ばれている。カテーテルを挿入しながら、この縫合糸を軽く引っ張ると、内頸静脈をまっすぐになります。別の縫合糸は、可視化、セグメントの先端に静脈の下に配置されます。カテーテルが心臓内に最適に配置されていると、この縫合糸は、止血を確実にし、目的の位置（ 図1）にカテーテルを維持するために、カテーテルの周囲に固定されます。 </li><li>コンピュータベースのデータ収集は、現在、表面心電図と同時に心臓内electrograms（すなわち、IOX - 2集録ソフトウェア、Emka技術、VA、米国）の4リード線を記録するために開始されます。心内電位図記録については、カテーテルの電極は、"録音"モード（すなわち、モデルSTG3008、マルチチャンネルシステム、ロイトリンゲン、ドイツ）の外部刺激に接続されています。 </li><li>マイクロはさみを使用して、小さな切開は、静脈の長手方向に作られ、そして1.1F octapolarカテーテル（EPR - 800、ミラーインスツルメンツ、ヒューストン、テキサス州）は右心房に静脈を介して進められる。そっと近位縫合糸を引っ張るとまっすぐに内頸静脈を保つのを助けると右心房と心室にカテーテルを簡単に通過できるようになります。適切なカテーテルの位置は、それぞれ右心室、右心室、房室結節、および右心房のベース、（ 図2）の頂点のレベルで4心臓内electrogramsの波形の可視化によって検証されます。 </li><li>遠位縫合糸は、今カテーテルの位置を確保し、可能な限り出血を防ぐためにオフ結びついています。 </li></ol>第3部。プログラム電気刺激<ol><li>他の電極対は、"録音"モードのままにしながら選択的な心房ペーシングの場合には、アトリウム内にある電極対は、"再コード化"モードから"刺激"モードに切り替えられます。 </li><li>マウスの心房性不整脈に増加脆弱性を持っているかどうかを判断するには、右心房の心臓電気刺激法が実行されます。最初に、心房ペーシングの閾値は、刺激のキャプチャの一貫性をテストするために別の基本的なサイクルの長さ（BCL）で2ミリ秒の電流パルスを（少なくとも50）を適用することによって決定されます。最初のパルス列のBCLは、本質的なBCLよりわずかに低く、そして10ミリ秒（たとえば、100ミリ、90ミリ、80ミリ秒、および70ミリ秒）減少しています。刺激のキャプチャに必要な典型的な電流の振幅は100〜200μAです。 </li><li>洞結節回復時間（SNRT）は100ミリ秒のBCLで15秒心房ペーシングの列車を適用した後に測定されます。 SNRTは、ペーシング電車の中で最後の刺激と最初の自発的な洞性拍動の発症との間の間隔として定義されます。 </li><li>心房有効不応期（AERP）が結合した短いS2早期刺激による固定BCLs（すなわち、100ミリ秒）での心房ペーシングの列車のシリーズを適用することによって決定されます。 S1 - S2間隔は徐々に70msから20msに各ペーシング電車の中で2ミリ秒で減少します。 AERPはS2（普通列車のパルスれS1、およびS2早期刺激）と伝播ビートを生成するために失敗した心房の最長S1 - S2カップリングの間隔として定義されています。各刺激のプロトコルとの間で、少なくとも30秒間の回復期間があった。 </li><li>房室の有効不応期（AV）ノード（AVNERP）が結合したS2早期刺激と100ミリのBCLで心房ペーシングの列車のシリーズを適用することによって決定されます。 S1 - S2間隔は徐々に減少するミリ秒70〜20ミリ〜2ミリ秒ごとにペーシング電車。 AVNERPは、アトリウムに配信早期刺激が彼の潜在的ではなく、QRS波に先行しているで最長のS1 - S2カップリングの間隔として定義されています。各刺激のプロトコルとの間で、少なくとも30秒間の回復期間があった。 </li><li>心房細動（AF）、Verheule らにより記載されたバーストペーシングプロトコルを使用してテストすることを含む心房性不整脈の誘発2 2 2番目のバーストのシリーズは、心房性不整脈の誘発性を決定するために適用されます。最初の2秒のバーストは、40ミリ秒の周期の長さ（CL）を持ち、それぞれの連続する2秒のバーストは、20ミリ秒の最後のCLになるまで、前のバーストより短い2ミリ秒のCLを持っています。不整脈基質の非存在下で、心臓はペーシングプロトコルの直後に洞調律を再開します。心室応答の周波数は、心室の心電図に見られるように、一般に低速であるのに対し、心房粗動の場合には、、心房電位に見られる速い波の規則的なパターンが存在します。心房細動の場合には、表面心電図はP波のない状態で不規則なRR間隔が表示されます。心室の心電図は不規則と遅い心室波（ 図3）を明らかにする一方、さらに、心房電位は、迅速かつ不規則な波が明らかになります。不整脈誘発のプロトコルは、通常三連で行われ、それが3試験の少なくとも2つに誘発することができれば不整脈が存 ​​在すると考えられている。3,4。 </li></ol>パート4。カテーテルの除去<ol><li>すべてのペーシングプロトコルが終了した後、データ収集が停止されます。カテーテルの遠位端の縫合はやさしくカテーテルを解放するために、遮断されます。 </li><li>ターミナルEP研究の場合には、結び目を穏やかにカテーテルを解放するために緩めている。 </li><li>イソフルランの下に頚椎脱臼を使用しながら研究の結論で、マウスを人道的に安楽死されます。 </li></ol>代表的な結果表面心電図と心内electrograms は 、in vivo電気生理学的研究では全体に同時に記録され、そしてすべてのプロトコルの終了後に詳細に検討されています。ベースラインの電気生理学的パラメータには、PR間隔、PQ間隔、QRS幅、QT間隔、およびQRSの形態が含まれています。これらのパラメータは、手動で測定し、または自動的にデータ集録ソフトウェアIOX - 2またはECG - AUTOを（Emka技術、VA、米国）を使用することができます。 SNRT、AERP、およびAVNERPは、洞結節"ペースメーカー"機能、心房、およびAV結節伝導の特性、それぞれに関する情報を提供します。ペーシング誘発性心房細動のエピソードが車路士らによる論文に記載されています。4の例<img src="/files/ftp_upload/1730/1730fig1.jpg" alt="ラットの手術セットアップ;頸静脈カテーテル法;心肺図;長さ測定チャート。" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図1"> 図1：マウスの電気生理学的試験のための心臓内カテーテルのイラスト。A.右内頸静脈を単離し、カニューレを挿入しています。適切なカテーテルの位置が達成されれば静脈の遠位端はオフに関連付けられています。Bは 。マウスは、この手順のため仰臥位に配置されます。C.の漫画は、カテーテルの心臓内の位置を描いた。一対の電極はそれぞれ、右心室、右心室の基部、房室結節、および右心房の頂点のレベルに位置しています。Dは 。 1.1F octapolarカテーテルのアップを閉じます。図は、マートゥルらから変更。サークArrhtyhm Electrophys 5の許可を得て。 <img src="/files/ftp_upload/1730/1730fig2.jpg" alt="ECG波形図;心臓の電気的活動を表示します。PQRS複素分析が含まれます。" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図2"> 図2。マウスの代表的な表面心電図と心内Electrograms。リードIIの毎分540ビートの頻度で定期的な洞調律を示した。（BE）バイポーラ心腔内心電図の記録が右心房（B）のレベルでは、房室結節を設定（C）、とのベースの（A）表面心電図右心室（D）、および右心室の心尖部（E）、それぞれ。パネルBにおける心内膜の波は、表面ECG上でP波に相当することに注意してください。心室の心電図上のV波は表面心電図上のQRS波に相当する。 <img src="/files/ftp_upload/1730/1730fig3.jpg" alt="心電図電気生理学研究;リード II、心房、心室電図;心拍リズム分析図。" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="図3"> 図3。心房バーストペーシング後心房細動を開発したマウスの代表的な表面心電図と心内electrograms。

<ol><li>Nattel, S., Shiroshita-Takeshita, A., Brundel, B. J., Rivard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+atrial+fibrillation%3A+lessons+from+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Cardiovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of atrial fibrillation: lessons from animal models.</a> Prog Cardiovasc Dis. 48, 9-9 (2005).</li>
<li>Verheule, S., Sato, T., Everett, T. t, Engle, S. K., Otten, D., Rubart-von der Lohe, M., Nakajima, H. O., Nakajima, H., Field, L. J., Olgin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vulnerability+to+atrial+fibrillation+in+transgenic+mice+with+selective+atrial+fibrosis+caused+by+overexpression+of+TGF-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1.</a> Circ Res. 94, 1458-1458 (2004).</li>
<li>Sood, S., Chelu, M. G., Oort, R. J. van, Skapura, D., Santonastasi, M., Dobrev, D., Wehrens, X. H., H, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+leak+due+to+FKBP12.6+deficiency+in+mice+facilitates+the+inducibility+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium leak due to FKBP12.6 deficiency in mice facilitates the inducibility of atrial fibrillation.</a> Heart Rhythm. 5, 1047-1047 (2008).</li>
<li>Chelu, M. G., Sarma, S., Sood, S., Wang, S., van Oort, R. J., Skapura, D. G., Li, N., Santonastasi, M., Muller, F. U., Schmitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+kinase+II-mediated+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+promotes+atrial+fibrillation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Calmodulin kinase II-mediated sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak promotes atrial fibrillation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 1940-1940 (2009).</li>
<li>Mathur, N., Subeena, S., Wang, S., van Oort, R. J., Sarma, S., Li, N., Skapura, D., Bayle, J. H., Valderrabano, M., Wehrens, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sudden+Infant+Death+Syndrome+in+Mice+With+an+Inherited+Mutation+in+RyR%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Arrhythmia+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Sudden Infant Death Syndrome in Mice With an Inherited Mutation in RyR.</a> Circ Arrhythmia Electrophysiol. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

心臓カテーテル検査中に、カテーテル挿入時の広範な出血は、血液量減少に起因する心拍数を増加する可能性があります。このケースでは、滅菌生理食塩水の腹腔内注射（0.3 1.0 mL）を充填圧力を正規化ができ、マウスでの血行動態のストレスを軽減。 イソフルランよりも長い2時間、またはイソフルランの高濃度（&gt; 2％）への曝露がマウスの心臓と呼吸機能を抑制することができます。したがって、すべての試験は2時間以内で完了することをお勧めします。また、体温が常に正常範囲37.0 ± 1.0℃以内に維持されることが不可欠である低体温と高体温の両方が、心臓のリズムと不整脈基質の存在する可能性に影響を与えます。 各実験は、心房捕捉しきい値を決定することによって開始する必要があります。心房ペーシング、心房閾値、SNRT、AERP、およびAVNERPの場合には洞結節、房室結節、および心房組織の伝導特性が正常であるかどうかを評価するために決定されるべきである。

マウスにおけるプログラム電気刺激

Programmed Electrical Stimulation in Mice

遺伝子組み換えマウスは、伝導障害、心房と心室性不整脈、および心臓突然死の分子メカニズムを研究するのが好ましい動物モデルとして浮上している。<sup&gt; 1</sup&gt;心内ペーシング研究は頸静脈に挿入1.1F octapolarカテーテルを使用してマウスで行われ、右心房と心室に進出することができます。ここで、我々は、マウスでプログラムされた電気刺激を行うために必要な手順を示しています。心房の心内ペーシングが外部刺激を用いて行われるのに対し、表面心電図と心内electrogramsは、心房、房室接合部、および心室心筋に同時に記録されます。このように、マウスでプログラムされた電気刺激は伝導欠陥や不整脈の根底にある分子メカニズムを探求するユニークな機会を提供しています。

プログラム電気刺激は、心臓の伝導特性を決定する能力、および様々なペーシングプロトコルを使用して不整脈を誘発し、終了する可能性を提供します。経静脈カテーテルを使用して、心内電位図記録は、不整脈基質を同定するためにプログラムされた電気刺激のプロトコールに従って、マウスで入手できます。

遺伝子組換えマウスは、伝導異常や心房および……の根底にある分子メカニズムを研究するための好ましい動物モデルとして登場しています。

麻酔をかけたマウスを仰向けにHeating boardにテープで固定します。右頸静脈を剥離し、静脈の近位端を結紮します。1.1 French OC Apolarカテーテルを静脈に挿入し、その後、カテーテルを右心房および右心室まで進めます。最後に、カテーテルの位置を固定し出血を防ぐため、静脈の遠位端を結紮します。こんにちは。私はベイラー医科大学分子生理学・生物物理学部のZver博士の研究室に所属するNaaliです。本日は、マウスにおける電気刺激のプログラミング手順について解説します。当研究室では、マウスにおける誘発性不整脈の研究にこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。カニューレ挿入およびカテーテル留置の手術を行う前に、麻酔をかけたマウスの首のラインから胸の中央までをバリカンで除毛します。10%ポビドンヨードで手術部位を消毒します。マウスを仰臥位にし、四肢をECG electrodes Incorporated社のECG電極にテープで固定します。加温ボードについては、熱分析システムで制御されるヒーティングパッドに接続された直腸温度プローブを含むシステムを推奨し、体温を37±1 °Cに維持します。つまみによる刺激でマウスが完全に麻酔されていることを確認した後、鎖骨の高さで正中線から右側に0.5インチの切開を加えます。鈍的剥離により、皮下組織、唾液腺、およびリンパ組織を分離します。右頸静脈を視認させるため、静脈の近位端を6-0縫合糸で結紮します。可視化されたセグメントの末梢端にある静脈の下に、もう一つの縫合糸を配置します。次に、表面心電図を記録するために、コンピュータベースのデータ収集を開始します。カテーテルを記録モードの外部刺激装置に接続します。次に、近位側の結紮糸をそっと牽引しながら、マイクロシザーを用いて静脈の長軸方向に小さな切開を加えます。静脈を直線に保つため、1.1 French Octo プラーカテターを静脈経由で右心房および右心室へと挿入します。カテーテルの適切な位置は、右心室尖部、右心室基部、房室結節、および右心房の4つの心腔内電位の波形を確認することで検証します。最後に、カテーテルの位置を固定し、心房ペーシング時の出血を防ぐため、遠位側の結紮糸を縛ります。心房内に配置された電極対を記録モードから刺激モードに切り替え、他の電極対は記録モードのままにします。マウスが心房性不整脈に対して脆弱性が増しているかを確認するため、右心房にプログラム電気刺激を行います。まず、刺激キャプチャの整合性を検証するため、異なる基本サイクル長（BCL）で少なくとも 52 millisecond の電流パルスを印加し、心房ペーシング閾値を決定します。初期パルス列のBCLは、固有のBCLよりもわずかに短く、10 milliseconds減少させます。刺激キャプチャに必要な一般的な電流振幅は100 to 200 microampsです。BC 100 millisecondsで15秒間の心房ペーシング列を適用した後、洞結節回復時間（SNRT）を測定します。SNRTは、ペーシング列の最後の刺激から最初の自発的な洞拍動の開始までの間隔と定義されます。心房有効不응期（A ERP）を測定するには、一定のBCLSで心房ペーシング列を適用し、S1刺激の後に、より短い早いため刺激S2を加えて行います。S1-S2間隔は、各ペーシング列において70 msから20 msまで2 msずつ段階的に短縮させ、各刺激プロトコルの間には少なくとも30秒の回復時間を設けます。A ERPは、S2によって伝導した拍動が生成されなかった心房における、最長のS1-S2カップリング間隔として定義されます。心房ペーシングトレインと期前刺激を用いた同様の手法により、房室結節の有効不応期（AV NERP）を決定します。AV NERPは、心房に送られた期前刺激の後にhis電位は認められるが、QRS波は認められない最大（最長）のS1-S2カップリング間隔として定義されます。心房細動を含む心房不整脈の誘発性は、一連の2秒間のバースト刺激を適用するバーストペーシングプロトコルを用いて検証することが可能です。最初の2秒間のバーストのサイクル長（CL）は40ミリ秒であり、その後、最終的なCLが20ミリ秒になるまで、各2秒間のバーストのCLを前のバーストよりも2ミリ秒ずつ短くします。すべてのペースメーカープロトコルが完了した後、データ収集を停止します。終末電生理学的（EP）研究の場合、結び目をゆっくりと緩めてカテーテルを外します。ここでは、マウスにおける代表的な体表面心電図（ECG）および心腔内電位図を示します。この体表面心電図は、約 540 beats per minute の周波数で規則的な洞調律を示しています。続く4つの電位図は、右心房レベルでの双極心腔内電位図記録です。房室結節、右室底および右室心尖部。右心房レベルの心内電図記録における心房a波は、体表面心電図のP波に対応します。心室電図のV波は、体表面心電図のQRS波に対応します。次に、代表的な体表CCGおよび心腔内電図と、体表からの心房バーストペーシング後に心房細動を発症したマウスを示します。CCGでは、RR間隔が不規則であり、明らかなP波は認められません。一方で、心房電図では、心房細動に一致する不規則で速い心房信号が認められます。心室電図は、体表誘導のRR間隔と同様に、より低い周波数を示します。マウスにおける電気刺激のプログラミング方法について説明しましたが、この処置を行う際は、過度な出血を避け、体温を36から37°Cの正常範囲内に維持することが重要です。さらに、イソフルランへの曝露を最小限にするようにしてください。2時間を超える曝露や高濃度での曝露は、マウスの心機能および呼吸機能を抑制する可能性があります。したがって、すべての開始操作は2時間以内に完了させることを推奨します。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。

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マウスにおけるプログラム電気刺激

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