Name: 自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: 学ぶ光遺伝学的手法による自由に動くマウスの神経活動操作と行動制御。特定の神経集団を標的にした光ファイバー埋め込み技術を用いて、神経回路の時空間的制御と行動変化を詳細に解明する方法です。

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クラウス・アルミン・ナルヴェ教授とサンドラ・ゲッベルス博士(ドイツ・ゲッティンゲンのマックス・プランク実験医学研究所)に感謝します。また、この記事のJoVEビデオの録画と処理に関するビデオチームのユヌス・ディキチとルーベン・ヴィースナーに感謝します。さらに、クリスティン・クラウセンのナレーションとキンバリー・アン・ゴーが原稿を校正してくれたおかげです。
提示された結果はボーフムのルール大学で得られ、ビデオはブレーメン大学で記録されました。
この作品は、ドイツ・フォルシュングスゲマイインシャフト(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました - Projektnummer 122679504 - SFB 874とDFG MA 4692/3-2。

著者らは開示するものは何もない。

中枢神経系における神経回路の調節とその行動結果は、特に精神疾患や学習や記憶などの認知タスクにおいて、脳の仕組みを理解するために重要です。光遺伝学では、単一細胞または細胞集団は、回路全体まで光によって変調することができる。Channelrhodopsin2(ChR2)やArchaerhodopsin(Arch)のような一般的な光遺伝学的ツールは、ニューロンを活性化または沈黙させ、または別個の脳領域11、2、3、42,3に投影する軸索末端での送信機放出を増加または阻害することができる。,4しかし、Archは、シナプス前の端末での活性化が自発的な送信機放出を増加させることが示されたように、慎重に使用する必要があります5.アーチは、細胞内のpH値を変化させる外側の整流プロトンポンプである。このアルカリミリューはカルシウム流入を誘導し、送信機放出を増強する 5.細胞内シグナル伝達経路を特異的に調節するために、ロドプシンやコーンオプシンなどの光活性化可能な光遺伝学的ツールからなる受容体キメラを、適切なGタンパク質共役受容体と組み合わせて、6、7、86,7,8を作成することができる。利用可能な光遺伝学的ツールの量と変動は、過去10年間で大幅に増加しました 9.
光遺伝学の目的は、行動中に神経回路を操作することです。光遺伝学は、例えば、不安行動の変化などの急性行動変化の測定を可能にする。光遺伝学的ツールは、ウイルスベクターを介して脳の標的領域に送達される。特別なプロモーターやエンハンサー、またはCre-loxPシステムの助けを借りて、細胞型特異性は光遺伝学的ツールの発現のために保証することができる(図1A)。特定の細胞タイプでのみ酵素Cre-Recombinaseを発現する遺伝子組み換えマウスラインがいくつか存在する。例えば、Nex-Creマウスは、皮質中の錐体ニューロンおよびNex-促進器10の制御下の海馬におけるクレリコンビナーゼを発現する。この酵素は、loxP側11に横たわるDNA配列を反転させることができる。したがって、loxP側によって反転され、横たわっている二重凝解光遺伝学的ツールのDNA配列は、他のニューロンタイプ12、13,13ではなく、Cre-Recombinaseを有するニューロンによってのみ転写することができる。Nex-Creマウスの場合、光遺伝学的ツールはピラミッド型ニューロンのみで発現する。特定の脳領域の光刺激は、その後、関心領域の真上の光ファイバーの慢性注入を介して達成される。動物は適切な光源に結合され、ほぼすべての種類の行動テストで自由に行動することができます。
<img alt="光遺伝学図:Cre-Recombinaseによる遺伝子編集、ウイルス注入、および光ファイバのセットアップ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:注射と注入。A) ChR2-YFP 用の Cre-loxP システム。二重凝集光遺伝学的ツールは、脳組織への注射のためのアデノ関連ウイルス(AAV)に詰め込まれています。B)mPFCのIL領域への/上の光学神経インターフェースのウイルス注入および注入の矢状の見解。注射および注入は上から行った。対象地域である IL、BLA、DRN が表示されます。C)埋め込み光ファイバー、スリーブ、光源の詳細図。D)200μm光ファイバーから灰色物質の脳組織に青と赤のレーザー光刺激を広げる(Yizharら 2011)。青色光が広がり、最大で0.5mmの組織に、赤色光は約1mmです。色分け:赤50%、黄色10%、緑5%、青色1%(光がこの領域に到達した場合)。EE)200 μmの光ファイバーを用いた左ILの真上の一方的な注入のコロナ図。IL領域は、各半球で0.25ミリメートルの幅と0.2ミリメートルの深さを持っています。青と赤の電球は、5%の光が広がるボーダーであり、Yizharらから適切なサイズに転送されます。ロクスP:X-オーバーP1の軌跡;ChR2: チャネルロドプシン;YFP: 黄色の蛍光タンパク質;dflox: ダブルフラックス;IL: 赤外線皮質;BLA: バソラテラアミダラ;DRN: 後回しのラフェ核;PrL: 前縁領域。この図は、Berg 201948から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
光遺伝学的アプローチは、高い時間的および空間的分解能14 および細胞型特異的変調の両方を可能にするとして利用される。さらに、それ以上の治療を行うことなく、埋め込み装置を繰り返し使用することができる。定位的手術の後、光遺伝学的ツールを運ぶアデノ関連ウイルスの注入および光ファイバーの移植が行われるところで、マウスは2週間回復することができる。手術から回復し、ウイルスが発現するのに十分な時間であるため、我々は、わずか2週間の回復時間を選択しました。行動実験は免疫検査が続くため、実験中にマウスが古くなりすぎないようにする必要があります。そうでなければ、組織の質が低下します。彼らはインプラントから明らかな行動障害を示さないし、典型的なケージの行動に従事する。もちろん、移植は重要な外科的病変を伴う。したがって、マウスは集中的に監視されます。手術後、グループ収容マウスはお互いの新鮮な傷やインプラントを傷つける傾向があり、マウスは単座化する必要があります。しかし、単一の収容マウスは不安レベルが低い15 を示し、一般的にうつ病のような症状が少ない16の場合、住宅状態は雄マウスの不安レベルに大きな影響を与える。
脳回路の化学的または電気的操作は、光遺伝学の高い細胞型特異性を欠き、より低い時間的および空間分解能14、17、1817,18を有する。14実験問題に応じて、電気的または化学的刺激は異なる利点を有することができる。特定の領域でファイバー端子を通過する場合も刺激する必要がある、電気刺激が最良の方法です。化学刺激は、全領域の送信機特異的受容体がアゴニストによって活性化されるべき場合に適した選択である。光遺伝学の化学的または電気的刺激と比較する別の大きな利点は、内因的には、ニューロンが光に敏感ではないということで、副作用19の発生を回避する。確かに、高い光強度は加熱効果88、2020を誘発するかもしれないが、適切な対照群のために、光遺伝学的操作による行動効果を排除することができる。
げっ歯類の挙動を調査することは、特に精神疾患に関して、自由に動く動物の光遺伝学によって、特定の細胞集団21および回路22までの単一の受容体の直接変調を可能にするので、大幅に改善された。このような変調の急性の影響を測定する可能性は、定義された時間23後または慢性刺激24後の長期的な行動効果と同様に、実験設計の広い柔軟性を可能にし、脳回路に非常に詳細な洞察を提供する。光刺激は、光遺伝学的ツールの注射部位に位置するニューロンを調節するために使用することができる。注射と注入の両方が同じ脳領域に対処する場合、この領域における主体ニューロンおよびインターニューロンの軸索を突き出す細胞体および背部は33、6、86,8を標的とすることができる。しかし、光繊維は、注入されたものとは異なる領域に移植することもできる。この場合、光刺激は、注入領域25、26、27,26,27の突起領域における軸索末端での送信機放出を調節することができる。
ここでの研究では、光遺伝学は、不安関連の行動を分析するための実験と組み合わせて使用されます。不安関連の精神疾患は、世界人口の3分の1以上に影響を及ぼす28,29,30人で、経済的負担が高い28,29,3031.影響を受けた人々は、覚醒感、緊張感、心配の後に回避行動32、33,33に苦しんでいます。これらの慢性的に発生する否定的な感情は、主に将来の出来事34に焦点を当て、患者の日常生活を強く妨げる。ベンゾジアゼピンや選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)のような一般的な治療法は、患者の一部でのみ成功しています。35の治療に多くの人が反応せず、そのような35病気の根底にあるメカニズムがまだ完全には理解されていない。内側前頭前野(mPFC)は、,不安,21、25、27、36、37、38の発達と症状において重要な役割21,25,2737を38果たすることが知られている。36具体的には、mPFCにおける眼内皮質(IL)領域の過剰活性化は、不安関連障害の一部である可能性があります39,,40.ここで説明する実験例は、mPFC の IL 領域の変調が不安行動にどのように影響するかを理解するのに役立ちます。さらに、不安関連精神疾患に対する新しい治療戦略の開発も潜在的に支持される可能性がある。
生後2〜6ヶ月の雄のNex-Creマウスは、mPFC41のIL領域内の錐体ニューロンにおいて特にChR2を発現するために使用される。Nex-CreマウスはC57Bl/6バックグラウンドを有し、酵素Cre-recombinaseを特に錐体ニューロンで発現する。立体的手術中、二重凝集したChR2-DNAは、アデノ関連ウイルスベクターを介してIL領域に注入される。光学インプラントは関心のある領域の真上に置かれ(図1B)、インプラントは歯科用セメントで固定される。コントロール動物は、細胞特異的発現を模倣するために、同じ領域で二重フロックスtdTomato-DNAの注射を受ける。
動物は手術の日までグループ収容され、その後は他のマウスによる怪我を避けるために単座化されています。マウスは、単一のマウス用のTypI-Lケージ内の個々の換気ケージ(IVC)ラックに収容されます。明暗サイクルは12:12のリズムに従い、明度の位相は午前10時から始まります。すべての行動実験は、げっ歯類の活性段階に似た暗い段階で行われます。水および標準的な食糧の餌は、アドリビタム利用可能である。2週間の回復の後、錐体ニューロンにおけるChR2の十分な発現を保証し、マウスは行動実験に使用される。
オープンフィールド(OF)は、サンドブラスト40センチの高い壁を持つ50cm x 50 cmの正方形の迷路です。地面は、内側の4が中心を表す16の正方形に分割されています。測定される動作は、1) 中心に費やされた時間、2) 中心エントリ数、および 3) 移動距離の合計です。この実験の間、合計20分の4つの試験があります。試験1および3では、光刺激が起こらず、かつ試験2および4において、5ms光パルスと1mWの光強度473nmの20Hz刺激が行われる(図2A)。後の試験では、検査領域への慣れが考慮されたが、シャム注入対照動物の使用は、習慣がどのように表現されているかを示す。
バーンズ迷路は学習と記憶のための実験です。直径92cmの円形プラットフォームで、円周の周りに20の等距離の穴が含まれています。19の穴が閉じられ、1つの穴の下にエスケープボックスが提示されます。4日間連続して、マウスは脱出箱の位置を知るために4つのトレーニング試験を受ける。5日目にエスケープボックスを取り除き、マウスは正しい穴を見つけるのにどれくらいの時間が必要かをテストされます。測定された動作は、1)エスケープボックス/正しい穴が見つかるまでの時間、2)ターゲットの訪問数とエラー数、および3)エスケープボックス内に移動するまでの距離です。異なるグループの光刺激は、トレーニング日1〜4日に行われる取得または統合中、または試験日の検索中(5日目)に行われます(図2D)。
<img alt="行動実験図: オープン フィールド (OF)、高架プラス迷路 (EPM)、バーンズ迷路 (BM)。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2 光遺伝学的プロトコルを用いた行動実験A)対応する光刺激プロトコルを用いたオープンフィールド実験の模式図。 C)対応する光刺激プロトコルを用いた上昇プラス迷路実験の模式図。 D)対応する光刺激プロトコルを用いたバーンズ迷路実験の模式図。EPM: 上昇プラス迷路;OF: オープンフィールド;BM:バーンズ迷路テスト。この図は、Berg 201948から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
光遺伝学的刺激のためには、光強度と周波数を、調査中の光遺伝学的ツールと神経細胞型に適合させなければならない。いくつかの研究は、強い光強度88、2020のために可能な加熱効果があることを示しているように、組織への損傷を避けるために、可能な限り低い光強度を使用する必要があります。ChR2の場合、5 msの光パルスを有する20Hzの刺激が一般的に2.ChR2は非常に光に敏感であるため、1mWの光強度で十分です。光刺激プロトコルは、光のオフと試験の間で交互に行動の変化を測定します。行動実験のための外部の部屋の条件は、動物のグループ全体のために安定したままでなければなりません.考慮すべき重要な条件は、ノイズ(デバイス自体がノイズを作る可能性があることを覚えておいてください)、臭い(常にエタノールで行動設定をきれいにする)、光強度、および実験者です。実験者は常に同じ人物でなければなりません。さらに、実験の時間は、1つのグループ内のすべての動物について同じであるべきであるが、施設内の暗位相の開始の数時間後が好ましい。
この実験の目的は、励起的な錐体ニューロンの強い活性化を通じてIL領域の励起/阻害(E/I)比を増加させることである。この特殊な皮質領域におけるE/I比の強化は、マウス40、42、43、4442,43,44の不安レベルを増加させることが知られている。40

<table><tbody><tr><td>ケタミン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>K2753-64</td><td></td></tr>麻酔<tr><td>20%グルコース</td><td>AlleMan Pharma Injection</td><td></td><td>s.c.迅速な回復のための</td></tr>行動<tr><td>迷路コ</td><td>スタムは、</td><td>不安を測定する</td>Bepanthenバイエル眼科軟膜Betaisodona Monodipharmaヨウ素を含む滅菌剤を作った<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betaisodona</td><td>Monodipharma</td><td></td><td>ヨウ素軟</td></tr><tr><td>双眼オ</td><td>リンパス</td><td>SZ52, 110AL0.62x WD160</td><td>手術</td></tr><tr><td>セラミックフェルール</td><td>Thorlabs</td><td>CFLC230-10</td><td>インプラント</td></tr><tr><td>セラミックファイバースクライブ</td><td>Thorlabs</td><td>CSW12.5</td><td>ガラス繊維の切断</td></tr><tr><td>Channelrhodopsin2-YFP ウイルス</td><td>Penn Vector Core</td><td>Addgene 20298</td><td>Optogeneticツール</td></tr><tr><td>圧縮空気</td><td>Kontakt Chemie</td><td>Druckluft 67</td><td>頭蓋骨の乾燥</td></tr><tr><td>座標系</td><td>手術のためのStoelting</td><td></td><td>定位座標</td></tr><tr><td>Correl Draw</td><td></td><td></td><td>グラフィカルソフトウェアバージョン13</td></tr><tr><td>Cryoslicer</td><td>MICROM</td><td>HM500OM</td><td></td></tr><tr><td>Ethovision XT 14</td><td>Noldus</td><td>を染色するための脳スライスの作成</td><td>行動追跡用ソフトウェア</td></tr><tr><td>Exel</td><td></td><td></td><td>統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>フェルール研磨パック</td><td>Thorlabs</td><td>D50-F</td><td>インプラント丸型</td></tr><tr><td>側面 ファイバーパッチコード デュアル</td><td>Prizmatix</td><td>オプトジェネティクス-ファイバー 500, 1,20 m, フェルールコア 1,25 mm</td><td>ケーブル、両側移植の2つのインプラントに接続されています</td></tr><tr><td>ファイバーパッチコードシングル</td><td>Prizmatix</td><td>オプトジェネティクス-ファイバー500、1,20 m、フェルールコア1,25 mm</td>ケーブル<td>、スリーブを介してインプラントに接続されています</td></tr>ファイバー<tr><td>ストリッピングツール</td><td>Thorlabs</td><td>T06S13</td>インプラント<td>用ガラス繊維ストリッピング</td></tr>フィルター<tr><td>ペーパーVWRヨーロッパ</td><td>516-0300</td>ノ<td>ベルティ抑制給餌テストのために細かくカット</td><td></td></tr>食品<tr><td>ペレットM</td><td>&uuml;hle レバー</td><td>H&ouml;veler Nagerfutter</td><td>マウスのための栄養</td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td>ハーバード装置</td><td>GC150-10</td><td>インジェクションピペット</td></tr><tr><td>Gradia direct-Flo Henry</td><td>Schein</td><td>103322</td><td>液体歯科セメント</td></tr><tr><td>加熱ランプ</td><td>efbe-Schott/Phillips</td><td>R95E</td><td>手術後のマウスの冷却を防ぐ</td></tr><tr><td>加熱プレート</td><td>ストールティング</td><td></td><td>座標に統合システム</td></tr><tr><td>注射カニューレ</td><td>ブラウン</td><td>100 ステリカン、0,4 x 20 mm、Gr.20</td><td>すべての注射と頭蓋骨への穴を開ける</td></tr><tr><td>リッター T</td><td></td><td>1350</td><td>ノベルティ抑制摂食試験のための接地</td></tr><tr><td>マウスケージ</td><td>Zoonlab</td><td>405 cm^2</td><td>実験用シングルハウジング</td></tr><tr><td>オプティボンド FL</td><td>Kerr</td><td>26684E</td><td>移植</td></tr><tr><td>用頭蓋骨の準備光学ガラス繊維</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>インプラント用光繊維</td></tr><tr><td>Optogenetics-LED.STSI</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>行動実験中の光刺激のための光遺伝学ツールボックス</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td>脳を除去するマウスの灌流</td></tr><tr><td>研磨シート 0.02 & マイクロ;m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LFCF</td><td>研磨インプラント 丸い側面</td></tr><tr><td>研磨シート 1 & マイクロ;m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LF1D</td><td>研磨インプラント 丸い側面</td></tr><tr><td>研磨シート 30 &micro;m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LF30D</td><td>研磨インプラント丸型</td></tr><tr><td>研磨シート 6 & マイクロ;m grit</td><td>Thorlabs</td><td>LF6D</td><td>研磨インプラントラウンドサイド</td></tr><tr><td>パルサーソフトウェア</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>ソフトウェア 光デバイス制御用</td></tr><tr><td>Rimadyl-Carprofen</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Analgesia</td></tr><tr><td>Sigma Plot</td><td></td><td></td><td>統計用ソフトウェア</td></tr><tr><td>スリーブ</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>インプラントとライトケーブルの接続</td></tr><tr><td>ナトリウムクロライド (NaCl)</td><td>ブラウン</td><td>3570410</td><td>頭蓋骨のすすぎ</td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>Pattex Henkel</td><td></td><td>フェルールのガラス繊維を固定する</td></tr><tr><td>td-トマトウイルス</td><td>ペンベクトルコア</td><td>Addgene 51503</td><td>光遺伝学ツール</td></tr><tr><td>紫外線</td><td>KoQGHJ</td><td>ワイヤレス、1200 mW/cm^2</td><td>歯科用セメント質用重合ランプ</td></tr><tr><td>キシラベット-キシラジン</td><td>cp pharma</td><td></td><td>麻酔</td></tr></tbody></table>

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

自由に動くマウスにおける神経回路の光遺伝学的調節は、急性および長期の行動に影響を及ぼす。この方法は、中枢神経系のニューロン回路全体まで、単一ニューロンおよび領域特異的送信機放出の操作を行い、行動結果の直接測定を可能にする。ニューロンは、Channelrhodopsin2(ChR2)などの選択したDNAを運ぶウイルスベクターの注入を介して光遺伝学的ツールを発現する。光は、標的領域の真上に終了する慢性光学インプラントを介して特定の脳領域に持ち込まれる。2週間の回復と適切なツール発現の後、マウスは目的のニューロンの光遺伝学的刺激を伴う行動検査に繰り返し使用することができる。
光遺伝学的変調は、化学的または電気的刺激などの一般的に使用される方法と比較して、高い細胞特異性で達成することができる高い時間的および空間的分解能を有する。光は神経組織に害を与えないため、1つのマウスでの複数の行動実験だけでなく、長期実験にも使用できます。光遺伝学的ツールの可能性はほぼ無制限であり、ニューロン全体の活性化またはサイレンシング、あるいは光による特定の受容体タイプの操作を可能にします。
このような光遺伝学的刺激を用いた行動実験の結果は、操作によって引き起こされる行動の変化を直接可視化する。ベースラインとして光刺激を伴わない同じ動物の挙動は、誘発変化に対する良好な制御である。これは、神経の種類や神経伝達物質システムの詳細な概要を可能にする, 不安など、特定の行動に関与.また、神経回路網の可塑性は、光刺激後の長期刺激や行動観察を通じて、非常に詳細に調べることができます。光遺伝学は、神経疾患のいくつかの種類の神経シグナル伝達を啓発するのに役立ちます。

このプロトコルの目的は、光遺伝学的実験中の遺伝子組み換えマウスの挙動の変化を測定することである。光遺伝学的操作は、アデノ関連ウイルスベクターの注入によって行われる。自由に動くマウスの光刺激は、対象領域の真上に光ファイバーを注入して可能である。
図4では光遺伝学的実験の結果を示す。CHR2を介してIL領域の興奮性錐体ニューロンの強い活性化は、オープンフィールドにおける不安関連の行動を増加しました。ChR2は、錐体ニューロンにおける発現のためにNex-CreマウスのmPFCのIL領域に注入された(図4A)。2つの不安テストの間に、オープンフィールド(図4B,C)および新規性抑制された供給テスト(図4F,G)、ChR2は青色光で刺激され、錐体ニューロンを活性化する。対照として、別の群のマウスは、ChR2の代わりにフルオロフォアtdTomatoの注射を受けた(図4D,G)。このような実験では、不安は、より明るい中心領域の回避と定義される。マウスは捕食者を心配しているため、開いた領域の本質的な回避を示しています。
図4Bに示すオープンフィールド実験では、マウスはそれぞれ5分間の4回の試験を実施した。試験1および3では光刺激が起こらず(Off1,2)、試験2および4では、20Hz(5ms光パルス)および1mWの強度(On1,2)で青色光刺激が行われた。ヒートマップは、実験グループでは、中心期間がオフとオンの試験で異なっていることを示しています。光刺激の間、マウスは優先的に国境地帯にとどまる。コントロール動物も国境を好みますが、光刺激時に行動を変えません。図4Cでは、オープンフィールド実験中の主な行動測定値を実験群について示している。データが正常性のシャピロ・ウィルク検定に合格した場合、統計は独立した両側t検定で行われました。正規性検定が失敗した場合、マン・ホイットニー・ランク合計検定は非パラメトリック代替として使用されました。この種の実験では、実験動物や制御動物のベースライン不安とは無関係に、光刺激が時間の経過とともに不安行動を直接変化させることができるかどうかを調査するために、グループ内比較が選択された。両方の光刺激試験中に中心期間が有意に減少し、不安レベルの増加を示す。移動距離の合計は変更されず、運動の動作が影響を受けないことを示しました。中心エントリの数は大幅に増加しませんでした。図4Dでは、制御グループのデータが表示されます。対照動物は、分析されたパラメータのいずれでもオフとオン試験の間の行動変化を示さなかったので、光刺激または移植が観察された効果を引き起こさなかったことを示した。要するに、このテストは、ChR2を介してILピラミッド型ニューロンの光刺激中に不安が増加したことを示しています。
図5では、上昇プラス迷路の光遺伝学的実験が失敗したデータを示しています。図5Aに示されている上昇プラス迷路実験の間、マウスはそれぞれ3分間の6回の試験を完了した。試験1、3、5では光刺激が行われず(Off1、Off2、Off3)、試験2、4、6では、20Hz(5ms光パルス)および1mWの強度(On1、On2、On3)で青色光刺激が行われた。これらの例示的な結果では、光遺伝学的プロトコルの長さと迷路自体の構築は、トランスジェニックマウスラインには適していなかった。図5Bでは、いくつかのマウスが後ろ足で迷路から滑り落ちたり、倒れたりすることさえ見られます。これが起こったとき、マウスは1日後にEPMを実行する2度目の機会を得ました。彼らが再び倒れた場合、彼らは分析から除外されました。マウスが数回滑り落ちたが迷路にとどまったとき、データは正常に分析された。それにもかかわらず、データは非常に慎重に解釈され、制御動物がより重要になります。ネックス・クレマウスは、狭い両手にとどまるのに運動困難を抱えていた。これを避けるために、1cmの高さの小さな壁は、迷路の腕の後ろ足の安全なホールドのために助けたでしょう。ヒートマップとグラフの両方は、実験的な、およびコントロールマウスが、試験2(On1)から開いた腕を避け始めたことを示しています(図5C-E)。オープンアームのエントリと同様に、両グループのオープンアームの時間が大幅に短縮されます。実験群を分析すると、On1試験中にオープンアームとオープンアームエントリの時間が大幅に減少したため、光刺激の大きな有害作用を含むデータのみが得られた。しかし、このデータを同じ行動を示す対照群と比較すると、観察された行動は光遺伝学的刺激によって媒介されるのではなく、迷路への慣化による一般的にオープンアームの回避によって媒介されないことが明らかとなる。このデータは、光遺伝学的刺激によって媒介される行動効果と可能な行動適応を区別するための適切な対照群の重要性を強調している。また、このデータは、特定のムースラインと実験の質問に合わせて実験の設定を適切に適応させることの重要性に光を当てます。
収集された行動データを検証し、強化するために、マウスの脳は、正しい注射と移植のために制御する最後の実験の後に除去される(図6)。脳は4%パラホルムアルデヒドに固定され、頭蓋骨から取り除かれる。脳は30%のショ糖で1〜2日間脱水され、その後クライオススライスされます。厚さ40μmのコロナ脳スライスは、細胞核を染色するDAPIを含む取り付け媒体を用いて、スーパーフロスト目的スライドに洗浄して取り付けます。これにより、コロナスライス内のターゲット領域を識別できます。YFPタグまたはtdTomato自体の蛍光は、ウイルス注射の位置を示す。図6Bでは、左側のChR2-YFP(黄色)、右側のtdTomato(赤)の例示的な注射部位が提示されている。パキシノスとフランクリン45マウス脳アトラスから適応したテンプレートの助けを借りて、IL領域を同定することができます。両方のスライドでは、光遺伝学的ツールはIL領域だけでなく、隣接する脳領域でも発現する。適切な解釈のために、脳組織における青色光の拡散を8(図1D,E)に相談する。青色光が、繊維先端(図1Dのブルーライン)8で初期1mW光強度の5%未満でILより下のDP領域に到達することが分かる。さらに、光の少量は、後方散乱47のためにPrL領域に上方に行くことができます。その結果、IL領域が最も強く照らされると言えるが、DPおよびPrL領域のような隣接領域もわずかに刺激され得る。したがって、IL細胞特異的刺激は保証されておらず、隣接する領域の免疫体系化学分析を行うべきではなく、PrLおよびDP細胞の活性が光を介して変調されているかどうかを確認する必要がある。図6Cでは、もうひとつの重要なコントロールを示しています:Nex-Creマウスラインの特異性。IL領域における2種類の細胞種に対する抗体染色を介して、グルタミン酸原理ニューロンおよびGABAergicインターニューロンは、それが、ChR2-YFP発現が唯一のGABAergicニューロンではなくグルタミン酸ニューロンで起こることが分かる。
全体として、私たちの実験は、行動検査中の光遺伝学的操作では、不安関連行動の変化が観察できることを示しています。同じ動作に対して複数のテストを使用することで、信頼できる結論を導き出すことができます。さらに、免疫ヒストリカル分析は、得られたデータを確認する。我々の実験は、眼管内皮質における錐体ニューロンの特異的活性化が、特定のアッセイにおける不安関連行動を増加させ、示唆している。
<img alt="IL、DRN、BLA領域での脳注射の実験。行動データ、光遺伝学的効果分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig04v4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4: IL錐体ニューロンの光遺伝学的活性化は、不安行動を増加させる。実験中の光刺激:473nm、1 mW、20Hzの刺激。A)ILへのChR2-YFPまたはtdTomatoの注入および注入部位の概略図。実験中、mPFCのIL領域の錐体ニューロンはChR2によって活性化される。 パキシノスとフランクリンマウス脳アトラスから適応したたるみ脳スライス、たるみ:横o,6.B)光刺激プロトコル付きオープンフィールドB迷路(4x5分交互の試験で20分、左)と例示的なChR2注入(EXP)とTdTomato注入(CT)マウスのヒートマップ(右4回の試験)すべて(右)青いレーザー光で刺激されると、EXP動物はOFの中心に費やす時間が少なくなります。CT動物の場合、中心で過ごした時間はライトオフとオン試験の間で異なりません。C)OF 内の EXP 動物のグループ データ、n=11。マウスは、青色光で刺激されたときにOFの中心に大幅に少ない時間を費やす(Off1 39.49±6.9 s、On1 19.87±4.47 s、Off2 28.13±8.55 s、On2 23.42±9.32 s、オフ1:On1、tテスト、p = 0.03;*;オフ 1:On2, MWRS, p=0,049, *).移動距離は影響を受けません(Off1 2703.09±292.65 cm、On1 3113.4±491.15 cm、Off2 3331.86 ±482.62 cm、On2 3082.17±658,61 cm)。# センターエントリの数は時間とともに減少しますが、有意差は表示されません(オフ1 22.36±3.78、On1 18.45±3.95、Off2 17.36±1.99、On2 13.27±2.64)。D)OF 内の CT 動物のグループ データ、n=15。マウスがOFの中心で過ごす時間、移動した距離、中心エントリの#はライトオンとオフの間で変化しません(中央Off116.73±2.65 s、On1 16.02±1.89 s、Off2 12.02±1.76 s、On2 13.04±2.58 s;距離 Off1 3399.69±296.77 cm, On1 3210.6±446.9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm;# センターエントリ Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5)。CTマウスは有意に高いベースライン不安を示す(オフ1 EXP:CT、MWRS、p=0.005、**)。平均値は平均±S.E.M. * は有意差を示します (p≤0.05), ** 有意な差を示します (p≤0.01).t-テストは常に両側、MWRS:マンホイットニーランクサムテスト。IL: 赤外線皮質;BLA: バソラテラアミダラ;DRN: 後回しのラフェ核;OF: オープンフィールド;CT: コントロール動物;EXP: 実験動物;L:光。この図は、ベルクら 2019, PLoS One43およびベルク 201948から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="高架プラス迷路の実験、パフォーマンス指標、統計データ、および結果を示す図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig5v4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図5: EPM実験は、Nex-Creマウスの行動効果を示すことができなかった。実験中の光刺激:473nm、1 mW、20Hzの刺激。 A)光刺激プロトコルを備えた上昇プラス迷路(18分、6x3分、オフとオン試験を交互に)。 B)「滑り落ちる」マウスのグループデータは、データに含まれます(合計n=23)。Nex-Creマウスは、実験群とは無関係に、背中の足で開いた腕から滑り落ちる傾向があった(左)。後の分析では、6つの試験すべてのために迷路にとどまったマウスだけが考慮された。最初のオフ1フェーズでスリップオフは、後でオープンアームを回避する理由です(Off1 EXP 1.63±0.6、CT 2.2±0.79、オフ2+3 EXP 0.125±0.125、CT 0±0、On1+2+3 EXP 0.625±0.26、CT 0.10.10±)。円グラフ(右)は、18分の間に迷路から落ちるマウスを42.42%と示しています。実験を終えたのはわずか57.57%でした。 C)実験の全6回試験における例示的EXPおよびCTマウスのヒートマップ。両方のグループは、Off1トライアルの後にオープンアームの期間の減少を示しています。 D)EPM 内の EXP 動物のグループ データ、n=12。オープンアームで過ごした時間は、最初の2回の試験の間に大幅に減少し、その後絶えず(Off1 73.91±12.22 s、 On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, tテスト, p=0,041, *)。移動距離は影響を受けません(Off1 679.96±71.63 cm、On1 712.24±112.82 cm、Off2 717.49.49±97.39 cm、On2 782.51±81.11 cm、オフ3 722.11±68.60 cm、オン363.9±0cm)。オープンアームエントリの量はOff1からOn1に大幅に減少し、その後一定のままです(Off1 8.08±1.08、On1 3.33±0.76、Off2 2.16±0.69、On2 2.91±1.09、Off3 1.73±0.75、On3 1.73±0.66)。オフ 1:On1、t テスト、p=0.002、**)。EPMの中心で費やされる時間は試験に沿って減少しますが、オフからオントライアル(Off1 41.71±5.34 s、On1 31.2±4.59 s、Off2 19.8±3.44 s、On2 24.49±3.38 s、Off3 20.37±4.77s、On17.88)と大きな差はありません± E)EPM 内の CT 動物のグループ データ、n=11。CTデータはEXPデータと同じ有意な減少を示し、実験が正常に機能していないことを示しています(オープンアームの時間Off1 86.92±12.74s、 On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p=0.009, **;距離 Off1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm, Off2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±111.99 cm, Off3 716.99±132.47 cm, On3 663.03±13.46cm;オープンアームエントリーOff1 7.09±1,On1 3.72±1.17,Off2 1.45±0.47,On2 1.36±0.58,Off3 0.91±0.43,Off3 1.64±0.59。オフ 1:オン1、MWRS、p=0.01、*;時間は、センターOff1 35.89 s、On1 29.25±3.96 s、Off2 22.17±3.58 s、On2 15.9±2.57 s、Off3 13.86±4.2、On3 16.89±±5.75 s)で過ごします。平均値は平均± S.E.M. * 有意な差を示す (p≤0.05), ** 有意な差を示す (p≤0.01).t検定は常に両側、MWRS:マン・ホイットニーランクサム検定です。EPM: 上昇プラス迷路;CT: コントロール動物;EXP: 実験動物;OA:両手を開く。この図は、ベルクら 2019, PLoS One43 およびベルク 201948から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="脳切片図と顕微鏡画像。蛋白質発現とDAPI染色解析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61023/61023fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図6:ILおよびNex-Cre特異性におけるChR2およびtdTomatoの注入側。A)AP+1.66mm、mL 0.3mm、DV-1.8mmのコロナ脳スライス上の移植部位の模式図、一方的な注射および注入(マウス脳アトラス、パキシノスとフランクリン、ブレグマ+1.54mmから適応)。BB)Nex-Creマウスにおいて、ChR2-YFP(左、黄色)およびtdTomato(右、赤)の例示的な注射部位がDAPI染色細胞核(青)と結合した。スケールバー 1 mm。インセットはIL領域の高倍率を示す。スケールバー150 μm。白いボックスは、インセットの位置を示します。C)上行:グルタミン酸ニューロン(青)のマーカーとしてCamKIIで染色されたネックスクレマウスの左IL領域の共焦点像(青)、およびNex-CreマウスのGABAergicニューロン(緑色)のマーカーとしてChR2-YFP(黄色)またはGad67。下段:ChR2-YFP(黄色)とCamKII(左、青)の共局在化(左、青)は、Gad67(右、緑)では、グルタミン酸神経細胞に対するNex-Creマウスの特異性を示す。スケールバー50 μm。PrL: 前脳皮質;IL: 赤外線皮質;DP:後部足行皮質。この図は、ベルクら 2019, PLoS One43およびベルク 201948から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61023/61023fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。光遺伝学の究極の目標は、行動する動物の高い時間的および空間的分解能を持つ神経回路の変調である。薬理学的または電気的操作とは対照的に、光遺伝学は、神経回路上の特定の細胞タイプを正確に制御することを可能にする。光遺伝学は、行動中に特別に定義された領域の特定の細胞型を標的とし、そのような微小回路の変化の直接的な影響を精査するのに最適な方法です。次に、自由に動くマウスで光遺伝学を準備し、植え付け、行動するステップガイドのステップを提示します。光学インプラントの準備のために、ベンチバイスにセラミックフェルール平らな側面を置きます。直径200マイクロメートルのガラス繊維のコードを、繊維剥離ツールで取り除き、セラミックファイバー筆記者で2〜3センチメートルの非部分をカットします。ガラス繊維の一部をセラミックフェルールに入れ、注入角膜で平らな側にスーパーグルーを落とします。セラミックフェルールの丸い側に、ガラス繊維をできるだけ短くカットし、4つの異なる出版論文で丸い側面を磨くためにフェルール研磨パックにプレインプラントを置きます。その後、セラミックフェルールの平らな側のガラス繊維を、移植に必要な長さにカットします。インプラントの長さを計算するためにマウスの脳アトラスを使用してください。インプラントは、関心のある領域の真上で終了する必要があります。移植の前に麻酔が適用される。正確で審美的なテクニックは原稿に記載されています。マウスが麻酔の深い状態に達したら、加熱プレートの上に置き、頭を立体的なフレームに固定します。鼻と歯を前に、耳を両側に固定します。マウスの後ろに下地にクプロフェンを含む藻薬を塗布し、両方の目に不透明な眼軟膏を塗布して乾燥から保護します。濡れたペーパータオルで頭皮の髪を湿らせ、はさみで切り落とします。濡れたペーパータオルで、ゆる毛をすべて取り除くようにしてください。綿棒を使用して、ヨウ素を含むチンキで頭皮を消毒します。トゥイザーで関心のある領域についての頭皮を上げ、正中線に沿って1センチメートルをカットします。注入のために頭蓋骨を粗くするには、少量のリン酸を瘢痕に塗布し、15秒間有効にします。綿棒ですべての酸を取り除き、2回塩化ナトリウムで傷跡を洗いすります。適切な射出のために、個々の座標の F 係数を計算します。立体フレームにガラスのカヌラーを配置し、ブレグマの真上に配置します。座標系をゼロにして、グラスカニューレをラムダに移動します。次の式を使用して F 係数を計算します。ブレグマからラムダを4.2で割った値はF係数に等しい。正確な座標は、そうでなければ、間違った構造が刺激された場合、行動効果が非特異的であるため、注入および注入にとって非常に重要である。すべてのマウスは頭蓋骨の大きさに最小偏差を有するため、係数は絶対に必須である。調整された座標を使用して、対象の構造の真上にある傷跡の位置を見つけます。射出カニューレを使用して、頭蓋骨に穴を開け、その場でカニューレを回転させます。注射器に接続されたガラスカニューレにウイルス溶液を取り込むには、頭蓋骨に塩化ナトリウムを一滴、上にピロフェンを置きます。ピロフェンに2マイクロリットルウイルス溶液を一滴置き、ガラスカニューレの先端をウイルスに下げます。負圧を加え、ウイルス溶液がカニューレに取り込むまで待ちます。カニューレを持つウイルスの先端が頭蓋骨のレベルにあるときにその座標にゼロし、ゆっくりと注射側の最も低い位置にボアホールにそれを下げる。メニスカスが下がるまで注射器で少量の正圧を加えます。ガラスカニューレを次の位置に上に移動する前に、ウイルスが2〜3分間広がるようにしましょう。ガラスカニューレを非常にゆっくりと取り出し、最終的な注射後に廃棄します。今、注入のための頭蓋骨を準備します。圧縮空気で頭蓋骨を乾燥させ、この対応するスティックでプライマーを塗布し、15秒間乾燥させます。同じスティックで結合を適用し、UV光で20秒間硬化させます。インプラントを対応するホルダーに置き、ガラス繊維の先端を穴の真上に置き、慎重に下げます。スーパーグルーの残りのバルブが頭蓋骨に触れたときにインプラントを下げるのをやめてください。光ファイバーの移植は、海馬のような両側構造のために作ることもできます。これは両方の半球のわずかな刺激を同時に可能にするか、または2つの異なる構造の刺激を可能にする。また、光ファイバーインプラントとは異なる場所でウイルスを注入することもできる。注射と注入が異なる領域で行われている場合は、リン酸を塗布した後、2つの成分の接着の前にすべての必要な穴を開けます。頭蓋骨がまだ完全に乾燥しているかどうかをもう一度確認し、インプラントの周りと周囲の領域に流体歯科セメントを適用し、UVライトで20秒間治癒し、完全に毛皮のない乾燥した頭蓋骨領域にさらに2つのより少ないセメントを適用します。UV光ですべての層を治す。手術を終えるために、全創傷にヨウ素のあてがいを塗る。鼻と耳の固定を解除し、新鮮なケージにマウスを持ち込み、加熱ランプの下に置いて体の熱を失わないようにします。少なくとも1日1回は健康状態を確認し、必要に応じて3日後に手術と鎮痛を投稿します。2週間の回復の後、マウスは行動実験に使用することができる。パルサーソフトウェアを開き、光源が接続されているUSBコムポートを選択します。外部ソフトウェアが光源を制御できるようにするには、操作モード 3 を選択します。5ミリ秒光パルスで20ヘルツ刺激に対して正しい調整を選択します。パルサーと通信する分割を見つけるには、開始シーケンスを押します。このステータスは、実験が終了するまで残ります。次に、EthoVision XT で新しい実験を作成し、ファイルに移動し、テンプレートから新しいテンプレートを選択して、定義済みのテンプレートを適用するを選択します。ライブトラッキングを選択し、ソースとカメラを選択し、接続された膿疱のGen-Eyeカムを確認します。記録されるべき動物としてマウスを選択してください。アリーナテンプレート、オープンフィールドスクエア、ゾーンテンプレートセンター、ボーダー、コーナーを選択します。追跡する必要がある1つの被写体を確認し、中心点、鼻のポイントと尾のベースを選択します。背景と比較して動物の色が暗く、ステップを完了するために推奨サンプルレートを確認します。適切な名前を実験に指定し、保存する場所を選択します。アリーナの設定が見つかるまで、カメラは自動的に背景画像を開きます。矢印と右の 2 つのシンボルを使用して、定義済みのゾーンを実際のアリーナに適応させます。一部のゾーンが不要な場合は、削除します。ドロースケールを押してキャリブレーションを行い、迷路の一角からもう一方の角に線を入れます。実距離の長さをセンチメートル単位で入力します。もう一方の軸についても繰り返します。トライアルコントロール設定を定義するには、条件時間を20分に調整してメインルールを準備します。スタートレックの条件は、被験者がアリーナで2秒間有効な場合、マウスがアリーナにいるときの追跡の自動ステータスです。光刺激のサブルールを作成するには、構造に移動し、さらにサブルールを選択します。メインルールの下に置き、2つのボックスを広げます。条件に行く、時間と1に光のような名前を与え、調整条件は5分後に満たされます。サブルールのルール開始ボックスのすぐ後ろにボックスを配置します。アクションカスタムハードウェアに移動し、ライトを持つ名前を付けます。実行するアクションを選択します:私は1つの高を置きます。ボックスを条件ボックスの真後ろに置きます。ライトオフをプログラムする手順を繰り返します。構造、サブルール参照に移動し、参照が正しいサブルールに属していることを確認します。開始条件は、開始条件ごとに 1 回実行する場合に、遅延なしの開始条件と開始条件を選択します。追加の本1と条件書の2つのメインルールの間に参照ボックスを配置します。次に、システムが追跡する必要があるものを表示する検出設定を定義します。アリーナにテストマイルを配置し、自動セットアップを選択します。動物の種類としてげっ歯類を選択し、アリーナでマウスの周りにボックスを描くためにマウスカーソルを使用しています。ケアの質問の結果を確認します。オープンフィールド実験では、実験の直前に実験用マウスを行動室に持ち込み、適切なレベルの不安を確保します。ケージのグリッドにそっと押して、マウスを光源のスリットに結合します。10分間新鮮なごみで待っているケージに入れて、ライトケーブルに順応させます。停止ボタンを押して取得を開始し、XTをビジョンにします。待っているケージから開いているフィールドの左上隅にマウスを移動します。実験中にマウスの視野を離れ、落ち着いてください。実験が終了したら20分後、迷路からマウスを取り出し、ライトケーブルを外してケージに戻します。チェック ビジュアライゼーションにより、面上のライト オフとライトの中心時間の違いが直接見られます。マウスは、ライトが点灯しているとき、中央での時間を短くします。バーンズ迷路実験では、実験の約1時間前にすべての実験用マウスを行動室に持ち込みます。1つを除くすべての穴を閉じてバーンズの迷路を準備し、今エスケープボックスが配置されています。両方のインプラントで光源に1つのマウスを接続し、バーンズ迷路の真ん中に直接置きます。スタートを押すと、次のTに訪問し、カートンボックスを削除する必要があります。ソフトウェアが移行全体を認識しない場合に備えて、手動で試用を停止する準備をしてください。迷路からマウスを取り出し、ライトケーブルへの接続を取り外します。実行、学習、および記憶タスクを行う場合、操作の即時効果が調査されるだけでなく、取得、統合または検索中の操作の長期的な影響も調査される。データ分析では、治療条件を見つけて、入れ子に移動し、試験管理状態を選択します。要素アクションスタートレックから要素アクションライトが1に点灯する状態間隔を選択します。フィルタ ボックス処理と対応する結果ボックスの間にネスト ボックスを配置します。この定義された間隔は 1 です。2 つのうち 1 つの間隔と、制御グループの 2 つについても繰り返します。また、分析プロファイルで分析するパラメータも定義します。ゾーン内の従属変数を選択し、ゾーンの中心、ボディポイント、中心点を選択し、試用統計に進みます。頻度、累積期間を選択し、最初の時間を見てみましょう。また、距離移動を変数として追加します。このプロファイルでは、センターで費やされた時間、中央のエントリ、および距離移動に関する情報のデータが利用可能です。各区分からデータを抽出するには、結果に移動して統計とグラフを選択し、計算を押して分析データを表示します。データのエクスポートを押して、試用統計と保存場所を選択します。エクスポートされたデータは、Excel ファイルとして保存され、各マウスの個別の値と共に保存されます。さらに、ヒート マップの視覚化に移動し、プロットヒート マップを押し、右側の試験を選択して、各マウスとトライアルの個々のヒート マップを表示します。マウスを右クリックして、ヒートマップをイメージとしてエクスポートします。その後、Excelファイルコンピュータを開き、4つの試験とすべての測定されたコンディショニンググループの平均と標準ユーロSCMを計算します。グラフとシグマプロットを生成するには、平均とSCMを追加ファイルからシグマプロットに正しい順序でコピーします。行にはオフ 1 のデータが含まれ、列には試用版、平均値、SCM ヘルツが含まれます。3 つの列をすべて選択し、グラフの作成に進みます。バー ボックスを選択し、矢印付きのグループ化されていないボックスを選択します。グラフ全体にラベルを付け、自宅に移動し、グラフボックスを選択してエクスポートを押します。保存先のフォルダを選択し、メタファイルをフォーマットとして選択します。取得したデータの統計を計算するには、Xcelから1対1、エトセトラ、およびシグマプロットの単一列に正しいデータをコピーします。比較する列にマークを付けて分析に進み、[T test] を選択して[実行]を押します。最後に、行動データを、追加のヒートマップ専門化でlet offと試用に分割して表示することができます。オープンフィールド実験では、Channelrhodopsin2および錐体ニューロンの光刺激中に、中心持続時間が減少し、不安レベルの増加を示す。免疫染色法によって、ウイルスの注射部位および発現を決定することができ、また特殊なCre依存マウスラインでの特異性を検証することができる。1 つは、Channelrhodopsin2 の光刺激は、この特定の皮質領域の心神経細胞を改善することを明確に見ることができます不安レベルを増加させます, その刺激前のベースライン不安と比較して.行動に対するこの操作の直接的な効果は、光遺伝学が行動に関する多くの研究問題に今日使用されている理由です。この手順は、マウス脳内の任意の所望の細胞型または神経回路の光遺伝学的変調に使用することができる。この手順を研究に適した行動検査と組み合わせることで、目的の行動や病気に関与する神経回路に関するより深い洞察を得ることができます。

optogenetic-manipulation-neuronal-activity-to-modulate-behavior

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

出典: Kodani, S., et.al.マウスの睡眠/覚醒状態のモニタリング中の神経回路の光遺伝学的操作J. Vis. 経験。(2019年)このビデオは、マウスの睡眠から覚醒への移行に関与する神経回路の光遺伝学的操作を示しています。この手順では、光ファイバーと電極を脳と筋肉に外科的に埋め込み、光刺激と電気生理学的記録を可能にします。光を照射して終末線条 (BNST)...

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