PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法
2010年7月2日
RNA転写物は、トランス作用RNA結合タンパク質（RBPs）の多数によって媒介される大規模な転写後調節の対象となります。ここでは正確にとトランスクリプトーム全体の規模でRBPsのRNA結合部位を同定するために一般化の方法を提示する。
この手順の全体的な目標は、RNA結合タンパク質またはRVPのトランスクリプトームワイド結合部位を決定することです。これは、まず光反応性ヌクレオシド類似体を使用して、新生転写産物のin vivo標識を行うことで達成されます。手順の2番目のステップは、365ナノメートルのUV光によってRNAおよびRNA結合タンパク質を架橋することです。
手順の3番目のステップは、調査したRNA結合タンパク質を免疫沈殿させ、RNAへの架橋を回復させることです。手順の最後のステップは、RNAをCD NAライブラリーとディープシーケンスに変換することです。最終的には、RVPのトランスクリプトームワイド結合部位を示す結果が得られ、RNA認識要素とその結合選好の定義が可能になります。
こんにちは、私の名前はニューヨークのロックフェラー大学のトムSELの研究室のマーカス・ホフナーです。今日は、par lipまたはphotoable rib nucleoside analog enhanced cross-linking and immunoprecipitationと呼ばれる方法を紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、RNA結合タンパク質のスケール結合部位とその結合モチーフと好みによってトランスクリプトームを同定します。
では、始めましょう。In vivo UV 架橋は、層流フードで開始されます。このプロトコルでは、無菌技術を使用して、タグ付きIGF 2つのBP 1細胞を例示的なモデルとして使用します。
HEK 2 93細胞培養培地でテットリプレッサーの制御下で、HEK 2 93細胞培養培地で100〜400倍10〜6番目の細胞を使用して、10〜6番目の細胞で、10〜400倍で安定して発現するHEK 2 93細胞を安定して発現するフラグHAタグ付きIGF 2 BP1を増殖させ、それらを約80%coの流暢さまで増殖させます。架橋の14時間前に、細胞はチオウリジンまたはSUの光反応性リボシド類似体を細胞培養培地に直接持っていました。或いは、6番目のギネまたは6つのSGを、光反応性リボシドの添加後に使用し、フラグHAタグ付きIGFの発現を誘導し、次いで、ドキシサイクリン細胞の添加により、細胞インキュベーターで一晩インキュベートすることができる。
次に、成長培地をデカントします。次に、プレートごとに10ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水で細胞を1回洗浄します。次に、デカンテーションによってPBSを完全に除去します。
覆われていないプレートを氷の入ったトレイに置き、ストラドルリンカー2、400UVクロスリンカーまたは同等のUV照射後に365ナノメートルのUV光を照射し、1プレートあたり1ミリリットルのPBSでゴム製の警察官で細胞をこすり落とします。細胞を50ミリリットルの遠心チューブに移し、500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。スーパーネームを破棄し、セルペレットを保持します。
この時点で、細胞ペレットを液体窒素で急速凍結し、マイナス80度で少なくとも12か月間保存できます。この手順を続行するには、1つのX NP 40溶解バッファーの3つの容量にペレットを懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。細胞溶解物を13, 000 Gで15分間摂氏4度で遠心分離することにより、細胞溶解物を除去します。
遠心分離後、ライセートを5ミクロンのメンブレンシリンジフィルターでろ過することにより、ライセートをさらに透明にします。最後に、RNA T 1を最終濃度1マイクロリットルあたり1単位まで添加し、摂氏22度の水浴中で15分間インキュベートします。その後、氷上で反応を5分間冷却します。
in vivo UV架橋に追従。免疫沈降用の磁気ビーズを調製します。細胞溶解物1ミルあたり10マイクロリットルのダイナビーズタンパク質G磁性粒子を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
次に、ビーズの入ったチューブを磁気スタンドに1〜2分間置きます。上清を取り除き、磁気セパレーター上にある間に1ミリリットルのクエン酸リン酸緩衝液をチューブに追加します。次に、チューブにキャップをし、サンプルをボルテックスしてビーズを再懸濁します。
チューブキャップに残っているビーズを回収するために、短時間遠心分離します。この洗浄を、さらに1ミリリットルのクエン酸リン酸緩衝液で繰り返します。洗浄後、ビーズとクエン酸リン酸緩衝液をビート懸濁液の元の容量の2倍の容量で懸濁します。
次に、ビート懸濁液1ミリリットルあたり0.25ミリグラムのAnti-Flag M 2モノクローナル抗体を添加します。インキュベーション後、室温で40分間回転ホイール上で懸濁液をインキュベートし、前述のように1ミリリットルのクエン酸リン酸緩衝液でビーズを2回洗浄し、この洗浄は、洗浄Resusに続いて未結合の抗体を除去する役割を果たし、ビーズとクエン酸塩緩衝液を4つ前に懸濁します。免疫沈降を開始するには、新たに調製した抗体標識磁気ビーズをRNAの1つの処理細胞ライセートに加えます。
混合物を15ミリリットルの遠心分離チューブに移し、摂氏4度で1時間回転させます。インキュベーション後、磁気ビーズを回収し、上清を再懸濁ビーズを1ミリリットルのIP洗浄バッファーに捨て、1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。前述のようにビーズを1ミリリットルのIP洗浄バッファーで2回洗浄します。
最終洗浄後、ビーズをIP洗浄バッファーの元のビーズボリュームに懸濁します。次に、RNAT 1を最終濃度の1マイクロリットルあたり100単位まで追加します。ビーズ懸濁液を摂氏22度の水浴中で15分間インキュベートします。
その後、懸濁液を氷上で5分間冷却します。次に、ビーズを1ミリリットルの高塩洗浄バッファーで3回洗浄します。次に、ビーズを元のビーズ容量の脱リン酸化バッファーに再懸濁します。
子牛の腸内アルカリホスファターゼを最終濃度0.5単位/マイクロリットルまで添加し、懸濁液を摂氏37度で10分間インキュベートします。ビーズを1ミリリットルのホスファターゼ洗浄バッファーで2回洗浄し、次にDTTを含まないポリヌクレオチドキナーゼまたはPNKバッファーでさらに2回洗浄します。最後に、ビーズを元のビーズボリュームのPNKバッファーに再懸濁します。
架橋RNAのラジオラベリングを開始する。調製したばかりのビーズ懸濁液の元のビーズ容量1つに、γ 32 PATP と T 4 PNK を添加します。懸濁液を摂氏37度で30分間インキュベートします。
次に、非放射性のTPを懸濁液に加え、摂氏37度でさらに5分間インキュベートします。次に、DTTなしで800マイクロリットルのPNKバッファーで磁気ビーズを5回洗浄します。最後に、ビーズを70マイクロリットルのSDSページに再度懸濁します。
ローディングバッファーは、無線標識懸濁液を摂氏95度のヒートブロックで5分間インキュベートし、免疫沈殿したRNA結合タンパク質を架橋RNAと変性させて放出します。次に、セパレーター上の磁気ビーズを取り外し、スーパーナチンをきれいな1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します novox bis triss 4〜12%プレキャストポリアクリルアミドゲルのウェルあたり40マイクロリットルのスアーデをロードし、200ボルトで55分間ゲルを実行します。ゲルが泳動したら、ゲルチャンバーを分解してプレートを分解し、ゲルを1つのプレートに取り付けたままにして、ゲルとリン酸化イメージャーの紙のプリントアウトへの位置合わせを容易にします。
3つの小さな放射性ゲル片をゲルの角に非対称に埋め込みます。汚染を避けるために、ゲルをサランラップなどのプラスチックフィルムで包みます。ゲルを空白のリン酸化イメージャー画面に1時間さらし、それをリン酸化イメージャーにさ
らします。次に、埋め込まれたゲル片を使用して、リンショウイメージャーのプリントアウトの上にゲルを位置合わせします。RNA結合タンパク質またはRBPの予想されるサイズに対応するバンドを切り取ります。バンドをdtuダイアライザーMIDIチューブに移し、1つのXSDSランニングバッファーエレクトロエリュートを800マイクロリットル追加します。
架橋されたR-N-A-R-B-Pコンプレックスは、製造元の指示に従って100ボルトで2時間です。電気溶出に続いて。プロテイナーゼKバッファーとプロテイナーゼKを添加し、溶液を55°Cで30分間インキュベートします。
酸性フェノールクロロホルムイソアミルアルコール抽出、続いてクロロホルム抽出によりRNAを回収します。次に、1マイクロリットルのグリコーゲンを加え、3容量のエタノールを加えてRNAを沈殿させます。最後に、得られたペレットを10.5マイクロリットルの水に溶解します。
RNAが回収されたら、標準的なCDNAライブラリ調製プロトコルに通し、配列リードの慎重なバイオインフォマティクス分析を行います。フラグH haを発現するHK 2 93細胞で行われたparクリップの代表的な結果は、IGF 2 BP 1をタグ付けし、光反応性ヌクレオシド類似体4 SUおよび6 SGの代替光反応性リボシド6 SGの架橋効率は、一般に4 suよりも低い。架橋効率が低いと、豊富な細胞RNAの断片に由来する配列のバックグラウンドが高くなる可能性があるため、最初に実験に使用する細胞の数を増やす必要があります。
異なるパークリップ光反応性ウリジン類似体は、ここで見られるように、従来のUV 2 54ナノメートル架橋またはクリップと比較されます。UV 2 54ナノメートルRNAタンパク質架橋は、架橋効率が限られています。適切なサイズの放射性バンドの強度は、パークリップ実験が機能したかどうか、およびsmall RNAシーケンシングプロトコルを経るのに十分なRNAが分離されたかどうかを示します。
バイオインフォマティクス解析後のシーケンシングリードにおける特徴的な変異の頻度は、クロスリンク配列が成功したことを示しています。これらの突然変異は、4つのSUを使用する場合はT、2つのC遷移、成功した場合はG、2つのA遷移です。G.パークリップの決定的な特徴は、回収されたRNAから調製されたCD NAライブラリに存在する特徴的な突然変異をスコアリングすることにより、架橋の位置を導き出す可能性です。
これにより、特異的に結合したRNAに由来するシグナルを、豊富な細胞RNAの共単離フラグメントに由来する配列のノイズから容易に分離することができます。そこで本日は、RNA結合タンパク質によって特異的に認識されるRNAセグメントを単離する方法をお見せしました。この手順を実行する場合。
RNAをフリーに加工することが重要です。そうだったんですね。ご覧いただきありがとうございます、そして実験の頑張りを祈ります。
概要
本記事では、トランスクリプトームワイドなスケールでRNA結合タンパク質（RBP）のRNA結合部位を同定する方法を紹介します。この手順では、光反応性ヌクレオシド類縁体とUV架橋を利用して、RBPとRNAの相互作用の研究を促進します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 分子生物学
背景
- RNA転写産物は、広範な転写後調節を受けます。
- RNA結合タンパク質（RBP）は、この調節において重要な役割を果たします。
- RBPの結合部位を特定することは、RNA生物学を理解する上で不可欠です。
- 既存の手法では、精度が不十分であるか、トランスクリプトーム全体への適用可能性に欠ける場合があります。
研究の目的
- RBP結合部位を同定するための汎用的な手法を開発すること。
- RNA認識要素および結合好性の理解を深めること。
- さまざまなRNA結合タンパク質に適用可能なプロトコルを提供すること。
使用した手法
- 光反応性ヌクレオシドアナログを用いた新生転写物のin vivoラベル化。
- UV光によるRNAとRBPの架橋。
- 架橋されたRNAを回収するためのRBPの免疫沈降。
- 結合部位を同定するためのRNAのディープシーケンシング。
主な結果
- トランスクリプトーム全域におけるRBP結合部位の同定に成功すること。
- RNA認識エレメントおよびその結合好みの定義。
- 本手法がさまざまな細胞型に適用可能であることを実証すること。
結論
- 開発された手法は、RBP相互作用を研究するための堅牢なアプローチを提供します。
- これにより、転写後調節メカニズムへの理解が深まります。
- この技術は、RNA生物学を探索するためのさまざまな研究コンテキストで利用可能です。
よくある質問
業界における重要性
トランスクリプトーム全体のRNA-タンパク質相互作用を特定することで、初期創薬段階におけるRNA結合タンパク質ターゲットのメカニズム的なリスク低減が可能になります。PAR-CliPは、変異に基づくシグナル識別を提供し、RBPバリデーションワークフローにおけるターゲットの信頼性を向上させ、偽陽性を減少させます。これにより、疾患関連システムにおけるRNA認識エレメントと結合優先性を明らかにすることで、リード化合物同定における予測信頼性をサポートします。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期段階の探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：転写後調節に関与するRBPの直接的なRNA結合部位をマッピングすることにより、治療的仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値：光反応性ヌクレオシドアナログ（4-SU、6-SG）と365 nmのUV架橋を用い、生細胞内における一過的および安定的な相互作用を捕捉する。
- 科学的価値：cDNA配列におけるT→CまたはG→A変異を通じて、RNA認識エレメントと結合好みを定義し、真のシグナルを背景ノイズから分離する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： ディープシーケンシング用の定量的かつ変異タグ付きcDNAライブラリを構築し、RBP結合RNA断片の再現性のある検出を可能にする。
- 運用的価値： バイオインフォマティクス解析のための標準化されたスケーラブルな入力を生成し、ターゲットエンゲージメントスクリーニングのためのアッセイ準備をサポートする。
- 科学的価値： 結合嗜好性とモチーフの濃縮を特性評価し、RNA標的の低分子化合物またはオリゴヌクレオチドの設計に有用な情報を提供する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：RBP結合部位を疾患に関連する系における機能的転帰に結びつけ、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合性をサポートします。
- 運用上の価値：さまざまな細胞種（例：HEK293）で利用可能であり、タグ付きRBPを発現する初代細胞や疾患モデル細胞に適応させることができます。
- 科学的価値：RNAの安定性、スプライシング、または翻訳におけるRBPのメカニズム的な役割を明確にすることで、リスク調整後の進展決定を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
PAR-CliPは、ターゲットのバリデーションからリード化合物の同定、さらに前臨床段階のメカニズム解析に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、下流の調節戦略に情報を供する結合部位の解像度を提供します。
- 探索生物学：疾患に関連する転写物を制御するRBPの直接的なRNA標的を同定することで、仮説検定およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：定量的でシーケンシング可能な出力を提供し、異なる条件、変異体、または治療的摂動間での結合比較を可能にします。
- アナリティクス：シグネチャー変異（T→C、G→A）のバイオインフォマティクススコアリングに基づき、バックグラウンドから架橋されたRNAを区別し、精密なピークコーリングを実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：前臨床モデルにおいてRBP部位をRNAの運命に関連付けることで、分子結合データと機能的な連続性を結びつけます。
- エンタープライズでの再利用：多様なRBP（例：IGF2BP1）のプロファイリングのための再利用可能なプラットフォームを構築し、プロジェクト間での冗長なメソッド開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲット検証における予測精度の向上、およびRNAレギュロンマッピングにおけるメカニズム的な曖昧さの軽減。
- 運用的価値： 定義された架橋条件、変異ベースのフィルタリング、および再現性のあるライブラリ調製による標準化。
- 戦略的価値： RBP-RNA相互作用の強度と特異性を明確にすることで、意思決定（go/no-go判断）の質を向上させ、後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みの結合部位およびモチーフ嗜好性に基づいた、RNA標的治療薬のリスク調整済み優先順位付け。
実施上の検討事項
- 分子クローニング、細胞培養、およびUVクロスリンクプロトコルの専門知識が必要です。
- 365 nm UVクロスリンカー、免疫沈降試薬、およびディープシーケンシング設備へのアクセスが必要です。
- アナログの投与量、クロスリンク時間、および洗浄の厳格さについて、チーム間での標準化が求められます。
- タグ付き過剰発現モデルから内因性または初代細胞システムに移行する場合は、適応が必要です。
- 実用的な制限：6-SGは4-SUよりもクロスリンク効率が低いため、豊富に存在する細胞内RNA由来のバックグラウンドを克服するために、より多くの細胞投入量が必要となります。
