一次組織の二つのチミジン類似体の免疫蛍光検出（CldUとIDU）

こんにちは。Calor D-U-I-D-U染色プロトコルへようこそ。本日のビデオでは、ステップ3の再水和、透過処理、および抗原賦活化から開始します。まず、スライドをキャリアにセットしてください。

スライドをセットしたら、キシレン浴に5分間浸します。続いて、2回目のキシレン浴に再度5分間浸します。

100%エタノール溶液から始めて50%溶液で終えるように、スライドを順次移動させて再水和を続けます。次に、細胞膜を透過させるため、スライドを1×PBSに5分間浸し、再水和を完了させます。スライドを0.2% Triton X溶液に5分間浸します。マイクロ波を用いた組織抗原賦活化の準備として、スライドをガラスビーカーに入れ、溶液がスライドの上端から5 cm上まで浸かる十分な量の0.01 M クエン酸ナトリウム緩衝液を加えます。

蒸発による損失を考慮し、溶液が沸騰するまでスライドを電子レンジで加熱します。フルパワーで約3〜10分かかります。スライドが沸騰していることを確認してください。

電子レンジの出力を10～80%に下げ、さらに20分間、スライドをゆっくりと沸騰させ続けます。沸騰後、スライドの入ったビーカーをベンチトップに置き、室温になるまで約2時間かけてゆっくりと冷却させます。スライドが室温に達していることを確認してください。

スライドを1.5 Nの塩酸に浸し、室温で40分間処理します。塩酸からスライドを取り出し、1 x PBSで5分間洗浄します。続いて、2回目の1 x PBS洗浄を行います。

液体ブロッキングワックスペンを使用して、1×PBSアクセス溶液からスライドを取り出します。各組織切片を円で囲み、スライドを再びPBSに戻します。気密容器の底に濡れたペーパータオルを敷いて、加湿インキュベーションチャンバーを作成します。

1x PBSで希釈した10%ブロッキング血清のブロッキング溶液を調製します。典型的には1×1.5 cm程度の組織切片において、各切片全体を溶液で完全に覆うことが重要です。ブロッキング溶液は50 µLの量で十分です。

マウス抗BRDU抗血清を5% donkey serumで希釈し、一次IDU抗体を調製します。希釈倍率は1:250とします。この一次溶液を各スライド切片にピペッティングして添加します。

スライドを4°Cの冷蔵庫に入れます。一晩インキュベーションする場合は、高ストリンジェンシー洗浄液を準備してください。TBSTが適しています。

スライドを互い背中合わせに配置します。スライドを約35〜40 millilitersのTBST溶液に入れます。チューブを37 degrees Celsiusに設定した振盪式細菌培養インキュベーターに入れます。

225 RPMで20分間振とうさせます。次に、スライドをキャリアにセットします。スライドをXPBSに入れ、PBSで5分間洗浄します。

続いて、XPBSで2回目の洗浄を5分間行います。ラット抗BRDU抗体を5% donkey serumで希釈し、一次CLDU抗体溶液を調製します。濃度1:250で添加し、スライドをペーパータオルの上に置き、ワックスペンで再描画します。

ピペットを用いて、各組織切片に一次CLDU溶液を滴下し、全体を覆います。すべての組織切片が完全に覆われるよう、溶液を約50 microliters使用してください。スライドを4 °Cの冷蔵庫に入れ、一晩インキュベートします。

スライドをキャリアに入れ、1×PBSで5分間洗浄します。次に、別の1×PBSに移し、さらに5分間洗浄します。CY2 donkey anti-RADおよびPS5 donkey anti-mouse抗体を5%ドンキー血清で希釈し、二次抗体を用意します。核染色はDAPIを用いて行います。組織切片全体を二次抗体で完全に覆ってください。

組織を完全に覆うには、50 µL の溶液で十分なはずです。再水和チャンバーを室温の暗所に置き、1 時間インキュベートします。スライドをキャリアに入れ、XPBS で 5 分間 1 回洗浄します。

スライドを2回目の1×PBS洗浄液に5分間浸します。ペーパータオルで余分なPBS溶液を吸い取ります。次に、Prolong Gold 抗退色封入剤を取り、各組織切片の上に少量ずつ滴下します。

カバーガラスを取り、スライド切片の上にそっと置きます。ペーパータオルをプレスとして使用し、スライド切片とカバーガラスの間に閉じ込められた余分な気泡を押し出します。最後に、ピペットチップを使用して、残っている余分な気泡を押し出します。結果を定量化するため、高エネルギー光源と複数の蛍光チャンネルを備えた蛍光顕微鏡を用いて、目的の組織の画像を撮影してください。

まず、Dabi陽性細胞の数をカウントします。次に、SI 2チャンネル画像を用いてCLDU陽性細胞の数をカウントします。最後に、SCI 5チャンネル画像を用いてIDU陽性細胞の数をカウントします。

最後に、SCI twoチャンネルとSCI fiveチャンネルの画像ファイルを交互に切り替えて、ダブルポジティブに標識された細胞をカウントします。