コラーゲンゲル含有する細胞のモジュールを使用してマイクロ組織の作製

本手順の全体的な目的は、組織工学実験に使用可能なモジュール式マイクロ組織を作製することです。まず、シリンジを用いてポリエチレンチューブ内にコラーゲン溶液を吸引し、次いでコラーゲンをゲル化させることでこれを達成します。第2ステップとして、ポリエチレンチューブを2 mmの長さに切断し、マイクロ組織モジュールを形成します。

手順の第3ステップでは、モジュールをチューブから分離し、最後にモジュールに血管内皮細胞をコーティングします。最終的に、得られたマイクロ組織は、マイクロ流体チャンバーを介して細胞間の相互作用を研究するためのin vitro細胞アッセイに使用できます。さらに、これらのマイクロ組織を移植することで、in vivoにおけるマイクロ組織の相互作用およびリモデリングを研究するための組織を構築することが可能です。

こんにちは。トロント大学Sepan研究室のBrendan Longです。巨大な3D組織代替物を構築する上での大きな障害の一つは、移植後の迅速な血管新生が不足していることです。このビデオでは、この制限を克服するために、内皮細胞で被覆されたモジュール式組織を作製する方法をご紹介します。

手順のデモンストレーションを行うのは、Septinラボのポストドク研究員のChamberlainです。中和させるコラーゲンの量は、ポリエチレンチューブの長さに依存します。このデモンストレーションでは、内径0.76 millimeter、外径1.22 millimeterの2 meterのポリエチレンチューブを使用します。

チューブを準備するために、20 Gの針をチューブの一端に挿入し、その後チューブをガス滅菌用のコンバーター自己修復ポーチに入れます。コラーゲン1 mLでポリエチレンチューブ約2 mを満たすため、ここではコラーゲン1 mLを中和します。コラーゲンを15 mLコニカルチューブに入れ、チューブを氷上で保持します。

コラーゲン1 mLあたり128 µLの10倍濃縮alpha-MEMをチューブに加え、ピペッティングを繰り返して混合します。気泡が発生しないように注意しながら混合すると、酸性化したコラーゲンにalpha-MEMが混ざり、溶液が黄色になります。次に、0.8 Mの炭酸水素ナトリウムを加えてコラーゲンを中和します。pHのおおよその目安として、黄色のコラーゲン溶液が淡いピンク色になるまで炭酸水素ナトリウムを加えます。

通常、コラーゲン1 mLあたり30〜60 µLを用いることでpH 7.4に調整できます。中和したコラーゲンのゲル化を防ぐため、使用直前まで氷上で保持してください。コラーゲンのゲル化手順を開始するには、滅菌済みのポリエチレンチューブが入ったバッグを生物安全キャビネットに運び、チューブをバッグに入れたまま、バッグの密封端を切り離します。

滅菌済みのピンセットを使用して、チューブの一端に previously 挿入しておいた 20 gauge 針に 3 mL シリンジを取り付けます。チューブのもう一端を、氷上に保持したコニカルチューブの底に先端が届くまで、中和したコラーゲンの中に挿入します。次の工程はゆっくりと行う必要があります。そうしないと、コラーゲンの中に気泡が混入してしまいます。

シリンジのプランジャーをゆっくりと引き、コラーゲンをポリエチレンチューブ内に吸い上げます。コラーゲンがチューブを通過したら、20ゲージの針を抜き、チューブの両端をバッグに戻します。バッグをテープで密閉した後、37 °Cで60分間インキュベートします。

あらかじめ組み立てられた切断装置を使用して、チューブを切断します。この手順を開始するには、切断装置の前にある滅菌トレイにチューブを置き、切断装置の出口からチューブを装填します。次に、25 mLの血管内皮細胞培地を入れた50 mLコニカルチューブを準備します。切断したモジュールを回収するため、切断装置をチューブの長さが2 mmになるように設定し、チューブを切断します。

切断したモジュールを50 mLコニカルチューブに入れ、37 °Cで60分間インキュベートします。チューブからコラーゲンモジュールを回収するため、モジュールが入った50 mLコニカルチューブを中速で10秒間ボルテックスします。その後、モジュールがチューブの底に沈殿するまで約5分間静置します。

チューブの底にモジュールの緩いペレットが形成され、チューブ上の培地表面に層を形成します。モジュールが沈降した後、口径の広い10 milliliter セロロジカルピペットを用いて、それらを15 milliliter コニカルチューブに移します。15 milliliter コニカルチューブをボルテックスし、さらに2回、モジュールを沈降させます。

2番目および3番目の渦から沈降したモジュールも、15 milliliterチューブに移します。すべてのモジュールをチューブから取り出して回収した後、チューブ内の培地量を5 millilitersに調整します。これで、モジュールに血管内皮細胞をコーティングする準備が整いました。次に、モジュールへのコーティングに使用する血管内皮細胞の調製方法について説明します。

まず、細胞から培地を除去し、PBSで洗浄します。PBSを除去した後、trypsin EDTAを3 mL加え、37 °Cで5分間インキュベートします。次に、細胞を7 mLの培地で再懸濁し、15 mLチューブに移します。

ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、コニカルチューブ底部のパックされたモジュール1mLあたり5×10⁶個の内皮細胞を準備します。300 ×gで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。細胞ペレットを5mLの内皮細胞培地で再懸濁します。

次に、血管内皮細胞を含む培地を5 mL、モジュールに加えます。モジュールを血管内皮細胞と共に静置および動的にインキュベートします。静置インキュベーションの場合は、血管内皮細胞を含むモジュールを転倒混和させた後、チューブを直立させ、37°Cで15分間静置します。15分後、再度チューブを転倒させ、37°Cでさらに15分間インキュベートします。

血管内皮細胞と共にモジュールを動的にインキュベートするため、15 mLチューブを37 °Cで60分間、緩やかに揺らします。血管内皮細胞とのインキュベーションが完了したら、モジュールを非組織培養処理プレートに移し、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、未接着の血管内皮細胞を除去するため、モジュールを新鮮な培地が入った新しい非組織培養処理プレートに配置します。血管内皮細胞でコーティングされたモジュールを、細胞がモジュール表面の100%を覆うまで37 °Cでインキュベートします。

通常、これには約7日かかります。チューブから取り出した直後のモジュールは円筒形をしています。内皮細胞でコーティングされている場合、体積が最大50%まで収縮して楕円形になり、光学顕微鏡で観察すると密度が高まり不透明になります。

これらの画像において、モジュールの直径と長さはそれぞれ d および l で示されています。次の画像は、作製時にモジュール内に均一に分散して埋め込まれた Hep G2 細胞を示しています。生細胞が緑色に染まっていることから、細胞が高い生存率を維持していることがわかります。

内皮細胞がコンフルエントになると、死細胞は赤色に染まります。モジュールの表面にはタイトジャンクションが形成されており、これは免疫蛍光法で確認できます。VE cadherinの染色による物質移動解析の結果、モジュールは、大型の組織でしばしば問題となる酸素輸送不足による壊死中心（necrotic core）を形成することなく、高い細胞密度を維持できることが示されました。

この例では、典型的な小型モジュールのmassen Tri chro染色の結果、作製から7日後においてもモジュール内に生細胞が高密度かつ均一に分布していることが示されました。対照的に、大型モジュールのコア内部には多数の死細胞が形成されており、生存細胞は外縁の薄い層にのみ限定されていました。また、コラーゲンと微細ポリマーの混合物を用いたモジュールや、薬物放出マイクロスフィアを含有させたモジュールも作製されています。

ここで、hHMEC細胞をPLGAコラーゲンモジュールに播種すると、モジュールは円筒形状を維持しますが、コラーゲンのみのモジュールと比較して細胞接着性は限定的になります。ここに、PLGAベースの生分解性マイクロスフェアを含むコラーゲンモジュールの光学顕微鏡像を示します。いくつかのin vitroアッセイが、これらのモジュールと適合することが示されています。

例えば、血管新生アッセイでは、内皮細胞を播種したモジュール上で、脂肪由来幹細胞と共に5日間培養した後、毛細血管様構造を容易に検出し定量化できます。別の例では、モジュール上での生存死アッセイの共焦点顕微鏡画像により、生存細胞が緑色に、死細胞が赤色に染色されていることが示されています。最後に、モジュールはマイクロ流体チャンバー内で使用されたり、マウスやラットに移植されたりしており、異なる細胞種間の相互作用や、宿主反応によってマイクロ組織がどのように再構築されるかの研究に利用されています。

この手順に従い、モジュールをペトリ皿や、バイオリアクター、マイクロ流体デバイスなどの他の容器で培養することができます。また、細胞種の組み合わせを変更したり、異なる直径のチューブを使用したりすることで、この手法を応用して様々な組織を作製することも可能です。ご視聴ありがとうございました。