コラーゲンゲル含有する細胞のモジュールを使用してマイクロ組織の作製
December 13th, 2010
埋め込まれた細胞とその表面を含むモジュールと呼ばれる円筒状のコラーゲンゲルを、使用して、ミクロ組織の作成は、内皮細胞で被覆されている。
この手順の全体的な目標は、組織工学実験に使用できるモジュール式の微小組織を作製することです。これは、まずシリンジを使用してコラーゲン溶液をポリエチレンチューブに引き込み、次にコラーゲンをゲル化することによって達成されます。2番目のステップは、ポリエチレンチューブを2ミリメートルの長さに切断して、マイクロティッシュモジュールを形成することです。
手順の3番目のステップは、モジュールをチューブから分離することであり、最後に、モジュールは内皮細胞でコーティングされます。最終的に、得られた微小組織は、マイクロ流体チャンバーを介した細胞の相互作用を研究するためのin vitro細胞アッセイに使用できます。さらに、微小組織を移植して、生体内での微小組織の相互作用とリモデリングを研究するための組織を生成することができます。
こんにちは、ここトロント大学のセパンラボのブレンダン・ロングと申します。大型の3D組織代替品を作成する際の大きな障害は、移植後の迅速な血管新生の欠如です。このビデオでは、この制限を克服するために、内皮細胞でコーティングされたモジュール組織を作成する方法を紹介します。
手順のデモンストレーションは、セプティン研究所の術後フェローであるチェンバレンと見なされます。中和するコラーゲンの量は、ポリエチレンチューブの長さによって異なります。このデモでは、内径0.76mm、外径1.22mmの2mポリエチレンチューブを使用します。
チューブを準備するには、20 Gの1本の針をチューブの一方の端に通し、チューブをコンバーターの自己修復ポーチに入れてガス滅菌します。1ミリリットルのコラーゲンが約2メートルのポリエチレンチューブを満たしているので、1ミリリットルのコラーゲンを中和します。コラーゲンを15ミリリットルの円錐形のチューブに入れ、チューブを氷の上に保ちます。
128マイクロリットルの10×α、コラーゲン1ミリリットル当たりのMEMをチューブに加え、溶液を繰り返しピペッティングして混合する。泡の発生を最小限に抑えるように注意しながら、酸性化したコラーゲンにαMEMが混合されると、溶液が黄色に変わります。次に、0.8モルの重炭酸ナトリウムを追加してコラーゲンを中和します pHの一般的な推定値として、黄色のコラーゲン溶液が淡いピンク色に変わるまで重炭酸ナトリウムを追加します。
通常、pH 7.4を達成するためには、コラーゲン1ミリリットルあたり30〜60マイクロリットルが必要です。中和されたコラーゲンがゲル化するのを防ぐために、使用する準備ができるまで氷の上に置いてください。コラーゲンをゼリー化する手順を開始するには、滅菌したポリエチレンチューブが入ったバッグを生物学的安全キャビネットに持って行き、チューブをバッグに入れたままバッグの密封された端を切り取ります。
滅菌されたピンセットを使用して、以前にチューブの一方の端に挿入された20ゲージの針に3ミリリットルの注射器を取り付けます。チューブのもう一方の端を中和されたコラーゲンに、先端が円錐形のチューブの底に来るまで挿入します。円錐管は氷上に保たれます。この次のステップはゆっくりと行わなければなりません、さもなければ、あなたはコラーゲンに気泡を導入します。
シリンジのプランジャーをゆっくりと引っ込めて、コラーゲンをポリエチレンチューブに引き込みます。コラーゲンがチューブから引き出されたら、20ゲージの針を引き出し、チューブの両端を袋に戻します。袋をテープで閉じた後、摂氏37度で60分間インキュベートします。
チューブを切断するために、組み立て済みの切断装置が使用されます。この手順を開始するには、切断装置の前の滅菌トレイにチューブを置き、切断装置の出口でチューブを切断装置にロードし、25ミリリットルの内皮細胞培地を含む50ミリリットルの円錐管を設定します。切断されたモジュールを収集するには、切断装置を2ミリメートルの長さのチューブを切断するように設定してから、チューブを切断します。
カットしたモジュールを50ミリリットルの円錐管に37°Cで60分間インキュベートします。チューブからコラーゲンモジュールを除去するには、モジュールを含む50リットルの円錐管を中速でボルテックスします。10秒間、モジュールをチューブの底に落ち着かせます(これには約5分かかります)。
モジュールの緩いペレットがチューブの底に形成され、チューブはメディアの上に層を形成します。モジュールが落ち着いたら、広口の10ミリリットルの血清ピペットを使用して、モジュールを15ミリリットルの円錐管に移します。ボルテックス、15ミリリットルの円錐管、そしてその後、モジュールがさらに2回沈殿するのを許します。
第2渦と第3渦から沈殿したモジュールも15ミリリットルのチューブに移されます。すべてのモジュールをチューブから取り外してプールしたら、チューブ内のメディアの量を5ミリリットルにします。これで、モジュールは内皮細胞でコーティングする準備が整いましたが、次にモジュールをコーティングするための内皮細胞の準備を示します。
まず、細胞から培地を取り出し、PBSで洗浄します。PBSを取り除いた後、トリプシンEDTAの3ミリリットルを加えて、摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、resus、細胞を7ミリリットルの培地に懸濁し、15ミリリットルのチューブに移します。
ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えると、円錐管の底にパックされたモジュールのミリリットルあたり10〜6番目の内皮細胞の5倍が必要になります。細胞を300 Gで5分間ペレット化します。細胞ペレットを5ミリリットルの内皮細胞培地に再懸濁します。
次に、内皮細胞を含む5ミリリットルの培地をモジュールに追加します。モジュールは、静的インキュベーションのために静的および動的に内皮細胞とインキュベートされ、反転によってモジュールと内皮細胞を混合し、次いでチューブを摂氏37度で15分間直立させる。15分後、チューブを再び反転させ、摂氏37度でさらに15分間インキュベートします。
モジュールを内皮細胞と動的にインキュベートするには、15ミリリットルのチューブを摂氏37度で60分間静かに揺さぶります。内皮細胞とのインキュベーションが完了したら、モジュールを非組織培養処理プレートに移し、翌日に摂氏37度で一晩インキュベートし、モジュールを新しい非組織培養処理プレートに入れ、新しい培地で未付着の内皮細胞を除去します。内皮細胞でコーティングされたモジュールを摂氏37度で、細胞がモジュールの表面の100%を覆うまでインキュベー
トします。通常、これには約7日かかります。モジュールを最初にチューブから取り出すと、円筒形に見えます。内皮細胞でコーティングされている場合、体積が最大50%収縮して楕円形になるだけでなく、光学顕微鏡で見ると密度が高くなり、不透明になります。
これらの画像では、モジュールの直径と長さはそれぞれdとlで示されています。この次の図は、製造時にモジュール内に均一に分布した埋め込まれたHep G細胞を示しています。細胞は、生細胞の緑色で示されるように、高い生存率を保持していました。
死んだ細胞は、内皮細胞がコンフルエントな場合、色が赤くなります。モジュールの表面には、免疫蛍光法で確認できるタイトジャンクションが形成されています。VEカドヘリン物質移動解析の染色により、モジュールは、より大きな組織でしばしば問題となる不十分な酸素輸送による壊死性コアを生じさせることなく、高い細胞密度を維持できることが実証されています。
この例では、典型的な小型モジュールの massen Tri chro 染色により、作製後 7 日間でモジュールが生細胞の均一で高い分布を保持していることが示されています。対照的に、大きなモジュールのコア内には多数の死んだ細胞が形成され、生存可能な細胞の薄い縁だけが残っていました。モジュールは、コラーゲンとineポリマーの混合物、または薬物溶出性マイクロスフェアを含むものでも製造されています。
ここで、h hm EC one細胞がPalinコラーゲンモジュール上に装着されると、モジュールは円筒形を保持し、コラーゲンのみのモジュールと比較して細胞の付着特性が限定されます。PLGAベースの生分解性ミクロスフェアを含むコラーゲンモジュールの光学顕微鏡画像を以下に示します。いくつかのin vitroアッセイは、モジュールと互換性があることが示されています。
例えば、血管新生アッセイでは、内皮細胞が装着されたモジュール上の毛細血管様形成物は、脂肪由来幹細胞との5日間のインキュベーション後に容易に検出および定量化できます。別の例では、モジュール上の生死アッセイの共焦点顕微鏡画像は、生細胞が緑色に染色され、死細胞が赤色に染色されていることを示しています。最後に、モジュールはマイクロ流体チャンバーでも使用され、マウスやラットに埋め込まれて、異なる細胞タイプ間の相互作用と、宿主応答によって微小組織がどのように再構築されるかを研究しています。
手順に従い、モジュールはペトリ皿またはバイオリアクターやマイクロ流体デバイスなどの他の容器で培養できます。この方法は、細胞タイプのさまざまな組み合わせを使用するか、または異なる直径のチューブを使用することにより、異なる組織を作成するように適応させることもできます。ご覧いただきありがとうございます。
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概要
この記事では、細胞を埋め込んだ円筒形のコラーゲンジェルを使用してモジュラーマイクロ組織を作成する手順について説明しています。このマイクロ組織は、様々な組織工学実験に利用できます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 組織工学
- 細胞生物学
- マイクロ流体工学
背景
- マイクロ組織は細胞間相互作用の研究に不可欠です。
- コラーゲンジェルは細胞成長のための支持マトリックスを提供します。
- 内皮細胞は組織発達において重要な役割を果たします。
- インビトロおよびインビボ応用が探究されています。
研究目的
- 組織工学のためのモジュラーマイクロ組織を生産すること。
- 管理された環境で細胞間相互作用を研究すること。
- インビボ研究のための組織発達を促進すること。
使用された方法
- コラーゲン溶液をポリエチレンチューブに引き込みます。
- コラーゲンをゲル化して固体モジュールを形成します。
- モジュールを2ミリメートルの長さに切断します。
- 内皮細胞をモジュールの表面にコーティングします。
主な結果
- コラーゲンジェルからマイクロ組織モジュールを成功裏に作成しました。
- モジュールはインビトロ細胞アッセイに使用できます。
- マイクロ組織はインビボ研究のために移植できます。
- 細胞間相互作用と組織リモデリングの研究を促進します。
結論
- この手順により機能的なマイクロ組織の作成が可能になります。
- これらのマイクロ組織はインビトロおよびインビボ研究の両方で価値があります。
- 再生医療と組織工学における潜在的な応用があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Modular micro-tissue fabrication addresses the vascularization bottleneck in 3D tissue engineering by enabling scalable, perfusable constructs with embedded or coated endothelial cells. This approach supports predictive modeling of cell-cell interactions and tissue remodeling in both in vitro and in vivo settings, reducing late-stage attrition in regenerative medicine programs. The method provides a tunable platform for de-risking therapeutic hypotheses through standardized, reproducible tissue modules.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled co-culture of multiple cell types within diffusion-limited modules.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining high cell viability and uniform distribution without necrotic cores.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by modeling vascularized tissue microenvironments relevant to drug response.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized micro-tissue substrates compatible with angiogenesis, live/dead, and microfluidic assays for quantitative readouts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through uniform module dimensions and consistent endothelial coating efficiency.
- Scalability: Allows parallel preparation of hundreds of modules for high-content screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant systems for studying host-tissue interaction and remodeling post-implantation in rodent models.
- Operational Value: Bridges in vitro findings to in vivo studies using identical module batches, enhancing translational continuity.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of vascular integration and tissue stability prior to costly preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The module fabrication process fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, supporting assay-ready tissue generation and preclinical continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise spatial arrangement of cell types to study paracrine signaling and dependency.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized tissues with quantifiable outputs such as capillary formation and viability metrics.
- Analytics: Generates measurable dependent variables including module dimensions, cell density, oxygenation status, and endothelial coverage for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro angiogenesis and microfluidic assay results to in vivo implantation outcomes, supporting risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform adaptable to various cell types, gel materials, and tubing diameters across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in tissue-level drug responses through vascularized models.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via defined module fabrication and coating protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of vascularization failures and necrotic core formation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of leads based on tissue-level performance in perfusable, modular systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, sterile technique, and microfluidic handling.
- Depends on access to biological safety cabinets, precision cutting devices, and incubators for gelation and cell culture.
- Necessitates standardization of collagen neutralization, tubing preparation, and endothelial cell seeding density across teams.
- Involves adaptation considerations when substituting collagen with crosslinkable gels or altering tube diameters for different module sizes.
- Limited by diffusion constraints in uncoated modules and the time required to achieve full endothelial coverage (up to seven days).
