Name: エレクトロスピニングの基礎：最適化ソリューションと装置のパラメータ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学ぼう、エレクトロスピニングによるナノファイバースカフォールドの作成法。溶液パラメータと装置設定の最適化により、組織工学で細胞培養に適した均一な繊維を生成する技術を習得できます。

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この作品は、NIH K08 EB003996とアメリカ研究財団助成2573の麻痺退役軍人によってサポートされていました。

1。ポリマーを選択してください<ol><li>ユーザの仕様に基づいて、ポリマー（例えば、ポリ- L -乳酸（PLLA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリスチレン（PS）またはナイロン）（例えば、生分解性、熱可塑性または架橋性）とそのポリマーの溶剤を選択してください。あなたの選択に基づいて適切な保護具を選択してください。 </li><li>アプリケーションに基づいて、基板（例えば、ガラス、プラスチック、金属またはシリコンウェハ）を選択します。 </li></ol> 2。コレクタを選択します。 <ol><li>あなたの仕様に基づいてコレクタの形状を選択します。ランダムな繊維は、静止プレート上で収集することができます。整列繊維は、急速に回転する車輪、ドラムまたはロッド、またはパラレルプレート上に収集することができます。 </li><li>コレクタは、導電性でなければならず、それはまた、隣接するオブジェクト、テーブルトップ、等を接地せずに接地することができるような方法で、そのアクセルから絶縁しておく必要があります</li></ol> 3。経験的に1およその臨界絡み合い濃度<ol><li>いくつかの候補のポリマーの濃度（例えば、4、10、15、20、30重量％）を準備してから開始する（解決策は、粘性の高い液体ではなくゲルでなければならない）フロー濃度を選択してください。 </li><li>エレクトロスピニング装置2,3,4,5を設定する（図1を参照） <ol><li>シリンジポンプをロードし、先端からワイプソリューションのいずれかのビーズが、即座に交換されるようにポンプ速度を設定します。 </li><li>グランドコレクタと導体プレート（そのような注射器の先端の突出を介してアルミ箔等の導電性材料の小さい正方形）に高電圧線をクリッピング。 </li><li>車輪が回転し始める。 </li><li>電源装置はワークステーションの電源を入れる前にゼロに設定されていることを確認します。 </li></ol></li><li>ストリームを観察<ol><li>徐々に電圧をランプアップし、針先での解のビーズを見る。 </li><li>長いと安定したストリームを取得するために電圧を調整する。安定した流れが得られない場合、ポリマー溶液の濃度を調整する。例えば、表1を参照してください。 </li></ol></li></ol> 4。トラブルシューティング - ストリーム： <ol><li>ストリームの表示に問題<ol><li>濃いマットの背景を使用し、視聴者とストリームの間に単方向の光源（例えば、懐中電灯など）（図2参照）に置きます。 </li></ol></li><li>シリンジの先端から滴り落ちる<ol><li>ポリマー溶液は、車輪にない魅力でまっすぐ下方に滴下されている場合は、導体板は、針の先端との接触を作っているし、コレクターが地面との接触をしていることを確認してください。 </li><li>シリンジ先端のポリマー溶液の液滴は、ホイールの方向に傾いてもストリームを形成していない場合、電圧を増加させる。ストリームの品質が安定した流れが見えるようになるまでの距離と電圧を変えることによって調整することができます。 4％のPLLAの解と8x8 cmの導体板に対応する電圧で、推奨距離については、図3を参照してください。 </li></ol></li><li>シリンジの先端に大きなグロブ<ol><li>ポリマー溶液は、非導電性の棒に接続されたペーパータオルでグロブ離れて針、スワイプの先端で収集し、硬化を開始したとき。 </li></ol></li><li>振動または'振る'ストリーム ストリームが急速に上下に振るとされている場合、電圧を下げるか、注射器の先端とホイールの間の距離を増加させる。ストリームは、WAGポリマーのより高い濃度を使用するか、遅い蒸発で少し溶剤を追加し続けている場合。 </li><li>ショートまたは不連続のストリーム 高回転速度でホイールをセットして観察可能な接触することは一定した流れは均一とアラインメントの最高品質が得られます。ストリームは、溶媒の蒸発、およびストリームの長さと安定性を向上される電圧を調整し、より遅いの追加、ポリマー溶液を増やし、短いと不連続である場合。 </li></ol> 5。トラブルシューティング-繊維形態6,7,8（図4を参照） <ol><li>ビーズ ビーズが繊維に発見されている場合、ポリマー溶液を増加させ、導体板は、針で連続的な接触をしていると、接地ワイヤブラシはホイールで連続的な接触をしていることを確認してください。 </li><li>リボンと出血繊維 繊維のリボンとして形成されているか一緒に出血しているときは、ポリマーのより高い濃度または蒸発率が高い（より揮発性）を持つ溶剤を使用してください。 </li><li>渦巻き図形または波状繊維 繊維は波や渦巻き様を形成している場合、車輪の速度を増やすか、コレクターから、さらに針先を移動する。また、導体板とコレクタが振動していないことを確認してください。 </li><li>気孔率9 毛穴が必要な場合は、急速に蒸発溶剤を使用してください。毛穴が望まれていない場合は、主要な溶剤よりも揮発性である共溶媒を少量添加してみてください。 </li><li>アライメント10 コレクターはMOVのとき低回転時や安静時のING、アライメントの品質が悪いです。車輪の速度を増加させることによりアライメントを増やします。 </li></ol> 6。代表的な結果： 典型的な繊維の結果の描写については、図4を参照してください。 <img src="/files/ftp_upload/2494/2494fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1典型的なエレクトロのセットアップ。ポリマー溶液（青）はシリンジポンプ（オレンジ）から分配される。高電圧直流電源（緑）を理由配向ナノファイバーが収集され、その上に急速に回転するホイール​​のコレクタ（グレー）。シリンジとコレクタの間にポリマージェットは安定したストリーミングセグメントと急速に振動ホイップセグメントで構成されています。 <img src="/files/ftp_upload/2494/2494fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2ストリーミングジェットは、シリンジの先端から出る可視であり、ホイップ、ジェットが見られるように小さすぎる。 PLLAの臨界絡み合い濃度の近似<table border="1"><tbody><tr><td> PLLA（％重量/ V） </td><td> 観測 </td><td> 濃度調整 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td>ドリッピングありません。なくストリームを</td><td>増加する</td></tr><tr><td> 2.0 </td><td>小さなグロブ唾吐きありません。なくストリームを</td><td>少しIncrese </td></tr><tr><td> 4.0 </td><td>安定したストリーム</td><td>良好な</td></tr><tr><td> 6.0 </td><td>大グロブやビーズを吐き</td><td>わずかに減少</td></tr><tr><td> 12.0 </td><td>先端部に凝集しない;ないストリーム</td><td>減少する</td></tr></tbody></table> 表1の例では、PLLAの臨界絡み合い濃度の近似を描いた。いろいろなポリマー濃度が試されており、安定したストリームになるまで観測された結果のストリーミングジェットが得られる。 <img src="/files/ftp_upload/2494/2494fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3シリンジの先端とコレクタ間の距離は、安定したストリーミングジェットを得るために印加電圧とバランスを取る必要があります。過剰な印加電圧はあまり揃え繊維でその結果を形成するために、振動や"振る"ジェットが発生します。電圧が低すぎると、何ジェットが形成されず、ソリューションは、唯一のシリンジの先端から滴下される。紫色の網掛け領域は、上記の安定したストリーミングジェットはシリンジ - コレクタ間距離の関数としてPLLAのために得ることができる以上の電圧範囲を表します。 <img src="/files/ftp_upload/2494/2494fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。エレクトロ繊維は玉が付く（）、リボン（B）、渦巻き様（C）、多孔質のグロブ（D）、良好なアライメント（E）と貧しいアライメント（F）を含めて、形態の様々な展示ができます。

<ol><li>Shenoy, S. L., Bates, W. D., Frisch, H. L., Wnek, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chain+entanglements+on+fiber+formation+during+electrospinning+of+polymer+solutions%3A+good+solvent%2C+non-specific+polymer-polymer+interaction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Role of chain entanglements on fiber formation during electrospinning of polymer solutions: good solvent, non-specific polymer-polymer interaction limit.</a> Polymer. 46, 3372-3384 (2005).</li>
<li>Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+neuritogenesis+and+maturation+of+primary+spinal+motor+neurons+in+response+to+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers.</a> Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).</li>
<li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mat.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li>
<li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li>
<li>Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+electrospun+nanofibers+specify+the+direction+of+dorsal+root+ganglia+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).</li>
<li>Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li>
<li>Yang, F., Murugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+nano%2Fmicro+scale+poly%28L-lactic+acid%29+aligned+fibers+and+their+potential+in+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering.</a> Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).</li>
<li>Li, W., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+structure%3A+A+novel+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 60, 613-621 (2002).</li>
<li>Kim, C. H., Jung, Y. H., Kim, H. Y., Lee, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+collector+temperature+on+the+porous+structure+of+electrospun+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of collector temperature on the porous structure of electrospun fibers.</a> Macromol. Res. 14, 59-65 (2006).</li>
<li>Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+highly+aligned+electrospun+poly-L-lactic+acid+fibers+for+nerve+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

注：例の大部分は、ポリ- L -乳酸（PLLA）ナノファイバーをエレクトロスピニングを扱うここで紹介。 PLLAは、我々の研究室で最も一般的にスピンポリマーであるため、これは単純です。しかし、我々はまた、成功した他のポリマー（例えば、PLGA、PCL、PS）electrospinとここに示す手法は、高分子量のポリマー溶液半ばまでの大部分に容易に適用可能であることを信じるようにこれらのメソッドを使用している。

<table><tbody><tr><td>高電圧DC電源</td><td>Gamma High Voltage</td><td>ES40P-5W</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鈍端メタルチップ, 23ga</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-850-102</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンシリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>回転または固定式コレクター</td><td>特注品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>各種ワニ口クリップおよび配線</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC11622-0010</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42355-0040</td><td></td></tr><tr><td>PLLA</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>Resomer L210</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 85:15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43471</td><td></td></tr><tr><td>カーボンテープ</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13073-1</td><td></td></tr></tbody></table>

エレクトロスピニングの基礎：最適化ソリューションと装置のパラメータ

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

エレクトロスピニングナノファイバーの足場は、成熟を ​​加速成長を向上させ、in vitroでの細胞の遊走を誘導することが示されている。エレクトロスピニングは、帯電したポリマーのジェットが接地コレクタで収集されるプロセスです。整列ナノファイバーで急速に回転するコレクタの結果をランダムに配向した繊維マットで固定コレクターの結果ながら。ポリマージェットは、適用の静電荷は溶液の表面張力を克服した時に形成される。所与のポリマーの最小濃度がある、重要なエンタングルメントの濃度は、安定したジェットを達成することができないとはナノファイバーが形成されませんこれを下回る、と呼ば - ナノ粒子を達成することができるが（エレクトロ）。安定したジェットは、2つのドメイン、ストリーミングセグメントとホイップセグメントがあります。ホイップジェットは通常肉眼では見えないですが、ストリーミングの部分は、多くの場合、適切な照明条件の下で表示されます。ストリームの長さ、太さ、一貫性と動きを観察することが形成されるナノファイバーの配置と形態を予測するのに便利です。短期、不均一な、一貫性のない、および/または振動ストリームは、飛散ビーズ、そして渦巻き図形または波状のパターン、貧しいファイバーアライメントを含め、さまざまな問題の指標となる。ストリームは、このように生産されている繊維のアラインメントと形態を最適化する、溶液の組成とエレクトロスピニング装置の構成を調整することによって最適化することができます。このプロトコルでは、我々は経験的に、ポリマー溶液の臨界絡み合い濃度を近似し、エレクトロスピニングプロセスを最適化し、基本的なエレクトロスピニング装置を設定する手順を提示する。さらに、我々はいくつかの一般的な問題とトラブルシューティングのテクニックについて説明します。

エレクトロスピニング技術は、組織工学やその他のアプリケーションのためのナノ繊維足場の様々を作成することができます。ここでは、所望の形態と配置に繊維を得るためにエレクトロソリューションと装置のパラメータを最適化する手順を説明します。一般的な問題とトラブルシューティングのテクニックも紹介されています。

電界紡糸法（エレクトロスピン法）によるナノファイバー足場材は、in vitroにおいて細胞の成熟を促進し、成長を改善し、遊走を方向づけることが示されている。...

この実験では、in vitro および in vivo における細胞支持用の細胞外構造として、ナノファイバー足場の電界紡糸法（エレクトロスピニング）について実演します。まず、目的とするナノファイバーのタイプに適したポリマー溶媒とコレクターの形状を選択してください。このプロセスで最も重要なステップは、ファイバーの形成が可能となる臨界絡み合い濃度を決定することです。次に、繊維の直径、密度、および配向性を制御するようにシステムを調整します。目的とする電子顕微鏡像は、紡糸可能な繊維の種類を示しています。これらの電界紡糸ナノファイバー足場は、in vitro において細胞の成熟を促進し、増殖を改善し、遊走を誘導することが示されています。一般的に、この手法に不慣れな方は、エレクトロスピンニングが非常に繊細なプロセスであるため、習得に苦労することがあります。装置の最適化ステップは、エレクトロスピンニングの経験がないと理解しにくいため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。エレクトロスピンニングに使用するポリマーと溶媒を選択する際は、最終的な用途を念頭に置き、生分解性、熱可塑性、架橋能などの特性を考慮してください。次に、選択内容に基づいて、必要となる適切な個人用保護具を決定します。続いて、ガラス、プラスチック、金属、またはシリコンウェハーなど、ナノファイバーを収集するための基板を選択します。その後、コレクターの形状を選択してください。ランダムに配向したファイバーは固定プレート上に回収されます。配向したファイバーは高速回転するホイール、ドラム、ロッド、または平行プレート上で回収できますが、コレクターが導電性であり、かつ隣接する物体を接地させることなく単独で接地できるように絶縁されていることを確認してください。回転式コレクターを使用する場合、ホイールは軸から絶縁されている必要があります。臨界絡み合い濃度を経験的に近似するために、いくつかの候補となるポリマー濃度を調製し、その中から流動性のある濃度を選択します。溶液は粘性のある液体である必要があり、ゲル状であってはなりません。次に、電界紡糸装置をセットアップします。シリンジをコレクターから20 centimeter離して配置し、選択した溶液をシリンジポンプに充填して、チップから拭い去られた溶液の液滴がすぐに補充されるようにポンプ速度を設定します。コレクターを接地し、高電圧ワイヤーを導電板にクリップで固定します。ホイールの回転を開始する前に、電源がゼロに設定されていることを確認してください。電圧をゆっくりと上げながら、針先にある溶液の液滴を確認し、ストリームを観察します。電圧を調整し、長く安定したストリームが得られるようにします。安定したストリームが得られない場合は、まずポリマー溶液の濃度を調整してください。ストリームが見えにくい場合は、暗色のマットな背景を使用し、観察者とストリームの間に単一方向の光源を配置してください。ポリマー溶液がホイールに引き寄せられず、シリンジのチップからそのまま垂直に滴り落ちることがあります。この場合は、導電板がニードルチップに接触していること、およびコレクターが接地されていることを確認してください。シリンジチップのポリマー溶液の滴がホイール方向に傾いているものの、ストリーム（線状の流れ）が形成されない場合は、電圧を上げてください。安定したストリームが見えるまで、距離と電圧を調整します。シリンジの先端に大きなポリマーの塊が形成された場合は、非導電性スティックに取り付けたペーパータオルでその塊を拭き取ってください。ストリームの振動や揺れを修正するには、電圧を下げるか、シリンジ先端とホイールの間の距離を広げてください。ストリームの揺れが続く場合は、より高濃度のポリマーを使用するか、蒸発速度の遅い溶媒を少 amount 溶液に加えてください。可視状態で、高速回転に設定されたホイールに確実に接触する安定したストリームが、最も高い均一性とアライメント品質をもたらします。ストリームが短く不連続な場合は、ポリマー溶液の濃度を上げて、ストリームの長さと安定性を向上させてください。揮発速度の遅い溶媒を追加するか、電圧を調整してください。固定プレートでランダムファイバーを回収している際、空中でファイバーがシート状やヤーン状になり始めることがあります。これは、電圧が高すぎること示す兆候です。ファイバーにビーズ（凝集点）が見られた場合は、ポリマー溶液の濃度を高め、導電プレートがニードルに、接地されたワイヤーブラシがホイールにそれぞれ連続的に接触していることを確認してください。さらに、ストリーム（噴射流）を安定させるようにしてください。ストリームが断続的である（spitting）ことは、多くの場合、ビーズ状のファイバーが形成されていることを示しています。ファイバーがリボンのように形成されたり、互いに癒着したりする場合、または波打ったりカールしたりする場合は、ポリマー濃度を高めるか、蒸発速度のより速い溶媒を使用して修正してください。また、ホイール速度を上げるか、ニードルチップをコレクターからさらに離してください。あわせて、導電板とコレクターが振動していないかを確認してください。時に孔が形成されることがありますが、その場合は単に揮発性の高い溶媒を使用してください。一方で、孔の形成を避けたい場合は、主溶媒よりも揮発性の低い共溶媒を少量添加することを検討してください。コレクターが低速（低RPM）で回転している場合や停止している場合は、配向性は低下します。ホイールの回転速度を上げることで、配向性を高めます。電界紡糸によるナノファイバーは、さまざまな細胞種の培養および研究に有効です。例えば、ラット初代ニューロンを用いて、β-tubulinおよび核対比染色のDAPIによる染色を行うことができます。重要な点として、紡績溶液にスルホローダミンなどの染料を添加することで、作製後のファイバーを可視化することが可能です。この手法により、バイオマテリアルや細胞生物学分野の研究者は、細胞とさまざまなナノトポグラフィーの特徴や幾何学的形状との相互作用を探索できるようになりました。高電圧での作業は非常に危険であるため、この手順を実施する際は、常に操作者を装置から隔離するなどの予防措置を講じることを忘れないでください。

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