動脈組織工学におけるエラストマーのPGSの足場

このビデオでは、多孔質の管状足場を作製し、動脈組織工学のための動的機械的コンディショニングを行う方法を示します。これは、最初に生分解性エラストマーとアサルトフュージョン法を使用して足場を製作することによって達成されます。次に、足場を細胞播種用に準備し、バイオリアクターシステムに組み立てます。

バイオリアクターでは、血管平滑筋細胞が足場に種をまき、培養されます。数週間後、走査型電子顕微鏡、hおよびe染色、エラスチン自家蛍光を用いて組織を採取し、分析します。結果として得られる平滑筋は、多層的で垂直に配向しています。

粒子状漂白剤のように存在するこの技術の主な利点は、ガラス型を使用して多孔質の管状足場とヒアルロン酸を製造することです。型がなくなると、足場型はガラス管から準備されます。ホルダーにチューブを入れ、前日に準備したヒアルロン酸溶液をチューブに注ぎます。

ヒアルロン酸は内壁に沿ってゆっくりと流れ落ちます。金型の底に達したら、金型を裏返します。金型の内壁が溶液で均一にコーティングされるまで、この手順を繰り返します。

コーティング後、準備したすべてのガラス型を37°Cの真空オーブンで24時間乾燥させます。通常、ガラス型が乾く間、4つの型が同時に準備されます。塩粒子を注ぎ、粉砕し、SVE塩粒子を25〜32マイクロメートルに

翌日、準備したガラスモールドマンドレル、PTFEチューブ、熱収縮スリーブ、PTFEリングを組み立てます。まず、マンドレルを65mmの長さのPTFEチューブに装填し、摂氏120度で5分間焼きます。戦前に37°Cのハイブリダイゼーションインキュベーターを少なくとも30分間待っている間にPTFEを縮小する。

チューブがマンドレルを包み込んだら、熱収縮スリーブをマンドレルに押し付けて、自由に動くようにします。次に、マンドレルをガラス金型の内側に置き、マンドレルの底にA-P-T-F-Eリングを取り付けます。PTFEリングがガラス金型の底にぴったりとフィットしていることを確認します。

次に、へらとシリコンゴムの漏斗を使用して、ガラス型に塩粒子のお粥を追加します。次に、ヘラで型を軽くたたいて粒子が均一になるようにし、余分な塩分をこすり落とします。次に、温めたインキュベーターの電源を切り、塩を詰めた型ですばやくロードします 塩は次の30分間で融合し、その後、37°Cの真空オーブンで型を24時間乾燥させます。

冷却した翌日、PTFEリングを固定したままステンレス製のマンドレルを押し出すようにして金型から取り外します。必要に応じて、ラジオペンチを使用してください。次に、PTFEリングを金型の底から取り外します。

次に、型を焼いてスリーブを縮め、縮んだスリーブを型から取り出します。型が使用されるまで冷まし、フードの乾燥剤に保管します。アポドロッパーを使用して、ガラス型を45度に角度付け、型をゆっくりと回転させながらPGS溶液を内側のルーメンに落とします。

PGS溶液が金型の壁に沿って流れ落ちるかどうかを確認します。ドライスポットがある場合は、PGSを追加します 次に、THFがフード内で少なくとも30分間蒸発するのを待ちます。THFがなくなったら、真空オーブンで型を硬化させます。

1日硬化させた後、金型を室温まで冷却し、摂氏24度の脱イオン水にゆっくりと垂直に浸します。それらを急いで傾けると、気泡が発生し、足場が引き裂かれます。型を慎重にウォーターバスに移します。

シリコンチューブを使って斜めに置き、ヒアルロン酸が1時間かけて溶解するのを待ちます。1時間経ってもヒアルロン酸が型から放出されない場合は、型を沈めたまま、へらを使ってヒアルロン酸を両端からゆっくりと押し出し、ゆっくりと型を振ってください。次に、足場がガラス型内で動いていないことを確認し、動いている場合は、鉗子で足場をゆっくりと引っ張って型から外します。

次に、繊細な足場を静かに攪拌しながら脱イオン水浴に慎重に移すことにより、塩粒子を浸出させます。これには少なくとも3日かかり、塩がすべて浸出した後、各足場を脱イオン水で満たされた15ミリリットルの遠心分離管に移し、ドライアイスボックスで1時間凍結します。凍結した遠心チューブを凍結乾燥機に入れ、キャップを開けた状態で3日間入れます。

凍結乾燥したら、足場を使用できるようになるまで乾燥剤で保管します。まず、足場を25〜30ミリメートルの長さにカットします。次に、各ストッパーの中央の穴にPTFEチューブを通して、2つのシリコーンゴムストッパーを準備します。

次に、1.5ミリメートルの長さのhsリングをカットし、足場の一方の端に長さをスライドさせます。ストッパーに取り付けられた1本のPTFEチューブを、HSリングの下に十分な重なりを持たせて足場の同じ端に押し込み、足場をチューブにしっかりと接続し、HSリングをオーブンで収縮させ、アセンブリを室温まで冷まします。さて、バイオリアクターチャンバーとして機能する50mmのポリカーボネートチューブが足場の上を滑り落ち、シリコーンゴムストッパーの内面に固定されています。

以前と同様に、別のPTFEチューブとストッパーを足場のもう一方の端にhsリングで固定してチャンバーを完成させます。2番目のストッパーは、ポリカーボネートチューブのもう一方の端に取り付けられています。次に、ストッパーの外面を2枚のアルミ合金板に取り付けます。

2本のネジ付きロッドを各プレートのサイドホールに送り込み、つまみネジでプレートを固定します。バイオリアクターに足場を取り付けます。次に、各足場の見える長さ、つまり 2 つの hs リング間の距離を測定し、それらの内面面積を計算します。

細胞播種用。オートクレーブで、バイオリアクターユニットの各部分とともに、ホイルで個別に包まれたチャンバーを滅菌します。滅菌後、細胞培養フード内でバイオリアクターを組み立てました。

フロー回路で毎分1ミリメートルの蠕動ポンプを使用して、一連の灌流で足場を前処理し、すすぎます。まず、70%エタノール、50%エタノール、次に25%エタノールでそれぞれ1時間すすぎます。3回のエタノールリンスに続いて、2時間のPBSリンスを行います。

最後に、バイオリアクターをSMC培地で24時間灌流し、その後、細胞播種および実験の準備が整います。添付の原稿の指示に従って、バイオリアクターに200万細胞/センチメートルの二乗を播種し、次の21日間でチューブ媒体を交換し、ポンプ速度を調整します。徐々に、コンストラクト内の圧力は、培養初日の約4ミリメートル水銀柱から、培養2週間後には100ミリメートル水銀線以上に増加し、培養3週間後には細胞を回収し、添付の原稿に明記されているように分析のために準備します。

これらの管状PGS足場は、塩融合法によって作製されました。走査型電子顕微鏡写真により、すべての足場の肉厚が均質であり、断面に部分的な欠陥がないことが示されました。ランダムに分布したマクロ孔とミクロ孔が、すべての足場の管腔表面に観察されました。

細胞培養後、多層SMCは流れ方向に対して垂直に成長しました。さらに、細胞とDCMタンパク質は、すべてのPGSコンストラクトの内腔を完全に覆っていました。エラスチン自家蛍光はまた、構築物の管腔表面に円周方向に組織化された弾性繊維を示した。

このビデオを見た後、多孔質の管状足場の作り方を理解し、事前に設計されたバイオリアクターを使用して細胞と培養足場を見ることができるはずです。