拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

本手順の全体的な目的は、拍動型バイオリアクターシステムを用いて生物学的ベースの血管グラフトを構築することです。これは、細胞が成長するための biodegradedable な足場として PGA メッシュを準備し、それらをバイオリアクターチャンバー内に組み込むことで達成されます。その後、足場に平滑筋細胞を播種し、空気および給餌チューブを備えた蓋でバイオリアクターチャンバーを密封します。

その後、バイオリアクターをフローシステムに接続し、バイオリアクター内の血管に拍動流を供給します。リアクター内において、細胞は免疫化学的、生化学的、および機械的な試験に合格する血管へと成長します。この手法は、動脈バイパス用の移植可能な小径血管グラフトを再生するための有望なアプローチであるため、冠動脈疾患の治療への応用が期待されます。

この手法は血管工学への洞察を提供しますが、周期的な生理学的力の作用下にある他の器官系にも適用可能です。一般に、この手法に不慣れな方は習得に苦労します。スキルを完全に習得するには、多くの練習が必要です。

私たちは、工学的に作製した構築物を再生させるために、生理的な機械的刺激を適用することの重要性に気づいたとき、初めてこのアプローチを考案しました。バイオリアクターの操作プロセスは工程が多く、習得が困難であるため、この手法を視覚的に実演することが極めて重要であり、詳細なデモンストレーションを通じてのみ習得可能です。まず、蒸留水を用いて内径3 mm、長さ30 cmのシリコンチューブを洗浄し、自然乾燥させます。

ハサミを使用して、チューブ1本につき1.1 cm × 8 cmのPGAメッシュを切り出します。止血鉗子を用いて、Dexon 6.0縫合糸でPGAメッシュをチューブに固定し、外科結節を3回結んだ後、止血鉗子でシングルステッチを施します。これにより固定されたメッシュがPGAスキャフォールドとなります。スキャフォールドの洗浄は、まず1 M水酸化ナトリウム溶液に1〜2分間浸し、その後、蒸留水に2分間ずつ3回浸して行います。洗浄の合間に軽く叩いて水分を除き、3回目の洗浄後、フード内で15分間自然乾燥させます。

乾燥後、メッシュの両端に1 cmのダクロンカフを3針で縫合します。チューブを2〜3 mm重ねて配置し、チューブに穴を開けないように注意してください。本プロトコルの後続の手順で使用するため、縫合糸は約15 cm残しておいてください。

すべてのバイオリアクターの構成部品および器具は、事前になオートクレーブ滅菌を行います。バイオリアクターの培養を開始する前日に、バイオリアクターを部分的に組み立て、バイオリアクターの構成部品（スキャフォールド、メッシュ、シリコンチューブ、手術器具、およびバイオリアクターの全長より長い細いワイヤー）を70%エタノール溶液に30分以上浸漬させます。ワイヤーを使用して、シリコンチューブをリアクターのサイドアームに通します。

次に、バイオリアクターを取り出し、フレア状のガラス縁の上にダクロンカフを固定して、内部にPGAスキャフォールドを取り付けます。余った縫合糸を使用して、各カフを縛り付けて固定してください。続いて、コネクターを用いて、スキャフォールドの一方の側のシリコンチューブをバイオリアクターアームの1ペアに接続し、スキャフォールドの反対側のチューブを残り2本のアームに接続します。

コネクタを取り付けたら、サイドアームからそれらを引き抜き、バイオリアクター内をエタノールで洗浄します。リアクターの両側をそれぞれ10分間浸漬させます。バイオリアクターをシャーレの上に置き、組織培養液で洗浄します。

水を流して洗浄します。ピペットを使用して、メッシュとチューブの中まで確実に洗浄してください。次に、後で使用するために滅菌済みの撹拌子をリアクターに入れ、ここから一晩、ブロワーをONにしUVライトをOFFにした状態でフード内で装置を乾燥させます。

コンタミネーションの原因となるため、リアクターの上に身を乗り出さないでください。セットアップ時には、すべてのコネクターをアルコールで拭き取って洗浄する必要があります。接続を行う前に、多くの接合部をパラフィルムで補強します。パラフィルムは適用前に70% ethanolに浸しておく必要があるため、アルコールとパラフィルムを十分に用意してください。

汚染から内部のPGAスキャホールドを保護するため、予防策として各バイオリアクターの開口部に滅菌済みペトリ皿を置いて準備しておきます。次に、バイオリアクターの3番目の未使用アームに注入ポートを取り付け、セットアップを開始します。続いて、IVバッグをフローシステムに接続します。

ウォルラスチューブセットを使用し、Y字接合部にできるだけ近い位置で青色の端を縛り、チューブをクランプします。赤色のチューブをIVバッグの遠位端に接続します。次に、白色のチューブをフローシステムの片側に接続します。

フローシステムに3方活栓を挿入します。圧力トランスデューサーチューブの一端を活栓に接続し、もう一端をIVバッグの中央の開口部に接続します。次に、フローシステムを部分的に満たし、漏れがないかを確認するため、350 millilitersのPBSおよび1%fungi zoneをIVバッグに加えます。

フローシステムに接続する前または後に60 mLのシリンジを用い、ストップコックを調整してPBSの流れ方向を制御し、バッグを絞ってシステムをフラッシュします。この手順は、細胞を定着させる前または後のどちらでも行えます。これで、バイオリアクターに細胞を定着させることができます。

この例では、1枚のコンフルエントなT 75フラスコ分に相当する約800万個のSM細胞を1.25 mLの培地で再懸濁し、ダクロン接合部からダクロン接合部までPGAスキャフォールド上に均一に滴下します。細胞を添加した後、バイオリアクターのリムをアルコールで拭き取って清掃してください。リアクターの上で身を乗り出さないようにしてください。

次に、シリコンストッパーのリッドを慎重に組み立てます。オートクレーブバッグから取り出す際や、その後の取り付け手順において、リッドの底面を露出させないように注意してください。まず、インジェクションポートをフィーディングチューブのオスコネクタに取り付けます。

次に、3つのエアポートそれぞれにPTFE 0.20 micronフィルターを取り付けます。続いて、注入ポートをフィルムで密封します。組み立てたシリコンストッパー蓋をガラスバイオリアクターに挿入します。

給餌チューブが設置済みのPGAスキャフォールドに接触していないことを確認してください。その後、パラフィルムで密閉します。次に、バイオリアクターをフローシステムに接続し、バイオリアクターとフローシステムを37 °Cのインキュベーター内に設置します。

25～30分間、リアクターを横にし、5分ごとに回転させます。次に、インキュベーター内に入れたまま、ポンプを用いてフィードチューブから400 mLの4-10培養液をバイオリアクターチャンバーに充填します。その後、播種したスキャフォールドを、拍動ポンプを用いずに37 °C、5% CO₂の条件下で6～7日間インキュベートします。

ポンプを起動するまでの間、培地交換やビタミンCの補充は不要です。チューブに漏れや折れ曲がりがないか確認してください。次に、ポンプの速度を調整し、圧力を-30から270 mmHgの範囲に維持します。培養期間中は毎日この圧力を監視し、維持してください。

培地交換およびアスコルビン酸の添加は、脈動ポンプを用いて新鮮な培地を供給しながらスキャフォールドを成長させている間、週に2回行う必要があります。まず、培地の交換と廃培地の回収の両方の目的で、供給用蓋に注入ポートとPTFEフィルターを取り付けます。次に、供給チューブを双方向ポンプにしっかりと固定し、一方の端をバイオリアクターの供給ポートに、もう一方の端を供給用蓋に挿入します。その後、ゆっくりと200 millilitersの培地をポンプで排出します。

ポンプ速度を徐々に上げます。次に、新しい供給チューブを取り付け、200 millilitersの新鮮な培地をゆっくりとポンプで注入し始めます。リアクターにアスコルビン酸を添加するには、滅菌済みの30 milliliterシリンジを用いて、培地を25 milliliters取り除きます。

滅菌したアスコルビン酸溶液を5 mL加え、その後25 mLを戻します。作製された血管は不透明に見え、8週間の培養後に壁厚は約250 µmに達します。拍動条件下での作製血管のヘマトキシリン・エオジン染色の結果、組織形態は時間経過および拍動に伴って変化することが示されています。

血管の管腔側をLで示しています。Masson's trichrome染色により、4週間のパルス負荷をかけた血管は、非パルス負荷の対照群よりもコラーゲンが多いことがわかります。白矢印は、12週時点で血管内に残存しているPGA断片を示しています。免疫化学的分析により、早期平滑筋マーカーであるalpha actin、中間平滑筋マーカーであるcalponin 1、および後期平滑筋マーカーであるmyosin heavy chainの発現が示されています。この手法に習熟すれば、適切に実施することで7〜8時間で完了させることができます。

本手順を実施する際は、本プロトコルに従い、すべての操作を可能な限り清潔かつ無菌的に行うことが重要です。生体内研究において、構築血管の維持における管腔表面修飾の重要性など、さらなる疑問を解消するために、構築血管の管腔修飾などの他の手法を併用することも可能です。開発後に行います。

この技術は、組織工学、特に血管工学の分野の研究者が、動物モデルにおける冠動脈疾患の潜在的な治療手段を探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、動的な後培養を通じて、植込み可能な工学的血管グラフトを実現する方法について深く理解できるはずです。水酸化ナトリウムの取り扱いは危険を伴うため、この手順を行う際は、常に保護メガネや白衣などの予防措置を講じることを忘れないでください。