拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

この手順の全体的な目標は、拍動性バイオリアクターシステムを使用して生物学的ベースの血管移植片を設計することです。これは、細胞が列を成長させるPGAメッシュから生分解性の足場を準備し、バイオリアクターチャンバーで組み立てることによって達成されます。次に、足場には平滑筋細胞が装着され、空気と栄養チューブのついた蓋がバイオリアクターチャンバーを密閉します。

次に、バイオリアクターをフローシステムに接続して、バイオリアクター内の容器に拍動性の流れを提供します。リアクター内では、細胞は免疫化学的、生化学的、機械的試験に合格する血管に成長します。この技術の意味は、冠状動脈疾患の治療にまで及びます。なぜなら、この技術は動脈バイパスのための埋め込み型小径血管移植片を再生するための有望なアプローチであるからです。

この方法は血管工学に関する洞察を提供しますが、周期的な生理学的力の下にある他の臓器系にも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな個人は苦労します。スキルを完全に習得するには、多くの練習が必要になります。

このアプローチのアイデアを最初に思いついたのは、工学的構造を再生するために生理学的機械刺激を適用することの重要性に気付いたときでした。バイオリアクターのシングプロセスは、多くのステップがあり、詳細なデモンストレーションによってのみ取得できるため、習得が難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。まず、蒸留水を使用して、内径3mmのシリコンチューブの30センチメートルの長さのセクションを洗浄し、自然乾燥させます。

はさみを使用して、止血剤を使用してチューブの各部分のPGAメッシュの1.1センチメートル×8センチメートルのセクションを切り取りますので、デクソン6.0縫合糸でチューブにPGAメッシュが3つの外科的結び目を結び、止血剤でシングルステッチで続くように、固定されたメッシュはPGA足場を作ります。足場を最初に1モルの水酸化ナトリウムに1〜2分間浸し、次に蒸留水に3回浸して2分間浸して洗います。洗濯の合間に軽くたたいて乾かし、3回目の洗濯後15分間フードで風乾させます。

乾いたら、メッシュの両端に1cmのダクロンカフスを3針縫い合わせます。チューブは2〜3ミリメートルのオーバーラップを残し、チューブに穴を開けないでください。このプロトコルで後で使用するために、約15センチメートルの自由な縫合糸を必ず残してください。

すべてのバイオリアクターコンポーネントとツールは、事前にオートクレーブ処理されます。バイオリアクターの培養を開始する前日に、バイオリアクターは部分的に組み立てられなければならない バイオリアクターの部品を足場に沈めるので、メッシュシリコンチューブ、手術器具、およびバイオリアクターの長さより長い細いワイヤーを70%エタノール浴で少なくとも30分間水中に沈めます。ワイヤーを使用して、リアクタのサイドアームを通してシリコンチューブを引っ張ります。

次に、バイオリアクターを出現させ、フレアガラスの唇にダクロンカフを固定して、PGAの足場を内部に取り付けます。余分な縫合糸を使用して、各袖口を結びます。次に、コネクタを使用して、1対のバイオリアクターアームで足場の片側にシリコンチューブを取り付け、足場の反対側のチューブを他の2つのアームに取り付けます。

コネクタが取り付けられたら、サイドアームから引き出し、バイオリアクターをエタノールで洗い流します。反応器を両側で10分間浸しておきます。バイオリアクターをいくつかのシャーレにセットし、組織培養で洗い流します。

水を等級分けします。ピペットを使用して、メッシュとチューブも洗い流してください。次に、将来の使用のために滅菌攪拌子をリアクターに置き、ブロワーをオンにし、この時点からUVオフにして、装置をフード内で一晩乾燥させます。

リアクターに寄りかかると汚染につながる可能性があるため、セットアップ中は、すべてのコネクタをアルコールできれいに拭く必要があります。アタッチメントを作成する前に、ジョイントの多くをパラフォームで補強し、適用する前に70%エタノールに浸す必要があります。だから、両方をたくさん持っています。

予防策として、各バイオリアクターの開口部に滅菌ペトリ皿を置き、内部のPGA足場を汚染物質から保護します。次に、バイオリアクターの3番目の未使用のアームに注入ポートを取り付けることからセットアップを開始します。次に、IVバッグをフローシステムに接続します。

セイウチチューブをセットした状態で、青い端をY字型ジャンクションのできるだけ近くで結び、チューブをクランプします。赤いチューブをIVバッグの遠端に取り付けます。次に、白いチューブをフローシステムの片側に取り付けます。

3ウェイストップコックをフローシステムに挿入します。圧力トランスデューサーチューブの一方の端をストップコックに取り付け、もう一方の端をIVバッグの中央の開口部に取り付けます。次に、フローシステムを部分的に充填し、漏れをチェックするために、350ミリリットルのPBSと1%の真菌ゾーンをIVバッグに追加します。

をフローシステムに接続する前または後に60ミリリットルのシリンジを使用して、ストップコックを調整してPBSの流れ方向を制御し、バッグを絞ってシステムを洗い流します。このステップは、セルの着座前または着座後に行うことができます。これで、細胞をバイオリアクターに装着することができます。

この例では、800 万個の SM 細胞 (これは 1.25 ミリリットルの培地に約 1 つのコンフルエント T 75) を懸濁させ、ダクロン接合からダクロン接合までの PGA 足場に均一に滴下します。細胞を追加した後、アルコールでバイオリアクターの縁をきれいに拭きます。原子炉の上をホバリングすることは避けてください。

次に、シリコンストッパーの蓋を丁寧に組み立てます。蓋をオートクレーブバッグから取り出すとき、または次の取り付け手順のいずれかで蓋の底を露出させないように注意してください。まず、オスコネクタの供給チューブに注入ポートを取り付けます。

次に、PTFE 0.20ミクロンフィルターを3つの空港のそれぞれに取り付けます。3番目のパラグラフ、注入ポートを撮影します。組み立てたシリコンストッパーの蓋をガラス製バイオリアクターに挿入します。

栄養チューブが装着されたPGA足場に触れないようにしてください。その後、パラフォームでシールします。次に、バイオリアクターをフローシステムに接続し、バイオリアクターとフローシステムを摂氏37度のインキュベーター内に配置します。

25〜30分間、原子炉を横向きにセットし、5分ごとに回転させる必要があります。次に、インキュベーター内に留まったまま、供給チューブを通したポンプを使用して、バイオリアクターチャンバーに400〜10個の培養培地を400ミリリットル充填します。次に、播種した足場を、摂氏37度で5%の二酸化炭素で6〜7日間、拍動性ポンピングなしでインキュベー

この間、ポンプをオンにする前に、チューブに漏れやねじれがないか検査する前に、媒体の交換やビタミンCの補給は必要ありません。次に、ポンプの速度を調整して、圧力範囲をマイナス30〜270ミリメートルの水銀柱に維持します。この圧力を文化全体を通じて毎日監視し、維持します。

アスコルビン酸の媒体交換と補給は、足場が拍動性ポンプで成長している間に週に2回行う必要があります。次に、供給チューブを二重方向ポンプにしっかりと配置し、一方の端をバイオリアクターの供給ポートに挿入し、もう一方の端を供給蓋に挿入します。次に、200ミリリットルのミディアムをゆっくりと汲み出し始めます。

徐々にポンプ速度を上げることができます。次に、新しい栄養チューブを取り付け、200ミリリットルの新鮮な培地をゆっくりとポンプで送り始めます。アスコルビン酸を反応器に加えるには、滅菌済みの30ミリリットルの注射器を使用して25ミリリットルの培地を取り除きます。

5ミリリットルの滅菌アスコルビン酸溶液を追加し、次に25ミリリットルを戻します。中程度に操作された容器は不透明に見え、8週間の培養後には約250ミクロンの壁の厚さに達します。拍動条件下では、人工血管のヘマット、トイン、およびエオシン染色は、時間および脈動による組織形態の変化を示します。

血管の管腔側は、L マッソンの tri CHRO 染色で示されます。コラーゲンショーの場合、4週間パルスの血管は非パルスの血管よりも多くのコラーゲンを持っています:白い矢印は、12週間までに血管に残っているPGAフラグメントを示しています。免疫化学解析では、初期平滑筋マーカーαアクチンの発現を示し、中間平滑筋マーカーcal poin oneと後期平滑筋マーカーのミオシン重鎖の発現をいったんマスターすれば、この技術は適切に行えば7〜8時間で行うことができます。

この手順を試行する際は、この手順に従って、すべてをできるだけきれいに、そして確実に実行することを覚えておくことが重要です。人工血管の内腔の改変などの他の方法を実行して、in vivo研究中の人工血管の維持における管腔表面改質の重要性などの追加の質問に答えることができます。その開発後。

この技術は、組織工学、特に血管工学の分野の研究者が、動物モデルで冠動脈疾患を治療する潜在的な手段を探求する道を開きました。このビデオを見た後、ダイナミックな郵便文化を通じて埋め込み型エンジニア血管移植を実現する方法について十分に理解できるはずです。水酸化ナトリウムでの作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは、目の保護具や白衣などの予防措置を常に使用する必要があることを忘れないでください。