Name: 拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ拍動バイオリアクターを用いた人工血管の工学生物学的製造法。PGAメッシュスカフォールドと平滑筋細胞を使用し、冠動脈疾患治療のための移植可能な小径血管グラフトの再生に向けた有望なアプローチを探索する。

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この作品は、健康グラントR01 EB - 008836とR01 HL083895（LENの両方）の国民の協会によって資金を供給される。我々は研究のためのバイオリアクターを作るためにダリルスミス、大学のガラス吹き工を、感謝することができます。

オートクレーブ図1及び図2に指示フローシステムとバイオリアクターの成分（バイオリアクター自体とシリコンストッパーの蓋）のためのチューブを組み立て、オートクレーブ。栄養チューブは、一端にオスコネクタと反対側の開放端を持っています。 3つのショートチューブセグメントはガス交換のためのシリコンキャップを通して挿入されています。 1。縫製PGAメッシュ<ol><li> 1.1センチメートルX〜8cmのシート（バイオリアクターのサイズに依存）にPGAメッシュを切る。 </li><li>蒸留水（・ Alarm_D）および使用する前に、乾いた空気ときれいなシリコンチューブ（3ミリメートル内径）。 </li><li>シングルステッチに続く3つの手術のノット​​で始まるクリーンなシリコンチューブの周りにPGAメッシュを縫うためにDexon 6.0縫合糸を使用してください。 </li></ol> 2。 PGA足場表面処理<ol><li> 1 - 2分、処理時間を記録し、すべてのPGA足場に同じ時間を使うための1MのNaOHのディップPGA足場。 </li><li> 2分間3回dH2O風呂でPGA足場をすすぐ。 </li><li>パットPGAはのdH 2 Oバスの各ディップの間にキムワイプで乾燥した足場。 </li><li>組織培養フードの下で乾燥したPGAは、足場上に送風機で15分間風乾する。 </li></ol> 3。ミシンダクロンアーム<ol><li> 2〜3ミリメートルのオーバーラップのPGAメッシュの各端にダクロンの袖口（1CM）の小片を縫うためにProlene 4.0の縫合糸を使用してください。注：ない穿刺のシリコンチューブ（図3）に注意してください。 </li><li>ダクロンの袖口の自由端3周ステッチを縫うために、同じ糸を使用してください。ステップ5.1のProlene縫合（図3）の自由端で十分な縫合糸を残していることを確認します。 </li></ol> 4。バイオリアクターのアセンブリ（バイオリアクターの培養開始前日） <ol><li>縫製メッシュとシリコンチューブ、手術器具、20〜30分間70％エタノール浴中の細い線を浸す。 </li><li>前の組み立てに少なくとも30分間70％エタノール浴中のバイオリアクターと浸し、それを含むオートクレーブ袋を開きます。エタノールで徹底的にバイオリアクターをフラッシュすることを確認してください。 70％エタノールへのすべてのバイオリアクターのコンポーネントの曝露は、加算の滅菌工程です。このステップでは、オートクレーブで除去されていないエンドトキシンを、削除して、血管細胞に有害です。 </li><li>それを介してプルに細いワイヤーを使用して、サイ​​ドのアームを介してシリコンチューブを引き出します。 </li><li> （エタノールに浸けメッシュを保つ）エタノール浴からバイオリアクターを取る。 Prolene縫合（図3）締めと上下連結して、フレアガラスの唇上のダクロンの袖口を締め込んで、バイオリアクター内のPGA足場を修正。 </li><li>シリコンチューブを介してコネクタにバイオリアクターのサイドアームの片側を接続します。 </li><li>十分なテンションでシリコンチューブの反対側を引っ張るとシリコンチューブに残りの二つのコネクタを挿入します。コネクタを挿入するときにしっかりとシリコンチューブにホールド！ </li><li>再び挿入のエタノール浴にバイオリアクターと静かにサイドアームのコネクタを引き抜き、エタノールで洗い流してください。 </li><li>バイオリアクターを裏返し、10分間浸すことができます。 </li><li>フリップバイオリアクターは、右サイドアップしてさらに10分間浸す。 </li><li>すべてのエタノールを排出します。 </li><li>チューブの端部から滴下過剰のエタノールを保持するために中央の皿の中でシリーズと場所バイオリアクターに3つの大きなペトリ皿を（10cm）に設定します。 </li><li> 5ミリリットルまたは10mlのピペットを用いて組織培養水をバイオリアクターとPGAメッシュをフラッシュします。シリコンチューブにもフラッシュの組織培養水。 </li><li>徹底的にバイオリアクターのいずれかの側にペトリ皿にすべての余分な水を抜く。 </li><li>上に送風機付きフードとUVのOFFで一晩乾燥したバイオリアクター。 </li><li>追加メモ：滅菌攪拌棒がバイオリアクターになっていることを確認。汚染を避けるために、前方にこの点から、バイオリアクターの上に"置く"にしないようにしてください。パラフィルムのストリップの多くをカットし、小70％エタノールのバス（大型のペトリ皿がうまくいく）でそれらを浸す。 </li></ol> 5。 1日目：バイオリアクターのセットアップ<ol><li>汚染物質からPGA足場の内側を保護するため、各バイオリアクターの開口部に滅菌ペトリ皿を置きます。 </li><li>図4およびパラフィルム、すべての接続の関節に示すようにバイオリアクターへのフローシステムを組み立てます。 <ol><li>アルコール綿で最初のコネクタを拭きます。 </li><li>バイオリアクターの第三の、未使用の腕に注入口を取り付けます。 </li><li>セイウチのチューブを外し、できるだけY -ジャンクショ​​ンの近くに設定された生理食塩水希釈の青い端を結紮する。チューブのこの部分には液体の転送のないことを確認するために設けられている、チューブクランプを引いて</li><li> IVの袋を取り外し、及びIVの袋の遠端にセイウチのチューブ（赤）を接続します。アルコールが最初にワイプで挿入口を拭くようにしてください。 </li><li>フローシステムの一方の側（白端チューブを介して）にセイウチを取り付けます。 </li><li>フローシステムに3方活栓を挿入します。 </li><li>圧力トランスデューサを取り外します＆三方活栓に接続します。 </li><li>袋の中央の開口部に圧力変換器のもう一方の端を取り付けます。 </li></ol></li><li>接続Y -ジャンクショ​​ンを経由して流れのシステムへのバイオリアクター。 IVの袋に1％fungizone（PBSの495ミリリットルとミックス5ミリリットルのfungizone）の350ミリリットルを追加するには、60ミリリットル注射器を使用してください。 </li><li> PBSの流れを可能にするためにストップコックを調整して流れるシステムをフラッシュするためにIVの袋を絞る。注：そこに漏れていることを確認しないためにバイオリアクターの中身をチェック。 </li><li>各PGA scafffold上に培地と種子の1.25ミリリットルで再懸8 × 10 6平滑筋細胞（約コンフルエントT75）。細胞懸濁液が均一にPGAメッシュの底面側にだけでなく、PGAメッシュダクロンのジャンクショ​​ン上に滴下されていることを確認します。 </li><li>アルコールは、バイオリアクターは、横向きにホバリングを避けるために回転を経由してワイプでバイオリアクターのリムを拭いてください。 </li><li>シリコンストッパーの蓋のアセンブリ（図2） <ol><li>オートクレーブ袋ピールバック慎重に、蓋の底部を露出しないようにして作る。 </li><li>オスコネクタで栄養チューブに注入口を取り付けます。 </li><li> three空気ポートのそれぞれにPTFE 0.20μmのフィルターを取り付けます。 </li><li>このプロセス中に公開する/蓋の底面に触れないように注意してください。 </li><li>パラフィルム注入口。 </li></ol></li><li>ガラスのバイオリアクターにシリコンストッパーの蓋を挿入し、バイオリアクター内の栄養チューブがシードPGAの足場に接触しないことを確認してください。蓋の周りパラフィルム。 </li><li>インキュベーター内部の流れのシステム（その側）とバイオリアクターを配置し、バイオリアクターの25〜30分が5分おきに回転させる。 </li><li>で説明されているように私たちの40から10培養培地の400ミリリットル（表1）とバイオリアクターチャンバーを埋める。この培地は、ブタ工学動脈のために"最適化"されています。 </li></ol> 6。日6-7：ポンプをオンにし、まず食べさせる<ol><li> 6-7日のためのシリコンチューブを介してポンピングどんな拍動することなく、静的に生成済の足場を拡大。この時間の間に培地交換やビタミンCの補充は必要ありません。 </li><li>ポンプの電源を入れる前にPBSまたはフローシステムのチューブのよじれの漏れがないことを確認してください。 </li><li>フローシステムのポンプの電源をオンにし、圧力が約270/-30mmHg読み取るようにポンプの設定を調整することを確認してください。 </li><li>レコード文化を通じて日々プレッシャーと270/-30mmHgの圧力を維持する。圧力トランスデューサーは、圧力を読んで、監視するコンピュータに接続することができます。 </li></ol>最初の給餌<ol start="5"><li>培地交換や培地廃棄物廃位両方の目的のために蓋を餌に注入ポート＆PTFEフィルターを組み立てます。 </li><li>ポンプにしっかりと栄養チューブを置き、餌蓋にバイオリアクターのポート、もう一方の端を供給する一方の端を差し込みます。エタノールのワイプで注入ポートを拭いていることを確認してください。 </li><li>培地の200ミリリットルを汲み出すために双方向のMasterflexポンプを使用してください。その後、バイオリアクターに戻って新鮮な培地の200ミリリットルをポンプするための新しい栄養チューブを使用してください。常にバイオリアクターに戻って培地をポンプ場合は特に、非常に遅い速度で始まります。 </li><li>培地とサプリメントのアスコルビン酸の2x/weekを変更します。アスコルビン酸を追加するには、培地の25ミリリットルを取り出し、組織のボンネットに置いて置くために30ミリリットル注射器を使用してください。 PBS 5mlのでアスコルビン酸の25mgを溶解し、0.22μmフィルターを通してそれをフィルタリングする。最初の栄養チューブに無菌のアスコルビン酸を注入し、それ以前の取り出し25ミリリットル培地を再度追加します。培地レシピを表1に示されている。 </li></ol> 7。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。フローシステムのアセンブリのためのチューブとコネクタを上に示します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。シリコンストッパーの蓋のアセンブリを上に示します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。バイオリアクターアセンブリの回路図は、上記示されています。バイオリアクターのダクロンの袖口が青縫合の結び目を持つガラスの腕に固定されている内側。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。チューブとバイオリアクターに接続されているフローシステムは、上記の通りです。L/S18チューブがMasterflexポンプで汲み上げ、したがって流れを駆動されます。圧力トランスデューサは、上流でのバイオリアクターに入る前に圧力を測定します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。収穫された人工血管の画像。エンジニア船舶が不透明であることが表示され、拍動性の条件下で8週間の培養後、約250μmの壁の厚さを実現します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。人工血管のヘマトキシリンおよびエオシン染色したクロスセクションでは、。とBはそれぞれ、容器の8週間の非パルスとパルスです。CとDは、4週間非パルスとパルスの船舶、それぞれです。 Lは、血管の内腔側を示している。スケールバーは100μmのです。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="図7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> 図7。人工血管の断面のためのコラーゲン（青）のためのマッソントリクローム染色。AとBはそれぞれ、8週間の非パルスとパルスの船舶です。 CとDは、4週間非パルスとパルスの船舶、それぞれです。 4週間のパルス船舶がその非パルスのものよりコラーゲンを示していることに注意してください。白い矢印は血管内の残りのPGAのフラグメントを指す。スケールバーは100μmのです。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="図8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図8"> 図8。ウシ人工動脈におけるSMCのマーカーの免疫染色。平滑筋α-アクチン、カルポニン- 1、および平滑筋ミオシン重鎖（SMMHC）はそれぞれ、、初期の中間、そして後半SMC収縮マーカーです。 12週間の文化の終わりまでに、容器内の細胞壁に発現するSMα-アクチンとカルポニン- 1とSMMHCの適量。スケールバーは20μmのです。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 量は </td></tr><tr><td> DMEM（DME /低に変更） </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td> FBS（ウシ胎児血清）熱不活性化</td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td> HEPES、1.0 M </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ビタミンC（PBSまたはDMEMに溶解） </td><td> 25mgの</td></tr><tr><td>プロリン/グリシン/アラニン25 mg/25 mg/10ミリグラム（PBS 5mlの溶解） </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>のCuSO 4は1.5μg（PBSのIN1 mlを溶解） </td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン10,000台で、G / mlの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> 10ng/mlでのPDGF - BB（血小板由来成長因子- BB） </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> 10ng/mlでのbFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子） </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> 表1。 "40〜10"培地の成分は、上記の表に示します。PDGF - BBとbFGFの例外を除き、他のすべてのコンポーネントは使用前に0.2μmのフィルターでろ過することです。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

人工血管の品質は、組織培養で使用されている平滑筋細胞の品質によって決まる大部分です。 SMC表現型の重要な側面は収縮形態、低継代数、およびバイオリアクターの内部に増殖する能力が含まれています。我々は、継代数がポリマー骨格に細胞播種の時にP3以下であることをお勧めします。また、SMCソースを使用する前にマイコプラズマフリーであることを確認することが重要です。我々はマイコプラズマで汚染された細胞はバイオリアクターの培養中の細胞増殖およびコラーゲンマトリックスの沈着を大幅に減少につながることを観察した。 40万人以上の冠動脈グラフトは小径（&lt;6mm）の人工血管12の需要が高い、その結果、毎年のバイパス操作のために必要です。究極の目標は、ネイティブ組織の生理的機能を模倣する機能小径血管を設計することです。私たちの拍動性のバイオリアクターシステムは、病気の動脈を復元し、置き換えることができる機能的な動脈グラフトを構成するための有望な平均値です。化学的および機械的に制御された環境では、バイオリアクターは、私たちは強力な縫合糸の保持と優れた機械的性質を示す埋め込み型...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/材料の名称</th><th>サプライヤー</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> FBS（ウシ胎児血清）熱不活化</td><td> HyClone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF -基本</td><td> R＆B </td><td> 234 - FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF - BB </td><td> R＆B </td><td> 520 - BB </td></tr><tr><td> Penicilin G </td><td>シグマ</td><td>ペンナ</td></tr><tr><td>硫酸銅（II） </td><td>シグマ</td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td>シグマ</td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L -アラニン</td><td>シグマ</td><td> A7469 - 25G </td></tr><tr><td> L -プロリン</td><td>シグマ</td><td> P5607 - 25G </td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td> A4544 - 25G </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H3375 - 100G </td></tr><tr><td>シリコンストッパー</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 06298〜24 </td></tr><tr><td> MasterflexチューブL / S </td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 06508〜16、06508〜18 </td></tr><tr><td> Masterflexポンプ</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 7553〜80 </td></tr><tr><td>ダクロンのカフ</td><td> MAQUET </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGAフェルト</td><td>コンコルディア</td><td> MO000877 - 01 </td></tr><tr><td> 4から0まで1.5メートルSurgipro II縫合</td><td> Syneture </td><td> VP - 557 - X </td></tr><tr><td> 6から0 0.7メトリックDexonの縫合</td><td> Syneture </td><td> 7538〜11 </td></tr><tr><td> 0.22μmのPTFEフィルター</td><td>ワットマン紙</td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td>スリーウェイストップコック</td><td>エドワーズライフサイエンス</td><td> 593WSC </td></tr><tr><td>圧力トランスデューサー</td><td>エドワーズライフサイエンス</td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IVバッグ</td><td>バクスター</td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td>生理食塩水希釈セット</td><td>矢印</td><td> W20030 </td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>サンゴバン</td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

多くの努力は、機能的な小径動脈バイパスを再生成する方法論を開発し、推進することに専念してきました。生理的環境では、両方の機械的および化学的刺激が動脈血管の1,2の適切な開発と機能性を維持することが義務付けられています。 私たちのグループによって開発されたバイオリアクター培養システムは、ネイティブの船のことを模倣する正確に制御された化学機械環境の中で血管の再生をサポートするように設計されています。私たちのバイオリアクターの組み立てとメンテナンスの手順はかなり簡単と3,4 -再現性の高いです。平滑筋細胞（平滑筋細胞）に準拠したシリコンチューブを介してスレッド化と、最大12週間までのために拍動性刺激の有無にかかわらず、バイオリアクターで培養されている管状のポリグリコール酸（PGA）のメッシュに播種されています。いくつかの前任者から私たちのバイオリアクターを区別する4つの主要な属性があります。 1）唯一のネイティブ血管の周囲の生化学をシミュレートする他の培養システムとは異なり、私たちのバイオリアクターは、また文化の容器に循環半径方向ひずみを適用することにより、生理的拍動性の環境を作成します。 2）複数の人工血管は、制御された化学物質の環境内のさまざまな機械的な条件の下で同時に培養することができる。 3）バイオリアクターは、簡単に動物の移植モデルのための人工血管の内腔側上に塗布される内皮細胞の単層（EC）が可能になります。 4）私たちのバイオリアクターは、異なる直径の大きさと文化エンジニアリング船舶は、特定の直径のサイズに合わせて個々のバイオリアクターを調整する手間が省けます、1mmから3mmまでであったができます。 私たちのバイオリアクターで培養した人工血管はある程度組織学的にネイティブの血管に似ている。血管壁の細胞は平滑筋ミオシン重鎖（SMMHC）3のような成熟したSMC収縮マーカーを発現する。コラーゲンはかなりの量の人工血管5の究極の機械的強度を担当する細胞外マトリックス内に堆積される。生化学分析はまた、人工血管のコラーゲン含有量は、ネイティブ動脈6と同等であることを示します。重要なのは、拍動性のバイオリアクターは、一貫して動物モデル3,7で成功した移植実験を許可する機械的性質を示す血管を再生成しています。さらに、このバイオリアクターは、さらに非線形光学顕微鏡（NLOM）8を使用して 、非侵襲的に、時間の経過とともにコラーゲンのリモデリングのリアルタイム評価と追跡を許可するように変更することができます。結論として、このバイオリアクターは、機能的な小口径人工血管の再生を制御する基本的なメカニズムを研究するための優れたプラットフォームとしてご利用ください。

当社グループは、植込み型小径人工血管を再生成する心臓血管系の生理的拍動性のストレスを模倣したバイオリアクター培養システムを開発しました。

機能的な小径動脈バイパスを再生させるための手法の開発と進展に、多大な努力が注がれてきました。生理学的な...

本手順の全体的な目的は、拍動型バイオリアクターシステムを用いて、生物学的根拠に基づいた血管グラフトを作製することです。これは、細胞が成長するための足場となるPGAメッシュから生分解性スキャフォールドを調製し、それらをバイオリアクターチャンバー内に組み込むことで達成されます。その後、スキャフォールドに平滑筋細胞を播種し、空気および給餌チューブのシールが付いた蓋でバイオリアクターチャンバーを密閉します。次に、バイオリアクターをフローシステムに接続し、バイオリアクター内の血管に拍動流を供給します。リアクター内で細胞が血管へと成長し、免疫化学的、生化学的、および機械的な試験に合格します。この技術は、動脈バイパス用の移植可能な小径血管グラフトを再生するための有望なアプローチであるため、冠動脈疾患の治療への応用が期待されます。この手法は血管工学への知見を提供できるだけでなく、周期的な生理学的負荷を受ける他の器官系にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は習得に苦労する可能性があります。スキルを完全に習得するには、多くの練習が必要です。私たちは、工学的構築物を再生させるために生理学的な機械的刺激を適用することの重要性に気づいたとき、初めてこのアプローチを考案しました。バイオリアクターの操作プロセスは工程が多く、詳細な実演を通じてのみ習得できるため、この手法を視覚的に示すことが極めて重要です。まず、蒸留水を用いて内径 3 mm のシリコンチューブを 30 cm の長さに切り出したセクションを洗浄し、自然乾燥させます。ハサミを使用して、チューブ1本につき1.1 cm × 8 cmのPGAメッシュを切り出します。止血鉗子を用いて、Dexon 6.0縫合糸でPGAメッシュをチューブに固定し、外科結紮を3回行い、続いて止血鉗子でシングルステッチを行います。これにより固定されたメッシュがPGAスキャフォールドとなります。まず、スキャフォールドを1 Mの水酸化ナトリウム溶液に1〜2分間浸し、次に蒸留水に2分間ずつ3回浸して洗浄します。洗浄の合間には軽く水分を拭き取り、3回目の洗浄後はフード内で15分間自然乾燥させます。乾燥後、メッシュの両端に1 cmのダクロンカフを3針で縫い付けます。チューブを2〜3 mm重ねて配置し、チューブに穴を開けないようにしてください。このプロトコルの後で使用するため、約15 cmの縫合糸をそのまま残しておいてください。すべてのバイオリアクターの構成部品およびツールは、事前にオートクレーブ滅菌します。バイオリアクターでの培養を開始する前日に、バイオリアクターの一部を組み立て、バイオリアクターの構成部品、スキャフォールド、メッシュ、シリコンチューブ、手術器具、およびバイオリアクターの全長より長い細いワイヤーを、70%エタノール液に少なくとも30分間浸漬させます。ワイヤーを使用して、シリコンチューブをリアクターのサイドアームに通します。次にバイオリアクターを取り出し、フレア状のガラス縁の上にダクロンカフを固定して、内部にPGAスキャフォールドを取り付けます。余った縫合糸を使用して、各カフを縛り付けて固定します。次に、コネクターを用いて、スキャフォールドの一方の側のシリコンチューブをバイオリアクターアームの1ペアに接続し、スキャフォールドのもう一方の側のチューブを残り2本のアームに接続します。コネクターを取り付けたら、サイドアームからそれらを引き抜き、バイオリアクター内をエタノールで洗浄します。リアクターを両側それぞれ10分間浸漬させます。バイオリアクターをペトリ皿の上に置き、組織培養液で洗浄します。水を流して洗浄します。ピペットを使用して、メッシュとチューブ内も確実に洗い流してください。次に、後で使用するために滅菌済みの撹拌子をリアクターに入れ、ここからブロワーをオンにし、UVランプをオフにした状態で、フード内で装置を一晩乾燥させます。コンタミネーションの原因となるため、リアクターの上に身を乗り出さないでください。セットアップ時には、すべてのコネクタをアルコールで拭いて洗浄する必要があります。接続を行う前に、多くの接合部をパラフィルムで補強します。パラフィルムは使用前に70% ethanolに浸しておく必要があるため、アルコールとパラフィルムを十分に用意してください。予防策として、バイオリアクター内部のPGAスキャフォールドを汚染から保護するため、各バイオリアクターの開口部に滅菌済みのペトリ皿を置いて準備します。次に、バイオリアクターの3番目の未使用アームに注入ポートを取り付け、セットアップを開始します。続いて、IVバッグをフローシステムに接続します。walrusチューブセットを用い、青色の端をY字接合部の可能な限り近くで結び、チューブをクランプします。赤色のチューブをIVバッグの反対端に取り付けます。次に、白色のチューブをフローシステムの片側に取り付けます。3方コックをフローシステムに挿入します。プレッシャートランスデューサーチューブの一端をストップコックに接続し、もう一端を点滴バッグの中央の開口部に接続します。次に、フローシステムを部分的に満たして漏れを確認するため、350 millilitersのPBSと1% fungi zoneを点滴バッグに加えます。フローシステムに接続する前または後に、60 mLのシリンジを使用して、ストップコックを調節してPBSの流れ方向を制御し、バッグを絞ってシステムをフラッシュします。この手順は、細胞の播種前または播種後のどちらでも行えます。これで、バイオリアクター内に細胞を播種することができます。この例では、1枚のコンフルエントなT 75フラスコ分に相当する約800万個のSM細胞を1.25 mLの培地で再懸濁し、ダクロン接合部からダクロン接合部まで、PGAスキャフォールド上に均一に滴下します。細胞を添加した後、バイオリアクターのリムをアルコールで拭いて清浄にします。リアクターの上に身を乗り出さないようにしてください。次に、シリコンストッパーのリッドを慎重に組み立てます。オートクレーブバッグから取り出す際や、それに続く取り付け手順の間、リッドの底部を露出させないように注意してください。まず、注入ポートをフィードチューブのオスコネクタに取り付けます。次に、3つのエアポートそれぞれにPTFE 0.20 micronフィルターを取り付けます。続いて、注入ポートをフィルムで密閉します。組み立てたシリコンストッパー蓋をガラスバイオリアクターに挿入します。給餌チューブが設置済みのPGAスキャフォールドに触れないようにしてください。その後、パラフィルムで密封します。次に、バイオリアクターをフローシステムに接続し、バイオリアクターとフローシステムを37 degrees Celsiusのインキュベーターに入れます。リアクターを横向きに置き、5分ごとに回転させる操作を25〜30分間行います。次に、インキュベーター内にある状態で、ポンプを用いてフィーディングチューブから4:10培養液400 millilitersをバイオリアクターチャンバーに充填します。その後、拍動ポンプを停止させた状態で、播種したスキャフォールドを37 °C、5% carbon dioxideの条件下で6〜7日間インキュベートします。ポンプを起動するまで、培地交換やビタミンCの補充を行う必要はありません。ポンプをオンにする前に、チューブに漏れや屈曲がないか確認してください。次に、ポンプの速度を調整し、圧力を-30から270 mmHgの範囲に維持します。培養期間中は、毎日この圧力を監視し、維持してください。培地の交換およびアスコルビン酸の添加は、脈動ポンプを用いて新鮮な培地を供給しながらスキャフォールドを成長させている間に、週2回行う必要があります。まず、培地の交換と廃液回収の両方の目的で、供給用リッドに注入ポートとPTFEフィルターを取り付けます。次に、供給チューブを双方向ポンプにしっかりと固定し、一方の端をバイオリアクターの供給ポートに、もう一方の端を供給用リッドに挿入します。その後、200 millilitersの培地をゆっくりとポンプで排出します。ポンプの速度を徐々に上げます。次に、新しい供給チューブを取り付け、200 millilitersの新鮮な培地をゆっくりとポンプで注入し始めます。リアクターにアスコルビン酸を添加するには、滅菌済みの30 milliliterシリンジを用いて、培地を25 milliliters分取り除きます。滅菌アスコルビン酸溶液を5 mL添加し、その後、25 mLの培地に戻します。作製された血管は、8週間の培養後に不透明に見え、壁厚は約250 µmになります。拍動条件下での作製血管のヘマトキシリン・エオシン染色により、組織形態が時間経過および拍動に伴って変化することが示されます。血管の内腔側はLで示されており、マッソン・トリクローム染色（masson's tri CHRO stain）が施されています。コラーゲンについては、4週間のパルス負荷を与えた血管は、非パルス負荷の対照群よりもコラーゲンが多いことが示されています。白い矢印は、12週時点での血管内に残存しているPGA断片を指しています。免疫化学的分析により、早期平滑筋マーカーであるalpha actin、中間平滑筋マーカーであるcal poin one、および後期平滑筋マーカーであるmyosin heavy chainの発現が示されています。この手法を習得すれば、適切に実施することで7〜8時間で完了させることができます。本手順を実施する際は、本プロトコルに従い、あらゆる操作を可能な限り清潔かつ無菌的に行うことが重要です。また、in vivo研究における構築血管の維持における管腔表面修飾の重要性など、さらなる疑問を解消するために、構築血管の管腔の修飾といった他の手法を、開発後に行うことができます。この手法は、組織工学、特に血管工学の分野の研究者が、動物モデルにおける冠動脈疾患の潜在的な治療手段を探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、動的後培養を通じて移植可能な人工血管グラフトを実現する方法について、十分な理解を得ることができるはずです。水酸化ナトリウムを取り扱う際は危険が伴うため、本手順の実施中は常に保護メガネや白衣などの予防策を講じてください。

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