マウス胚性幹細胞からの神経組織エンジニアリングのためのポリエレクトロ繊維状足場（グリセロール - ドデカン）

この手順では、ポリグリセロールDote Cano eightという名前の新しい生分解性ポリマーからElectros紡績長繊維を製造します。まず、新しく設計されたコレクターをセットアップし、シリンジとポンプを使用して電気紡糸用のポリマー溶液を準備し、溶液をコレクターに供給します。次に、得られた繊維マットを架橋のために培養皿に移します。

次に、切断された繊維にマウス胚性幹細胞を播種します。最終的に、結果は、マウス胚性幹細胞が生き残り、線維足場の上で神経細胞に分化できることを実証できます。今日のビデオでは、syn細胞の製造から生体材料を調製し、最終的にそれらのエレクトロスパンファイバーを細胞培養に使用する方法を紹介しました。

特に、ポリ細胞や染色細胞に由来する細胞と結合する場合。それらは、細胞送達および機能組織を作るために、将来非常に重要なアプリケーションを持つ可能性があります。ティッシュインビス今日、彼女はあなたのために恐ろしい手順を示します。

彼女は私の研究室で最も素晴らしい存在です。アルミホイルを長方形にカットします。長方形のピースを長方形のストリップに折り、テープで平らな金属板に垂直に取り付けます。

ストリップの長さは、ポリマー溶液に必要な繊維マットのサイズによって異なります。グリセロールを混合し、デカンジ酸を摂氏120度で1対1モル比で100時間投与します。ポリグリセロールを得るためには、デカンポリマーは、15ミリリットルのチューブ内で1.5から3から95.5の重量比で65%エタノールにポリエチレンオキシドとゼラチンを溶解します。

キャップを締め、混合物を摂氏60度のオーブンで1時間加熱し、基礎溶液が均一になるまで15分ごとに攪拌します。エレクトロスピニングの場合は、PGDポリマーと基礎溶液を混合します。4〜6重量比で、0.1%のリボフラビンを混合物に加え、よく混ぜます。

ポリマー溶液を5ミリリットルの標準シリンジに18ゲージの鈍いステンレス鋼針で供給します。次に、シリンジをシリンジポンプに挿入します。高電圧電源の接地リード線を金属板に取り付け、プラスに帯電したリード線を針に取り付けます。

また、針とアルミホイルの距離を調整してください。15センチメートルまでストリップします。次に、シリンジポンプを水平と約15度の角度で配置して、ストリップの前面で繊維が凝集するのを防ぎます。

シリンジポンプをオンにし、ポンプの流量を毎時0.6ミリリットルに調整します。高容量の電源を入れますtage電源と動作ボリュームを設定しますtageは14.6キロボルトに。収集が完了したら、ファイバーマットをUVライトにさらして60分間架橋します。

ファイバーマットをアルミホイルストリップから100ミリメートルのシャーレに移します。ファイバーマットをサージカルブレードと同じサイズの丸い部分にカットし、24ウェルプレートに入れます。次に、プレートをUV光にさらし、さらに20分間の滅菌を行い、細胞を治療します。

繊維サンプルを1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に浸し、翌日に摂氏37度で一晩インキュベートします。PBSを慎重に吸引します。各ウェルに1ミリリットルの分化培地を加え、摂氏37度で3時間インキュベートします。

分化培地を吸引した後、各繊維サンプルに0.2ミリリットルのマトリゲルを慎重に加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。それぞれから余分なマトリゲルを慎重に取り除きます。2ミリリットルの分化培地で一度よくすすいでください。

10分後、摂氏37度でマウス胚性幹細胞培養皿に1ミリリットルのターゼを追加します。MES細胞が分離したら、4ミリリットルの分化培地を追加します。浮遊するMES細胞を400Gの15ミリリットルチューブ遠心分離機に5分間集めます。

ペレット化された細胞を4ミリリットルの分化に懸濁します。中程度。200マイクロリットルの細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、10容量の分化を加えます。中程度。希釈した細胞懸濁液15マイクロリットルをヘモサイトメーターのチャンバーに移します。

カバースリップを所定の位置に置き、ヘモサイトメーターの中央の1ミリメートルの正方形と4つの角の正方形の細胞をカウントします。次に、5 倍 10 を 4 回目に落とします。マウスES細胞をゆっくりとファイバーサンプルの中央に付着させます。

各ウェルに1ミリリットルの分化培地を加え、細胞接着のために摂氏37度と二酸化炭素5%で培養します。成長と差別化。1ミリリットルの分化培地を1日おきに補充してください。

細胞生存率を測定するには、各ウェルから古い培地を吸引し、10分の1希釈試薬および蛍光試薬を培養中に1ミリリットル加えます。培地は、直射日光から保護され、摂氏37度と二酸化炭素5%で4時間インキュベートします。次に、各ウェルから100マイクロリットルの3倍のサンプルを96ウェルプレートに移し、蛍光走査型電子顕微鏡画像を使用して、エレクトロスピンファイバーの形態を評価しました。

40%PGD濃度から作られたこれらの繊維の直径は、ここではマイクロメートルの範囲です。分化したマウス胚性幹細胞をファイバー上で3日間培養し、共焦点顕微鏡を用いて過剰に発現した緑色蛍光タンパク質を可視化しました。6日目に緑色蛍光細胞の数が増加したことは、ファイバースキャフォールドが細胞接着と細胞増殖の両方をサポートできることを示しています。

Zuと蛍光の測定により、マトリゲルとラミニンでコーティングすると、同等の細胞生存率と比較的高い増殖が得られることが示されました。フルーリーの効力と神経細胞マーカーは、初日にリアルタイムPCRによって定量されました。ファイバー上で培養したMES細胞の大部分は、多能性マーカーを発現していました。

OCTはnano、SOXは2です。マイナーサブセットは、神経幹細胞マーカーPAC6とnestonを発現しました。培養で2週間後、MAP 2やDCX、オリゴデンドロサイトマーカーのオリゴ1、アストロサイトマーカーなど、一部の神経細胞マーカーの発現レベルが上昇しました。

GFAPをマスターしたら。この手法は、適切に実行すれば2〜3時間で実行できます。