低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

6,000万人以上が、エイズの原因となるウイルスであるHIVに感染しています。HIVエイズは世界的な健康危機であり、集中的な研究努力により感染者の生活が劇的に増加しているにもかかわらず、真のワクチンは依然としてとらえどころのないままです。HIVワクチン研究の主な焦点は、HIVが標的細胞に侵入するために使用するエンベロープ糖タンパク質です。

このビデオでは、クライオ電子線トモグラフィーと呼ばれるイメージング技術を使用して、この重要なタンパク質の構造を取得する方法を示します。精製HIVから始めて、凍結標本の準備のステップ、これらの凍結標本からの電子顕微鏡画像を記録するステップ、およびこれらの画像をHIVエイズワクチンの設計に役立つ可能性のある構造モデルに変換するステップを示します。このビデオで紹介するユニークな点は、中高生から大学生、大学院生、ポスドク、シニアサイエンティストまで、幅広い年齢層の研究室のメンバーによって研究がデモンストレーション

クライオ電子線トモグラフィーに適したガラス化ウイルス試料の調製は、銅格子で支持された炭素膜の小さな穴にウイルスの水性懸濁液を広げ、ウイルスを急速に凍結することによって達成されます。このステップの目標は、ほぼ天然の状態で捕捉された無傷のウイルスの凍結標本を調製することです。まず、グリッドはグロー放電ユニット内に配置されます。

この装置は、グリッドをイオン化ガスにさらすことにより、グリッドを清掃します。グリッドを使用する準備ができたので、小さな金粒子と混合されたウイルスの懸濁液が準備されます。これらの粒子は、データの収集と処理に不可欠です。

次に、ウイルス懸濁液の滴を、新たにプラズマ洗浄したグリッドに置きます。次に、グリッドをロボットにロードし、ロボットがフィルターペーパーで拭き取り、液滴を液体の薄い膜に減らします。次に、サンプルを液体エタンに注入し、毎秒100,000ケルビンを超える速度でウイルスを急速に凍結します。

プランジ凍結グリッドは、顕微鏡に輸送するために保管ボックスに移されます。これは、必要な数のグリッドがフリーズされるまで繰り返されます。ウイルスサンプルグリッドの準備ができたので、次のステップはそれらを顕微鏡にロードすることです。

イメージングの場合、これは手動またはロボットの支援を使用して行うことができます。サンプルグリッドを手動でロードすると、ユーザーは専用のステーションに座り、液体窒素下でサンプルを操作し、サンプルを携帯型窒素冷却チャンバーに入れ、密閉して排気し、顕微鏡に取り付けます。新しい顕微鏡は、より自動化されたサンプルローディングが可能です。

Titan Cryos顕微鏡では、凍結したサンプルがユーザーによって顕微鏡に送られ、顕微鏡にロードされたサンプルグリッドとともにロボットでロードされます。各グリッドは、イメージングを開始する前にユーザーが調べることができます。顕微鏡のパラメータは、サンプルグリッド上の関心のある特徴を持つ領域ごとに設定されます。

この場合、特徴はHIVウイルスです。新しい領域が定義されるたびに、顕微鏡コンピュータは領域固有のイメージングパラメータを保存します。ユーザーが関心のあるすべての位置を定義すると、コンピュータは自動的に各位置を再訪し、データセットを収集します。

各データセットは、ビームがグリッド上の同じ場所に集中し続けるようにしながら、電子ビームに対してサンプルグリッドを傾けることによって収集されます。従来、電子顕微鏡でのデータ収集では、ユーザーは顕微鏡の前に座り、機器と物理的に対話する必要がありました。このスタイルの顕微鏡インタラクションは、オバマ大統領が情報工場を訪問した際に示されています。

近年の顕微鏡コンピュータインターフェースの進歩により、ユーザーは研究室やその他の場所にあるリモートコンピュータからリアルタイムでデータ収集を監視および調整できるようになりました。エンベロープの形状を視覚化するためには、糖タンパク質のスパイク シグナルをブーストするために、何百もの個々の画像からの情報を平均化する必要があります。これは計算負荷の高いプロセスであり、ここでは Bio Wolf と呼ばれるコンピューターのクラスターを使用して実現されます。

NIHに位置し、個々のボリュームを抽出し、高ノイズレベルで機能できるアルゴリズムを使用して情報を平均化するための強力な方法が開発されました。この種のデータには、天然ウイルスと生物学的に重要な分子に複合体を持つウイルスの両方から得られた密度マップが、HIVの構造生物学に関する情報の豊富なデータベースを提供します。密度マップは、データをエンベロープ糖タンパク質スパイクを構成する個々のサブユニットのX線結晶構造解析からの情報と組み合わせると、分子の詳細で生き生きとしたものになります。

これらのトモから得られるデータは非常に密度が高く、interpret. 3Dするのが難しい場合があります。エンターテインメント業界向けのソフトウェアを使用して、色、テクスチャ、照明を追加することで3Dモデルを視覚化し、分析を容易にします。一般的に使用される視覚化ソフトウェアには、Mirror、3D Studio Max、Mayaなどがあります。

私たちは、エンベロープの構造の分子モデルを取得する方法について、段階的な手順を示しました。精製されたHIVから始まる糖タンパク質。この手法を用いて、エンベロープ糖タンパク質がウイルスに結合して利用できる様々な分子と複合体を形成した構造も決定しました。

ここでは、B12という抗体と複合体を形成したエンベロープ糖タンパク質の構造の一例を示します。一部の分子がウイルスに結合して利用できるのに対し、他の分子は結合できない理由を理解することは、合理的なワクチン設計にとって非常に重要です。HIVやインフルエンザ、エボラ出血熱などの他のウイルスに由来するエンベロープ糖タンパク質の分子構造を決定することは、ウイルスの侵入と利用を理解するための鍵となります。

ご覧のとおり、クライオ電子線トモグラフィーは、この目標を達成するための強力なツールとして浮上しています。