Liquid Marble Microbioreactor System:ブタ卵母細胞のカプセル化のための3D培養プロトコール

培養皿にフッ素化エチレンプロピレン(FEP)粉末のベッドを準備します。卵丘-卵母細胞複合体(COC)を含む成熟培地をFEP粉末に一滴加えます。粉末の上に一滴をそっと転がして、液体のビー玉 (LM) を形成します。FEP 粉末は疎水性多孔質シェルを形成し、内部液体と周囲環境との間のガス交換を可能にします。

次に、LMユニットを収集し、体外受精ペトリ皿の中央ウェルに移します。COCの水分を保つために、外輪に滅菌水を追加します。次に、LMを生理学的条件下でインキュベートして、卵母細胞の成熟を可能にします。

次に、使用済み培地を取り出し、新鮮な熟成培地を加えます。液体に直接接触すると、疎水性のFEPシェルが破壊され、LMが破壊されてCOCが放出されます。放出されたCOCを、新鮮な熟成培地の滴を含む新しい皿に移し、それらを洗浄してFEP粒子を除去します。

洗浄後、COCと新鮮な培地をFEPパウダーベッドに移します。ドロップを転がしてパウダーでコーティングします。最後に、LMを体外受精ペトリ皿に移します。FEP粉体塗装LMは、卵母細胞の3D構造を維持し、生存率を高めます。

30ミリメートルのペトリ皿に5グラムのFEP粉末のベッドを作ります。3〜5個のCOCを含む成熟培地の1滴をFEP粉末に分配します。プレートを円を描くようにゆっくりと回転させ、粒子が液滴の表面を完全に覆い、液体ビー玉または LM を形成するようにします。

60ミリメートルの体外受精ペトリ皿をいくつか準備し、外輪に3〜4ミリリットルの滅菌水を加えて湿度チャンバーを作成します。形成されたLMを1,000マイクロリットルのピペットで持ち上げ、中央のウェルに入れます。ビー玉を摂氏38度で5%二酸化炭素のインキュベーターで4日間インキュベートします。

培地を変更するには、各LMに30マイクロリットルの熟成培地を塗布し、LMを広げます。大理石の内容物が溶解したら、バイオリアクターから放出されたCOCをペトリ皿内の新鮮な熟成培地の一滴に移します。熟成培地で3〜4回洗浄した後、COCを30マイクロリットルの新鮮な培地とともにFEP粉末床に移します。

プレートを円を描くようにゆっくりと回転させ、粉末粒子が液滴の表面を完全に覆い、新しいLMを形成するようにします。次に、LMを体外受精ペトリ皿に移します。