微小管ダイナミクスのラベルフリー可視化のための干渉反射顕微鏡法

干渉反射顕微鏡は、動的に成長および収縮する微小管のイメージングを可能にします。

1つのカバーガラスにパラフィンストリップを固定し、その上に少し小さいカバーガラスを置きます。加熱してパラフィンを溶かし、密閉されたチャネルを形成します。チャネルを通して抗体含有溶液をピペットで移動させます。抗体はカバーガラス表面に付着します。ブロッキング溶液を加えて、抗体非結合領域をブロックし、非特異的タンパク質結合を防ぎます。

カバーガラスを顕微鏡ステージに置きます。サンプルヒーターを微小管の成長を促進する温度に設定します。

非加水分解性グアノシン三りん酸,GTP類似体で安定化したピペット微小管シード種子は抗体でコーティングされたカバーガラスに結合します。非標識チューブリン、GTP、および還元剤を含むバッファーを追加します。

最適な温度と緩衝液条件では、シードは核形成部位として機能し、標識されていないチューブリン結合と微小管の成長を可能にします。

イメージングを開始します。入射光は、開口部ダイヤフラムを介してビームスプリッターに焦点を合わせ、光を部分的に対物レンズに反射し、サンプルを照らします。カバーガラスのガラス緩衝界面は、入射光を部分的に反射します。残りの入射光は通過し、バッファーと微小管の界面で反射されます。

微小管とカバーガラスの距離に基づいて、2つの界面からの反射ビームが干渉し、建設的干渉(ビームが結合して明るい信号を生成するか、破壊的干渉)が生成され、ビームがキャンセルされて暗い信号が生成されます。

微小管をハイコントラスト画像として視覚化します。タイムラプス画像をキャプチャし、微小管の成長と収縮を検出します。

まず、適切なフィルターキューブを使用して、蛍光顕微鏡のフィルターホイールに50/50ミラーを挿入します。ミラーには反射防止コーティングが施されていることが多いため、取り扱いには注意してください。開口数も高い高倍率対物レンズに目を向けてください。ここに示されているのは、開口数が1.3の100倍のオイル対物レンズです。

次に、カミソリの刃と顕微鏡のスライドを直定規として使用して、幅3ミリメートルのプラスチックパラフィンフィルムのストリップを切断します。プラスチックパラフィンフィルムストリップを3ミリメートル離して22枚を22 x 22ミリメートルのきれいなカバーガラスの上に置きます。次に、ストリップの上に 18 x 18 ミリメートルのカバーガラスを置き、チャネルを形成します。

カバーガラスを摂氏100度のヒートブロックに10〜30秒間移し、パラフィンフィルムが密閉チャネルを形成します。ピペットを使用して、灌流によって抗ローダミン抗体を1ミリリットルあたり50マイクログラム流し、スライドを10分間インキュベートします。

インキュベーション後、ろ過したBRB80を