微小管ダイナミクスのラベルフリー可視化のための干渉反射顕微鏡法

干渉反射顕微鏡は、動的に成長および収縮する微小管のイメージングを可能にします。

1つのカバーガラスにパラフィンストリップを固定し、その上に少し小さいカバーガラスを置きます。加熱してパラフィンを溶かし、密閉されたチャネルを形成します。チャネルを通して抗体含有溶液をピペットで移動させます。抗体はカバーガラス表面に付着します。ブロッキング溶液を加えて、抗体非結合領域をブロックし、非特異的タンパク質結合を防ぎます。

カバーガラスを顕微鏡ステージに置きます。サンプルヒーターを微小管の成長を促進する温度に設定します。

非加水分解性グアノシン三りん酸,GTP類似体で安定化したピペット微小管シード種子は抗体でコーティングされたカバーガラスに結合します。非標識チューブリン、GTP、および還元剤を含むバッファーを追加します。

最適な温度と緩衝液条件では、シードは核形成部位として機能し、標識されていないチューブリン結合と微小管の成長を可能にします。

イメージングを開始します。入射光は、開口部ダイヤフラムを介してビームスプリッターに焦点を合わせ、光を部分的に対物レンズに反射し、サンプルを照らします。カバーガラスのガラス緩衝界面は、入射光を部分的に反射します。残りの入射光は通過し、バッファーと微小管の界面で反射されます。

微小管とカバーガラスの距離に基づいて、2つの界面からの反射ビームが干渉し、建設的干渉(ビームが結合して明るい信号を生成するか、破壊的干渉)が生成され、ビームがキャンセルされて暗い信号が生成されます。

微小管をハイコントラスト画像として視覚化します。タイムラプス画像をキャプチャし、微小管の成長と収縮を検出します。

まず、適切なフィルターキューブを使用して、蛍光顕微鏡のフィルターホイールに50/50ミラーを挿入します。ミラーには反射防止コーティングが施されていることが多いため、取り扱いには注意してください。開口数も高い高倍率対物レンズに目を向けてください。ここに示されているのは、開口数が1.3の100倍のオイル対物レンズです。

次に、カミソリの刃と顕微鏡のスライドを直定規として使用して、幅3ミリメートルのプラスチックパラフィンフィルムのストリップを切断します。プラスチックパラフィンフィルムストリップを3ミリメートル離して22枚を22 x 22ミリメートルのきれいなカバーガラスの上に置きます。次に、ストリップの上に 18 x 18 ミリメートルのカバーガラスを置き、チャネルを形成します。

カバーガラスを摂氏100度のヒートブロックに10〜30秒間移し、パラフィンフィルムが密閉チャネルを形成します。ピペットを使用して、灌流によって抗ローダミン抗体を1ミリリットルあたり50マイクログラム流し、スライドを10分間インキュベートします。

インキュベーション後、ろ過したBRB80を使用してチャネルを5回洗浄します。次に、ろ過したBRB80に1%ポロキサマー407を流して表面を非特異的結合に対してブロックし、スライドを10分間インキュベートします。もう一度、ろ過されたBRB80を使用してチャネルを5回洗浄します。

サンプルの乾燥を防ぐために、フィルター処理されたBRB80の液滴をチャネルの端に2滴追加し、必要に応じてバッファーを追加します。サンプルを顕微鏡ステージに置き、落射照明光源をオンにします。パラフィンフィルムの端に焦点を合わせてサンプル表面を見つけ、フィールドを移動してビューをチャンバーの中心に設定します。光路内の光学系からの光の逆反射により、対物レンズが上下に動くと、複数の表面が観察されます。

次に、フィールド ダイヤフラムを半分閉じて調整ネジを使用して、視野の中央にダイヤフラムを中央に配置します。ダイヤフラムが適切に位置合わせされたら、再度開きます。次に、ベルトランレンズをスライドさせて、対物レンズの射出瞳とも呼ばれる背面焦点面を表示します。

絞りを射出瞳の端を超えて閉じ、調整ネジを使用して絞り絞りを射出瞳に対して中央に配置します。絞りを開けて、その端を射出瞳の端と一致させて、再確認してください。次に、絞りを対物レンズの開口数の約2/3に設定します。

脳チューブリンを使用して微小管のダイナミクスを画像化するには、まずサンプルヒーターの温度を摂氏37度に設定します。ピペットを使用して、10マイクロリットルのGMPCPP安定化微小管シードを流し込み、表面をライブイメージングして表面への結合を監視します。10〜20個のシードが視野内に結合したら、予熱およびろ過されたBRB80の2倍のチャネル容量を使用してサンプルを洗浄します。

次に、10マイクロリットルの重合混合物を流します。

微小管の成長を測定するには、取得ソフトウェアを使用してタイムラプスを設定し、5秒ごとに15分間画像を取得します。各時点で平均10の画像を取得することで、コントラストを高めます。前のセクションで示したように、背景画像を取得します。[画像] に移動し、[スタック]、[Z プロジェクト]、[中央値] の順に選択して、中央値を計算します。対応する背景を減算するには、[プロセス] に移動し、[画像計算機] に移動し、ドロップダウン メニューから [減算] を選択します。32ビット浮動小数点数の結果オプションがオンになっていることを確認します。

微小管の収縮については、時間遅延をゼロにし、露光時間を10ミリ秒に保つことで、100フレーム/秒で画像を取得します。