Name: 動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 学ぶ 干渉反射顕微鏡と全内部反射蛍光顕微鏡を組み合わせた同時イメージング法により、ラベルフリーの微小管と蛍光標識タンパク質を高フレームレートで可視化する手法。このプロトコルは細胞動態研究に有用です。

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クリーンルーム機器を共有してくれたティエリー・エモネの研究室に感謝します。我々は、この研究で使用された精製eGFP−キネシンを調製したYin-Wei Kuoに感謝する。Y.T.は、フョードル・ライネン研究フェローシップを通じてアレクサンダー・フォン・フンボルト財団の支援を認めています。この作業はNIH Grant R01 GM139337(J.H.に)によって支援された。

1. フローチャンバーの準備
注:マイクロ流体フローチャンバは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロチャネルを洗浄および機能化されたカバーガラスに接着することによって構築されます。マイクロチャンネルはマスターモールドに鋳造されます。
<ol><li>
PDMSチャネルの準備
	<ol>
<li>洗浄および/または官能化されたカバーガラスを、画像化される特定のアッセイに適した表面化学で準備します。 注:キネシン運動性アッセイには、ピラニア洗浄シラン処理カバーガラスが使用されます。これらは、Gell et に記載されているように調製されます。al.1 あるいは、より簡単な手順は、カバーガラスをイソプロパノールで超音波処理し、続いてメタノールを3x 20分サイクルで超音波処理することです。</li>
		<li>マスターモールドを作製するには、片面固定テープのストリップを所望の流路サイズに切断する。ストリップを10cmのペトリ皿の底に接着し、ストリップ間に少なくとも1cmの間隔を空けて左右に配置する。 注:正確なチャネル寸法が必要な場合は、フォトリソグラフィー14を使用してシリコンウェーハ上にモールドを作製することができる。</li>
		<li>PDMSポリマーを調製するために、硬化剤とベースエラストマーとを1:10の質量比で組み合わせる。2分間混ぜる。 注:この混合比は、ポリマーの剛性を調整するために変更することができます。硬化剤に対する主剤の比率が高いほど、ポリマーが柔らかくなります。</li>
		<li>すべての気泡が消えるまで真空チャンバ内の混合物を脱気する。</li>
		<li>混合物を厚さ約0.5cmの層でマスターモールドに注ぎ、気泡が発生しないように注意してください。</li>
		<li>混合物を70°Cの予熱したオーブンで40分間焼成する。 メモ: PDMS ブロックの厚さが厚い場合は、硬化時間が長くなることがあります (>1 cm)。完全に硬化するまで5分刻みで加熱を続けます。</li>
		<li>ポリマーの構造領域を切り出す。PDMSパンチャーを使用してチャネルの両端にパンチ穴を開ける。 メモ: このプロトコルでは、穴の直径は 0.75 mm に設定され、必要な流量に応じて調整できます。PDMSチャネルは、乾燥した環境に長期間保管することができますが、使用前に清掃する必要があります。</li>
		<li>PDMS ブロックの構造化された側をクリーニングします。固定テープを使用して大きな粒子を除去します。イソプロパノールで洗い流し、次にメタノールですすいでください。これらのすすぎを3回繰り返し、超純水ですすぎ、表面をブロードライします。</li>
		<li>プラズマは、酸素または空気プラズマを使用してPDMSを洗浄します。 メモ: このプロトコルでは、18 W エアプラズマが使用されます。</li>
		<li>プラズマ洗浄したPDMSを、適切に洗浄したカバーガラスの上に置き、80°Cのホットプレート上で15分間加熱する。 メモ:エポキシ樹脂をPDMSブロックの側面に適用して、カバーガラスに接着することができます。</li>
		<li>適切なサイズの低密度ポリエチレン(LDPE)チューブを穴に挿入します。アウトレットチューブを0.5 mLシリンジに接続します。 メモ: このプロトコルでは、内径 0.023 インチのチューブは、外径 0.025 インチの金属アダプターを介して PDMS に接続されます。</li>
		<li>入口チューブを溶液に浸し、シリンジで必要な体積を描画することによって、溶液をマイクロチャネルに流す。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 光学セットアップ
<ol><li>
顕微鏡の変形例(図1)
	<ol>
<li>TIRF 顕微鏡を変更して、IRM イメージング13 を有効にします。顕微鏡のフィルターホイールに使用されている50/50(反射率(R)/透過(T))ビームスプリッタを10/90(R/T)ビームスプリッタに置き換えます。</li>
		<li>カメラと顕微鏡の間に画像スプリッターを挿入します。</li>
		<li>画像スプリッタのフィルタキューブに、10/90(R/T)ビームスプリッタを挿入します。反射ビームの前に600nmのロングパスフィルタを配置し、透過ビームの前に適切な蛍光発光フィルタを配置する。 メモ: 異なる R/T 比のビームスプリッタを使用して、収集される IRM および TIRF 発光光の分数を調整できます。</li>
		<li>製造元の仕様に従ってイメージスプリッタを合わせて、カメラチップ上のTIRF信号とIRM信号を空間的に分離します。 注: 一般的な蛍光色素分子の TIRF シグナルは微小管の IRM シグナルよりもはるかに弱く、2 つのシグナルがオーバーレイされている場合は検出できないため、シグナルの空間的分離が必要です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 動的微小管と単一キネシン分子のイメージング
<ol><li>表面機能化とパッシベーション
	<ol>
<li>BRB80緩衝液(80 mM Na-PIPES、1 mM EGTA、1 mM MgCl2、NaOHでpH 7.8に滴定)を反応チャンバに流す。</li>
		<li>BRB80で0.025mg/mLに希釈した抗生物質溶液を流し、室温で10分間インキュベートする。</li>
		<li>BRB80でチャンネルを洗ってください。</li>
		<li>F-127溶液(BRB80に一晩溶解した1%プルロニックF-127(w/v))を流し、表面不動態化のために少なくとも20分間インキュベートする。 メモ: シラン処理されたカバーガラスの代わりに清掃が容易なカバーガラスを使用する場合は、BRB80 に 2 mg/mL のカゼインを使用して室温で >20 分間不動態化してください。</li>
		<li>BRB80でチャンネルを洗ってください。</li>
	</ol></li>
	<li>イメージングの準備
	<ol>
<li>温度制御が必要な場合は、対物ヒーターを使用して正しい温度に設定してください。 注:このプロトコルでは、すべての実験は28°Cで行われます。</li>
		<li>サンプルを顕微鏡ステージに置き、IRMイメージング用の落射光源(>600nm)をオンにします。 メモ: このプロトコルでは、白色 LED 光源を 600 nm ロングパスフィルタとともに使用します。</li>
		<li>顕微鏡を試料表面に焦点を合わせます。PDMS ソリューション インターフェイスの近くで正しいフォーカル プレーンを探します。 注: IRM では、チャネルの水性内部は PDMS ポリマーよりもはるかに明るく見えるはずです。</li>
		<li>チャネルの中心付近の視野を選択します。</li>
		<li>BRB80中の蛍光マイクロビーズ0.1 μmの溶液を調製する(密度:109ビーズ/mL、このプロトコルで使用されるビーズの200倍希釈に相当)。</li>
		<li>マイクロビーズ溶液の少なくとも1つの流路体積に流れる。</li>
		<li>IRM を介して反応を監視します。マイクロビーズが徐々に表面に「着地」するのを待ちます。マイクロビーズの所望の密度が達成されたら、過剰分をBRB80で洗い流す。</li>
	</ol></li>
	<li>ビオチン化グアニリル5'-α,β-メチレンジホスホネート(GMPCPP)安定化微小管種子の増殖
	<ol>
<li>0.6 mL 遠沈管で、BRB80 で 1 mM GMPCPP、1 mM MgCl 2、および2 μM ビオチン化チューブリン (5 ~ 10% 標識化学量論) を含む溶液 50 μL を調製します。 注:正しい標識化学量論は、高密度ビオチン化チューブリンと標識されていないウシチューブリンを正しい比率で組み合わせることによって達成することができる。</li>
		<li>溶液を氷上で5分間インキュベートし、次いで37°Cで12.5分間インキュベートする。 注:種子の長さは、重合時間を調整することによって制御することができる。</li>
		<li>室温のBRB80を100 μL加えて重合を停止した。</li>
		<li>室温(126,000 x g、5分)の超遠心機で溶液をスピンダウンします。ピペットを用いて上清を捨て、未重合のチューブリンを除去した。 メモ: このプロトコルでは、空気駆動の超遠心分離機が使用されます。</li>
		<li>ペレットに室温BRB80を200 μL加える。ペレットを穏やかに、しかし徹底的にピペッティングして再懸濁する。切断チップ付きの200 μLピペットを使用して、微小管のせん断を軽減します。</li>
	</ol></li>
	<li>成長ダイナミックグアノシン二リン酸(GDP)-チューブリン「拡張」 注:種子は流路の抗生物質表面に固定化されます。ダイナミックなGTP/GDPの「拡張」は、固定化された種子の端から成長します。<ol>
<li>種子をBRB80で20倍に希釈する。希釈した種子を反応チャンバに流す。</li>
		<li>IRM を介して反応を監視します。種子が徐々に表面に「着地」し、それに結合するのを待ちます。種子の所望の密度が達成されたら、過剰分をBRB80で洗い流す。</li>
		<li>微小管延長混合物を調製する:BRB80緩衝液中の12μM非標識チューブリン、1mM GTP、5mMジチオスレイトール(DTT)。</li>
		<li>伸長混合物の少なくとも1つの流路体積に流れる。反応温度が28°Cであることを確認する。</li>
		<li>微小管の延長が時間の経過とともに種子から成長するのを待ちます。 メモ: 定常状態の長さは、通常 20 分未満で達成されます。</li>
		<li>イメージングには動的微小管を使用します。キネシン-1のステップ3.5で説明したように、微小管に蛍光MAPを追加して視覚化します。 注: 微小管は表面結合しているため、TIRF で簡単に見ることができます。</li>
	</ol></li>
	<li>キネシン運動性アッセイ 注:このステップでは、収縮する微小管上の運動性緑色蛍光タンパク質(GFP)標識キネシン-1を視覚化するためのプロトコルについて説明します。eGFP(rKin430-eGFP)に融合したトランケートラットキネシン−1構築物を、先に記載したように発現および精製した15、16。<ol>
<li>運動性緩衝液を調製する:BRB80中の1mM ATPおよび0.2mg/mLカゼイン。</li>
		<li>運動性緩衝液中のキネシン-eGFPを10nMに希釈する。</li>
		<li>酸化的フォトブリーチング(80 mM グルコース、80 mg/mL グルコースオキシダーゼ、32 mg/mL カタラーゼ、0.2 mg/mL カゼイン、20 mM DTT)に対抗するために 2 mM ATP を添加した 2x 脱酸素剤溶液を調製します。</li>
		<li>脱酸素剤10部、BRB809部、および10nMキネシン-eGFP1部を組み合わせて、最終キネシン濃度を0.5nMにする。 メモ: 合計ボリュームは、チャンネルボリュームの 1.5 倍以上にする必要があります。</li>
		<li>顕微鏡ソフトウェアでイメージング設定を行います。 メモ: このプロトコルでは、ビデオは 100 ミリ秒の露光時間で 10 fps で録画されます。レーザー強度は〜0.05キロワット/cm2です。</li>
		<li>イメージングを開始し、キネシン溶液をチャンバーに流します。</li>
		<li>測定が完了したら、ステージが円形または横方向の動きでゆっくりと平行移動する短い(〜5秒)ビデオを録画します。このビデオの中央投影を背景画像として使用し、生の測定値から減算します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 画像処理・解析
注:画像処理はNIH ImageJ2(imagej.nih.gov/ij/)を用いて行った。TIRF チャネルと IRM チャネルの分割とアライメントを自動化するためにマクロが開発されました。このマクロを使用するには、GaussFit_OnSpotプラグインがインストールされている必要があります (ImageJ プラグインリポジトリで利用可能)。
<ol><li>背景記録から、画像|をクリックしてImageJで中央値投影を作成します。 スタック|Z プロジェクト。</li>
	<li>[プロセス]をクリックして、生の画像データから背景投影の中央値を減 算|画像計算機。 メモ: 「32 ビット (浮動小数点数) 結果」オプションを必ずチェックしてください。</li>
	<li>画像登録のために、目的の微小管の近くにあるマイクロビーズのコレクションを選択し、それらを使用してTIRFおよびIRM画像を整列させます。</li>
	<li>このコレクション内の各ビーズについて、 マルチポイント 選択ツールを使用して、TIRF チャンネル内のおおよその位置をマークし、次に IRM チャンネル内の対応する位置をマークします。 メモ: たとえば、2 つのビーズ (1 と 2) がある場合、マルチポイント選択では、(1) TIRF のビーズ 1、(2) IRM のビーズ 1、(3) TIRF のビーズ 2、(IRM のビーズ 2) の順に 4 つのポイントが作成されます。</li>
	<li>提供された ImageJ マクロ (ImageSplitterRegistration.ijm) を実行します。 注:これにより、次の手順が自動化されます:i)ガウスにフィッティングすることによって各ビーズの中心位置を推定します。ii)各ビーズについて、前記TIRFチャネルにおける中心を前記IRMチャネルにおける中心から分離する変位ベクトルを計算するステップと、 Aiii)すべてのビーズにわたってこの変位ベクトルを平均化する工程と、iv) TIRF チャンネルと IRM チャンネルを別々の画像に分割する。v)iiiで計算された平均変位ベクトルによってTIRF画像を平行移動させる工程と、vi) マルチチャンネル.tiffファイル内の TIRF イメージと IRM イメージをオーバーレイします。</li>
</ol>

<ol><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Kuo, Y. -W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spastin+is+a+dual-function+enzyme+that+severs+microtubules+and+promotes+their+regrowth+to+increase+the+number+and+mass+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).</li>
<li>Hinrichs, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+diffuses+along+the+microtubule+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tau protein diffuses along the microtubule lattice.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).</li>
<li>Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herding+of+proteins+by+the+ends+of+shrinking+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%3A%22%5BJournal%5D)">Herding of proteins by the ends of shrinking polymers.</a> arXiv:. , (2021).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+dynamics+of+breakage+of+fluorescent+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules.</a> Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).</li>
<li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Taylor, R. W., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+RW+%22Interferometric+scattering+%28iSCAT%29+microscopy+and+related+techniques.+in+Label-free+super-resolution+microscopy%22">Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy</a>. Astratov, V. , Springer. Cham. 25-65 (2019).</li>
<li>Young, G., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy).</a> Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).</li>
<li>Koch, M. D., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+and+bending+analysis+of+microtubules+by+ROCS+microscopy+and+optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).</li>
<li>Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+single+microtubule+dynamics+using+spatial+light+interference+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).</li>
<li>Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+high-speed+wide-field+imaging+of+single+microtubules+using+interference+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy.</a> Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).</li>
<li>Mahamdeh, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+interference+reflection+microscopy+for+label-free%2C+high-speed+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520(2019).</li>
<li>Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfabrication in biology and medicine.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).</li>
<li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).</li>
<li>Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fractional+steps+in+cargo+movement+by+the+collective+operation+of+kinesin-1+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).</li>
<li>Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+microtubules+and+associated+proteins+by+Simultaneous+Interference-Reflection+and+Total-Internal-Reflection-Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy.</a> arXiv. , (2022).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

微小管関連タンパク質(MAP)による微小管ダイナミクスの調節を研究するには、しばしば微小管とMAPの同時イメージングが必要です。TIRFなどの蛍光顕微鏡技術が、この目的のために典型的に採用される。しかし、それらは、フォトブリーチング、光損傷、および蛍光色素標識の必要性を含む蛍光イメージングの欠点によって制限される。IRMなどのラベルのない方法は、微小管の可視化には適していますが、単一の蛍光色素をイメージングすることはできません。このプロトコルは、動的微小管とMAPの同時イメージングのために、ラベルフリーIRMイメージングとTIRF顕微鏡を組み合わせたものです。
IRMセットアップは>600nmにフィルタリングされたLED照明源を使用し、TIRFセットアップは488nmレーザーを使用します。安価なプレートビームスプリッタを使用して、照明光をサンプルに反射させ、収集した信号を検出器に送信しました(図1)。10%の反射率と90%の透過率を持つビームスプリッタを選択して、単一分子信号の損失を最小限に抑えました。照明光強度の90%の損失は、照明レーザーおよびLEDのパワーを増加させることによって補償される。 
信号のスペクトル分離は、90/10(R/T)ビームスプリッタと2つのスペクトルフィルタ(IRMの場合はロングパス600nm、TIRFの場合はバンドパス535/50nm)を使用して達成されました。スペクトル的に分離されたIRM信号とTIRF信号は、画像スプリッタアセンブリを使用して、単一のカメラチップの2つの半分に投影されます。90/10ビームスプリッタを使用すると、IRM信号の90%が犠牲になりますが、これはLED照明源の強度を上げることによって補償されます。ダイクロイックミラーを使用して、IRM信号とTIRF信号をより効率的に分離することもできます。アッセイに含まれる蛍光マイクロビーズは、TIRFおよびIRM画像の正確な位置合わせを可能にし、目的を集束させるための基準として機能します。
このプロトコルで最も重要な光学素子は、高開口数(NA)目標です。これは、完全な内部反射を達成するだけでなく、収集効率と画像コントラストを最大化するためにも不可欠です。得られた画像の品質は、ガラス表面の清浄度と、不均一な照明を補正し、静的な特徴を除去するための鮮明な背景画像の取得にも依存する。IRM イメージングでは、微小管やタンパク質の光損傷を最小限に抑えるために、長波長照明 (>600 nm) を使用することをお勧めします。これは、白色LED光源を使用する場合に特に重要であり、その場合、UV光を除去するためにロングパスフィルタを含める必要があります。 
このプロトコルにより、動的微小管のラベルフリーの高速イメージングと、蛍光MAPsの同時高解像度可視化が可能になります17。微小管とMAPの画像を交互にキャプチャするフィルタキューブスイッチング技術と比較して、このセットアップはフィルタキューブの物理的な回転に依存しないため、はるかに高いフレームレートが可能です。2色TIRFイメージング技術と比較して、この技術は要求の少ない光学セットアップを採用し、微小管の蛍光色素標識の必要性を回避します。この設定の主な制限は、MAP の TIRF イメージングによるものです。フレームレートは蛍光色素分子の露光時間によって制限され、蛍光色素分子のフォトブリーチングの可能性は依然として残っています。それにもかかわらず、このプロトコルは、必要な場合にのみTIRFを使用し(すなわち、微小管を視覚化するために)、TIRFの制限内で可能な限り最高の速度を達成するため、既存の技術を改善する。微小管とMAPの両方が干渉技術によって視覚化された場合にのみ、さらなる改善が可能ですが、これには金属ナノ粒子でMAPを標識する必要があり、これには限界と実験上の課題があります。
この技術の能力を実証するために、IRMとTIRFを介して、微小管の収縮と蛍光キネシン分子の歩行という2つの高速動的プロセスを同時に視覚化しました。この技術は、収縮する微小管5上のスパスチンの速い拡散を視覚化するために以前に採用されてきた。MAPsや微小管へのこのアプリケーションを超えて、このプロトコルは、細胞膜やアクチンフィラメントなどのIRMを介して視覚化されるのに十分な大きさの任意の高分子構造と同時に単一の蛍光分子を視覚化するために使用することができます。

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡は、単一の蛍光分子の可視化に一般的に使用されます。落射蛍光イメージングと比較して、TIRFは優れたバックグラウンド抑制を達成し、単一蛍光色素の高分解能局在化および追跡を可能にします。このため、TIRFは蛍光標識された微小管関連タンパク質を可視化するための好ましい方法であり、微小管1,2を画像化するために頻繁に使用される。
MAPによる微小管ダイナミクスの調節を調べるには、微小管とMAPの両方を同時にイメージングすることがしばしば必要である。この目的のための既存の方法のほとんどは高価であるか、または技術的な欠点に苦しんでいる。例えば、2色同時TIRFには、2つの励起レーザーと2台のカメラが必要です。高コストに加えて、別々のカメラの必要性は、フレーム同期と画像登録の問題を引き起こします。この必要性は、回転フィルタ立方体を使用して連続フレーム3内の励起レーザを物理的に切り替える場合、回避することができる。このようなセットアップでは、単一のカメラチップを使用することができ、フレームは微小管とMAPの画像間で交互に行われる。ただし、この手法はフィルタ変更の速度によって制限され、通常はフレームレートを0.5フレーム/秒3(fps)未満に制限します。このようなフレームレートは、最大500nm/sの速度で起こる微小管の収縮、800nm/s程度の速度でのキネシンの歩行、または0.3μm2/s4を超える拡散係数で起こるMAPの拡散などの高速動的プロセスを解決するには不十分である。これは、移動する微小管先端部5の位置に対するMAPの位置など、各チャネル内の2つの移動標的の相対位置を追跡する場合に特に問題となる。
これらの光学的制約に加えて、2色TIRF顕微鏡では、発光スペクトルが十分に分離された異なる蛍光色素でMAPおよび微小管を標識する必要があります。チューブリンの蛍光標識は微小管ダイナミクス6を変化させる可能性があり、蛍光色素のフォトブリーチングはイメージング速度7を制限します。これらの問題のために、微小管を視覚化するためのラベルフリーイメージング技術が開発されている。これらには、干渉散乱顕微鏡(iSCAT)8,9、回転コヒーレント散乱顕微鏡(ROCS)10、空間光干渉顕微鏡(SLIM)11、および干渉反射顕微鏡(IRM)12,13が含まれる。これらの技術は、蛍光イメージングの欠点なしに微小管の高速ラベルフリーイメージングを可能にしますが、単一のMAPを視覚化するために使用することはできません。
これらのラベルフリー技術の中で、IRMは低コストと計装に対する控えめな要求で際立っています。我々は最近、IRMを市販のTIRF顕微鏡と組み合わせるためのプロトコルを提示し、微小管と蛍光MAPを交互のフレームで画像化できるようにした3,13。このホワイトペーパーでは、この設定を変更して、TIRF画像とIRM画像を1つのカメラチップで同時にキャプチャするためのプロトコルを紹介します。これには、TIRFレーザーとIRM LED光源でサンプルを同時に照らすために、励起経路に安価なビームスプリッターを追加することが含まれます。改造された市販の画像スプリッタは、TIRF信号とIRM信号をスペクトル的に分離し、同じカメラチップの別々の半分に投影するために使用されます。また、イメージング中に試薬を迅速に交換できるマイクロ流体システムを採用しています。このプロトコルでは、この設定を使用して動的な微小管と MAP をイメージ化する方法について説明します。この装置の能力は、10s-1のフレームレートで捕捉された、収縮する微小管上を歩くキネシン-1タンパク質の最初の視覚化を提示することによって実証される。

<table><tbody><tr><td>10/90 (R/T) ビームスプリッター</td><td>Thorlabs</td><td>BSN10R</td><td>励起ビームパスに使用した平面ビームスプリッター</td></tr><tr><td>90/10 (R/T) ビームスプリッター</td><td>Thorlabs</td><td>BSX10R</td><td>イメージスプリッターに使用した平面ビームスプリッター</td></tr><tr><td>抗ビオチン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3640</td><td>ビオチン化微小管</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FLAASの結合表面に使用</td><td>運動性バッファーの調製に使用</td></tr><tr><td>バンドパスフィルター</td><td>Newport</td><td>HPM535-50</td><td>ハードコートバンドパスフィルターは、画像スプリッターでGFPシグナルの画像化に使用されます</td></tr><tr><td>ビオチン化チューブリン</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333P-A</td><td>微小管の種子を流路の表面に結合するために使用される</td></tr><tr><td>カゼイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8654</td><td>カゼインは非特定の相互作用をブロックするために使用されます</td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>脱酸素剤溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>デシケーターチャンバー</td><td>サザンラボウェア</td><td>55207</td><td>デシケーターは樹脂</td></tr><tr><td>DTT</td><td>の脱気に使用されますSigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>酸素スカベンジャー溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>BRB80バッファーの調製に使用</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>酸素スカベンジャー溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7016</td><td>酸素スカベンジャー溶液</td></tr><tr><td>GMPCPPヌクレオチド</td><td>の調製に使用イエナ・バイオサイエンス</td><td>NU-405L</td><td>安定化微小管の重合に使用</td></tr><tr><td>イメージスプリッター</td><td>Teledyne-Photometrics Imaging</td><td>OptoSplit II</td><td>イメージスプリッターは、画像を空間的に分割するために使用されます。購入するときは、顕微鏡</td></tr><tr><td>ImajeJ2</td><td>NIH</td><td></td><td>ImageJ2</td></tr>との互換性について確認してください 画像分析に使用されます <tr><td>キネシン</td><td></td><td></td><td>社内で準備（テキストの参考文献を参照)</td></tr><tr><td>LDPEチューブ</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>9565S22</td><td>非毒性、低密度ポリエチレン マイクロボア チューブは流体移送に使用されます</td></tr><tr><td>LED光源</td><td>Lumencor</td><td>Lumencorソラライトエンジン</td><td>IRMイメージングに使用</td></tr><tr><td>ロングパスフィルター</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0600</td><td>ハードコートロングパスフィルター。1つは励起フィルターとして使用され、もう1つはIRM信号を画像化するために画像スプリッターで使用されます</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td>BRB80バッファーの準備に使用されます</td></tr><tr><td>マイクロスコープ対物レンズヒーター</td><td>okolab</td><td>H401-T-DUAL-BL</td><td>対物</td></tr>レンズ顕微鏡 ニ<tr><td></td><td>コン</td><td>Ti-Eclipse</td><td>実験で使用される倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>NA-PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2949</td><td>BRB80バッファーの準備に使用</td></tr><tr><td>ニコンCFIアポクロマートTIRF 100XCオイル対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>MRD01991</td><td>イメージング対物レンズは1.49開口</td></tr><tr><td>PDMSと硬化剤</td>電子<td>顕微鏡科学</td>シル<td>ガード184(24236-10)</td>フローチャネルPDMSパンチャーワールド精密機器LLCを<td>コンストラクティングするために使用されます</td></tr><tr><td></td><td></td><td>504529</td> PDMS血しょう洗剤Harrick血しょうDPC-32G<td>に穴を開けるのに使用</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>空気血しょうがPDMSの表面からの有機汚染を取除くのに使用されています</td></tr><tr><td>Poloxamer 407 (商業名Pluronic F-127)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2443</td><td>チャネル表面の不動態化のために使用されて非特異的結合を最小にする</td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム</td><td>ΣSigma-Aldrich</td><td>567530</td><td>を準備するために使用されてBRB80バッファー</td></tr><tr>社内で調製した<td>安定化微小管(</td><td></td><td></td><td>本文中の参考文献を参照)</td></tr><tr><td>卓上型超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>340400</td><td>微小管の種子をスピンダウンするために使用</td></tr><tr><td>テトラスペックビーズ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T7279</td><td>画像を整列させるための基準として使用</td></tr><tr><td>Zyla 4.2カメラ</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2</td><td>科学用CMOSカメラ(仕様):2048 x 2048ピクセル(6.5μ;m ピクセル サイズ) で、量子効率 72% と 16 ビットのダイナミック レンジを備えています</td></tr></tbody></table>。

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

細胞骨格フィラメントおよびそれらに関連するタンパク質の直接可視化のために、いくつかの技術が採用されてきた。全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡は、高いシグナル対バックグラウンド比を有するが、蛍光タンパク質のフォトブリーチングおよび光損傷に苦しむ。干渉反射顕微鏡(IRM)や干渉散乱顕微鏡(iSCAT)などのラベルフリー技術は、フォトブリーチングの問題を回避しますが、単一分子を容易に視覚化することはできません。この論文は、IRMと市販のTIRF顕微鏡を組み合わせて、微小管関連タンパク質(MAP)と動的微小管をインビトロで同時にイメージングするためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、動的微小管と相互作用するMAPの高速観察を可能にする。これにより、微小管標識の必要性と、第2励起レーザーなどのいくつかの追加の光学部品の必要性の両方が排除され、既存の2色TIRFセットアップが改善されます。両方のチャンネルが同じカメラチップに画像化され、画像登録とフレーム同期の問題を回避します。このセットアップは、動的な微小管上を歩く単一のキネシン分子を視覚化することによって実証される。

光学セットアップを図 1に図式化します。IRM照明とTIRF励起光の両方が、10/90(R/T)ビームスプリッタ(BS1)を介して対物レンズ(100x、NA:1.49)のバックアパーチャに向けられます。放射された信号は、同じビームスプリッタ(BS1)を通過し、ミラー(M1)を介して画像スプリッタに反射される。イメージスプリッタの構成要素( 図1では破線で囲まれています)は、適切なスペクトルフィルタとともに、90/10(R/T)ビームスプリッタ(BS2)を介してIRM信号とTIRF信号を分離します。最後に、分割された画像がカメラチップに投影され、視覚化されます。イメージスプリッタのアライメントは、TIRF信号とIRM信号がチップの別々の半分に投影されるようにします。
整列した顕微鏡では、 図 2 に示すように、カメラ画像に中間分割画像が表示されます。表面結合微小管はIRMチャネル13において容易に見えるべきであり、蛍光キネシンはTIRFチャネルにおいて可視でなければならない。
2つのチャンネルの整列と登録に使用されるマイクロビーズは、TIRF画像では明るいスポットとして、IRM画像では暗いスポットとして表示されます。ビーズは生データに表示されますが、バックグラウンド減算によってコントラストが大幅に向上します(図2)。減算に使用される背景画像は、移動ステージで記録されたビデオの時間中央値です。プロトコルで説明されているように、関心領域の近くにあるビーズのコレクションを選択し、提供されたマクロ (imageSplitterRegistration.ijm) を実行することによって、イメージのアライメントが実行されました。マクロは、ポイントをガウス分布に合わせ、各チャンネルの適合点の中心点間の平均距離を最小化することによって画像を整列させます。このプロセスは 図2に表され、蛍光マイクロビーズの良好なアライメントを示しています(TIRFチャネルでは緑色、IRMチャネルでは黒色)。
最後に、この同時イメージングセットアップの能力は、微小管の収縮する端に向かって歩く単一のキネシン分子を観察することによって実証される。 図3 は、収縮する微小管(灰色)上を歩くeGFP標識キネシン分子(緑色)のキモグラフを示す。また、キモグラフが生成された記録からの一連のスナップショットも表示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig01.jpg"> 図1:キネシン運動性のIRMおよびTIRF同時イメージングのための光学セットアップの概略図。 LED光源からの落射照明は、絞り膜を通過し、10/90(R/T)ビームスプリッタ(BS1)に到達します。ビームスプリッタは、赤色IRM照明光と488nmのTIRF励起光を対物レンズまで部分的に反射してサンプルを照らす。サンプルからの信号は、同じ対物レンズによって収集され、IRMおよびTIRF画像が90/10(R/T)ビームスプリッタ(BS2)によって空間的に分離される画像分割アセンブリに送られます。その後、信号はカメラチップに到達する前にスペクトルフィルタリングされます。略語: IRM = 干渉反射顕微鏡;TIRF = 全内部反射蛍光;LED = 発光ダイオード;ITIRF = TIRF イルミネーション;I GFP =GFP 蛍光;Iinc = IRM 照明;Iref =ガラス/水の界面での散乱光。私はスキャット =微小管からの散乱光;I IRM =IRM 信号 (I参照 と Iスキャットの干渉);R/T = 反射/送信;LP600: ロングパスフィルター (600 nm);DM = ダイクロイックミラー;BS1 および BS2 = ビームスプリッタ 1 および 2;M1、M2、M3、M4 = ミラー;BP535/50 = バンドパス(535/50 nm);GFP = 緑色蛍光タンパク質;GMPCPP = グアニリル 5'-α,β-メチレンジホスホネート;GDP=グアノシン二リン酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig02.jpg"> 図2:背景の減算と画像の配置 TIRF(左半分)とIRM(右半分)の画像は、同じカメラチップ(カメラ画像)の2つの半分に同時に表示されます。時間的な背景の中央値減算は、IRM では暗く、TIRF 画像では明るく見えるビーズ (背景減算画像) のコントラストを高めます。IRM および TIRF イメージは、選択したビーズ (白い長方形) の位置に基づいて平行移動 (右) によって整列されます。スケールバー = 10 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig03.jpg"> 図3:キモグラフと微小管収縮中のキネシンの動きのスナップショット。 カイモグラフ(左)は、eGFP-キネシン-1(緑色)が微小管のプラス端(濃い灰色)に向かって歩いていることを示しています。対応する時系列のスナップショットが表示されます (右)。白い矢印は単一のキネシン-1分子を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ImageSplitterRegistration File: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/ImageSplitterRegistration.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

この方法の意義は、標識のない微小管を、蛍光標識されたタンパク質と同時に高いフレームレートで画像化することを可能にすることである。この技術の主な利点は、その容易な実装と光学部品に対する最小限の要求です。また、微小管のフルオロ-4標識の必要性を回避します。まず、硬化剤と主剤エラストマーとを1:10の質量比で組み合わせることによってPDMSポリマーを調製する。それらを2分間混合し、次いですべての気泡が消えるまで真空チャンバ内で混合物を脱気する。その後、気泡を出さないように注意しながら、厚さ約0.5センチのマスターモールドに混合物を注ぎ、摂氏70度の予熱オーブンで40分間焼きます。次いで、PDMSパンチャーを用いてチャネルの両端にポリマーおよびパンチ孔の構造化領域を切り出す。後で、PDMS ブロックの構造化された側をクリーニングします。続いて、イソプロパノールとメタノールで3回すすぎ、続いて超純水で表面を吹き付けて乾燥させます。次に、酸素または空気プラズマを使用してPDMSをプラズマ洗浄し、プラズマ洗浄されたPDMSを適切に洗浄されたカバーガラスの上に置きます。それを摂氏80度のホットプレートで15分間加熱する。適切なサイズの低密度ポリエチレンチューブを穴に挿入し、出口チューブを0.5ミリリットルのシリンジに接続します。次に、入口チューブを溶液に浸漬し、シリンジで必要な体積を描画することによって、溶液をマイクロチャネルに流す。サンプルを顕微鏡ステージに置き、IRMイメージング用の落射照明光源をオンにします。顕微鏡に焦点を合わせるには、PDMSソリューションインターフェースの近くで正しい焦点面を探し、チャンネルの中心付近の視野を選択します。次に、BRB80中の蛍光マイクロビーズの0.1マイクロモル溶液を調製し、マイクロビーズ溶液の少なくとも1つのチャネル体積に流す。IRM または TIRF を介して反応を監視します。マイクロビーズの所望の密度が達成されたら、過剰分をBRB80で洗い流す。希釈した種子を反応チャンバに流し、IRMを通して反応を監視する。種子の所望の密度が達成されたら、過剰分をBRB80で洗い流す。次に、BRB80緩衝液中で12マイクロモルの非標識チューブリン、1ミリモルのGTP、5ミリモルDTTを含む微小管伸長混合物を調製する。次いで、反応温度が摂氏28度であることを確認しながら伸長混合物の少なくとも1つの流路体積に流す。まず、顕微鏡ソフトウェアでイメージング設定を行います。イメージングを開始し、キネシン溶液をチャンバーに流します。次いで、GFP標識キネシン1を収縮していない微小管に可視化する。測定が完了したら、ステージが円形または横方向の動きでゆっくりと平行移動する短いビデオを録画します。このビデオの中央値投影は背景画像として機能し、生の測定値から差し引かれます。画像をクリックして、背景記録からImageJに中央値投影を作成します。次に、[スタック]オプションを選択し、[Zプロジェクト]をクリックします。次に、[プロセス]をクリックして生の画像データから背景投影の中央値を減算し、[画像計算機]オプションを選択しながら、32ビットのfloat結果オプションを確認します。画像登録のために、目的の微小管の近くにあるマイクロビーズのコレクションを選択し、それらを使用してTIRFおよびIRM画像を整列させます。このコレクション内の各ビーズについて、マルチポイント選択ツールを使用して、TIRF チャンネル内のおおよその位置をマークし、次に IRM チャンネル内の対応する位置をマークします。次に、指定された ImageJ マクロを実行します。マイクロビーズは、右側のIRMチャネルにダークスポットとして、左側のTIRFチャネルに明るいスポットとして表示されます。アライメント手順では、ビーズの選択をローカライズすることによって、2つのチャンネルを正しくオーバーレイします。微小管の収縮末端に向かって歩くEGFP標識キネシン分子のキモグラフも、このプロトコルを用いて得られた。この手順を実行するときは、内部反射全体を達成し、収集効率と画像コントラストを最大化するために、高い開口数目標を選択することが重要です。この方法は、細胞膜やアクチンフィラメントなどのIRMによって可視化できるほど巨大な高分子構造内で同時に単一の蛍光分子の高解像度イメージングに使用することができます。このプロトコルは、IRM、TIRF、およびエピ蛍光の任意の組み合わせによる同時イメージングに容易に適応可能な手順も提供します。

simultaneous-interference-reflection-total-internal-reflection

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。...

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、高コントラスト分解能と時間分解能で細胞表面に近い構造を観察するための強力なアプローチです。我々は、全反射は、細胞壁で囲まれた細菌や真菌細胞の皮質でのタンパク質のダイナミクスを研究するために用いることができる方法を示しています。...

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

このビデオでは、アクチンと微小管の重合ダイナミクスを視覚化するための全反射顕微鏡ベースの手法であるTIRFについて説明しています。この手法により、細胞のクロストークを理解するために不可欠な、アクチンと微小管の結合ダイナミクスをリアルタイムで高解像度でイメージングできます。...

アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

このビデオでは、適切なバッファーの存在下でカバースリップ表面に成長する微小管を視覚化する干渉反射顕微鏡(IRM)技術について説明します。入射光で照らすと、カバースリップ-バッファー界面とバッファー-微小管界面が光を反射し、これが組み合わさって干渉パターンを形成することで、明るい背景に対して微小管を高コントラストの画像として視覚化できます。...

微小管ダイナミクスのラベルフリー可視化のための干渉反射顕微鏡法

出典: Winkle, C. C., et al.軸索分岐と神経細胞形態形成中の原形質膜送達の役割を定義するための複合方法論の利用。J. Vis. 経験。...

エキソサイトーシスイベントの可視化のための全反射蛍光顕微鏡

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

このプロトコルは、インビトロ表面アッセイを用いて微小管の無標識、高コントラスト、高速イメージングのための標準的な蛍光顕微鏡上の干渉反射顕微鏡を実装するためのガイドです。...

微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ...

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

ここでは、微小管束を in vitroで...

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

このプロトコルは、 in vitro 全内部蛍光(TIRF)顕微鏡アッセイを使用して動的アクチンおよび微小管を視覚化するためのガイドです。...

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

学ぶ 干渉反射顕微鏡と全内部反射蛍光顕微鏡を組み合わせた同時イメージング法により、ラベルフリーの微小管と蛍光標識タンパク質を高フレームレートで可視化する手法。このプロトコルは細胞動態研究に有用です。

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

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