Name: TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学ぶTIRF顕微鏡を用いたインビトロ微小管ダイナミクス可視化法。単一微小管と架橋小管の動態を同時観察し、微小管関連タンパク質の集団的活動を解析します。細胞生物学・神経科学研究に有用です。

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この活動は、NIH(no. 1DP2GM126894-01)からの助成金と、ピュー慈善信託とスミスファミリー財団からR.S.への資金によって支援されました。著者らは、プロトコルの開発と最適化に対するShuo Jiang博士の貢献に感謝する。

<ol><li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+complexity%3A+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li>
<li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+properties+of+neuronal+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li>
<li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li>
<li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li>
<li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li>
<li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li>
<li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li>
<li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li>
<li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li>
<li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics%3A+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue%2C+GMPCPP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li>
<li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1%2C+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595(2018).</li>
<li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880(2021).</li>
<li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li>
<li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bmicrotubule%26%2334%3B+in+plant+cell+fine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A &#34;microtubule&#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li>
<li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119(2022).</li>
</ol>

著者らは、競合する利害関係を宣言していない。

ここで説明する実験は、従来、単一の微小管または1種類のアレイで実施される従来の微小管再構成アッセイの範囲と複雑さを大幅に拡大します。現在のアッセイは、2つの集団、すなわち単一の微小管および架橋束に対する調節MAP活性を同時に定量および比較する方法を提供する。さらに、このアッセイでは、ダイナミクスの開始前に安定な種子から予め形成されたバンドルと、2つの成長末端が互いに出会い、架橋したときに新たに形成されるバンドルの2種類の検査が可能になります(図3)。さらに、タンパク質濃度やバッファー条件などの従来の実験変数に加えて、これらのアッセイは、微小管ダイナミクスとMAP活性の重要な決定要因として浮上しているバンドル内の隣接するフィラメント間の長さや角度など、微小管アレイの幾何学的特徴の影響の評価を可能にします16。
複数の微小管ベースの構造のin vitro再構成のためのこの実験方法を拡張するためには、以下の重要な問題に取り組む必要がある:(i)PRC1は、互いに反...

微小管は、細胞内輸送および細胞小器官の位置決めから細胞分裂および伸長に至るまで、複数の細胞プロセスに不可欠な構造足場を形成する生体高分子である。これらの多様な機能を実行するために、個々の微小管は、有糸分裂紡錘体、毛様体軸索、ニューロンバンドル、相間配列、および植物皮質配列などのミクロンサイズの配列に編成される。これらの構造に見られる普遍的な建築モチーフは、その長さに沿って架橋された微小管の束です1。いくつかの微小管ベースの構造の興味深い特徴は、束ねられた微小管と非架橋された単一の微小管が空間的に近接して共存することである。これらの微小管亜集団は、その適切な機能のために必要なように、互いに著しく異なる重合ダイナミクスを示すことができる2,3,4,5。例えば、有糸分裂紡錘体内では、安定な架橋束および動的単一微小管が、細胞中心のミクロンスケール領域内に存在する6。したがって、共存する微小管集団の動的特性がどのように特定されるかを研究することは、微小管ベースの構造の組み立てと機能を理解する上で中心的である。
微小管は、重合と解重合の相を循環する動的なポリマーであり、大惨事と救助として知られるイベントで2つの相を切り替えます7。細胞微小管のダイナミクスは、微小管の重合および解重合の速度、ならびに大惨事および救助事象の頻度を調節する無数の微小管関連タンパク質(MAP)によって調節される。細胞内の空間的に近位アレイ上のMAPの活性を調べることは、光学顕微鏡、特に微小管密度の高い領域における空間分解能の限界のために困難である。さらに、同じ細胞領域に複数のMAPが存在することは、細胞生物学的研究の解釈を妨げる。全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法と組み合わせて実施されるインビトロ再構成アッセイは、MAPの特定のサブセットが近位細胞微小管アレイのダイナミクスを調節するメカニズムを調べるという課題を回避します。ここで、インビトロで組み立てられた微小管の動態は、制御された条件下で1つ以上の組換えMAPの存在下で調べられる8、9、10。 しかしながら、従来の再構成アッセイは、典型的には、単一の微小管または1つのタイプのアレイ上で行われ、共存する集団の可視化を妨げる。
ここでは、同じ溶液条件下で2つの微小管集団を同時に可視化することを可能にするin vitro 再構成アッセイを紹介します11。我々は、単一の微小管および有糸分裂紡錘体関連タンパク質PRC1によって架橋された微小管束上の複数のMAPの集合活性を同時に見る方法を説明する。タンパク質PRC1は、抗平行微小管間の重なりで優先的に結合し、それらを架橋する9。簡単に言えば、このプロトコルは、(i)原液および試薬の調製、(ii)顕微鏡実験用のイメージングチャンバの作成に使用されるカバースリップの洗浄および表面処理、(iii)実験中に重合が開始される安定した微小管「種子」の調製、(iv)微小管ダイナミクスを視覚化するためのTIRF顕微鏡設定の仕様、(v)微小管種子の固定化および架橋微小管束の生成 画像化チャンバ内において、(vi)TIRF顕微鏡による画像化チャンバ内の微小管ダイナミクスの可視化、可溶性チューブリン、MAP、およびヌクレオチドの添加時。これらのアッセイは、MAP局在化および2つの微小管集団の動態に対するそれらの影響の定性的評価および定量的検査を可能にする。さらに、これらの微小管集団に対する複数のMAPの相乗効果の評価を、幅広い実験条件にわたって容易にする。

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸 (Trolox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸 (PIPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>18x18 mm #1.5 カバースリップ&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>24x60 mm #1.5 coverslips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>405/488/560/647 nm レーザークワッドバンド&nbsp;</td><td>彩度</td><td>TRF89901-NK</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>320110</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン5'-三リン酸二ナトリウム塩水和物(ATP)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>アビジン、ニュートラアビジン&reg;ビオチン結合タンパク質(Molecular Probes&reg;)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>バスソニケーター:ブランソン2800クリーナーブラン</td><td>ソン</td><td>CPX2800H</td><td></td></tr><tr><td>ベックマンコールターポリカーボネート厚壁チューブ、11 x 34 mm</td><td>ベックマンコールター&nbsp;</td><td></td><td></td>343778</tr><tr><td>ベックマン・コールター ポリカーボネート厚壁チューブ、8 x 34 mm</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td></td><td></td>343776</tr><tr><td>ビオチン-PEG-SVA、MW 5,000</td><td>レイサン Bio</td> <td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>2905</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>コーニング LSE ミニ微量遠心分離機、AC100-240V</td><td>コーニング</td><td>6670</td><td></td></tr><tr><td>デリケート タスク ワイプ</td><td>キムテック</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td></td></tr><tr><td>蛍光フィルター</td><td></td><td>Chroma ET610/75m</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(200プルーフ)</td><td>Decon Labs</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール四酢酸(EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>NU-405</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン5'-三リン酸ナトリウム塩水和物(GTP)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G8877</td><td></td></tr>ヘル<tr><td>マネックスIII洗剤&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>イマージョン オイル、タイプ A</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>77010</td><td></td></tr><tr><td>カッパカゼイン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>ラノリン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>S25376</td><td></td></tr><tr><td>レンズ クリーニング ティッシュ</td><td>ThorLabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl<サブ>2</サブ>)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフュージ16ベンチトップ遠心分離機</td><td>ベックマンコールター&nbsp;</td><td>A46474</td><td></td></tr>顕微鏡<tr><td>スライド、ダイヤモンドホワイトガラス、25 x 75mm、90°;グランドエッジ、ホワイトフロスト</td><td>グローブサイエンティフィック</td><td>1380-50W</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-吉草酸スクシンイミジル、MW 5,000&nbsp;</td><td>Laysan Bio</td> <td>#NH2-PEG-VA-5K</td><td></td></tr><tr><td>オプティマ&トレード;Max-XP 卓上型超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td></td><td></td>393315</tr><tr><td>パラフィン</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>ペルコ リバース (自己閉鎖型)、ファイン ピンセット</td><td>テッド ペラ</td><td>5377-NM</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン、ホワイト</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>18-605-050</td><td></td></tr><tr><td>プラズマ クリーナー、115V</td><td>ハリック プラズマ</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>重曹</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Thermal-Lok 1 ポジション ドライ ヒート バス</td><td>USA Scientific</td><td>2510-1101</td><td></td></tr><tr><td>1.5 および 2.0 mL チューブ用 Thermal-Lok ブロック</td><td>USA Scientific</td><td>2520-0000</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade;ピアス&トレード;ボンドブレーカー&貿易;TCEP溶液、中性pH;500mM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI-77720</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 100X NA 1.49 油対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>CFIアポクロマート TIRF 100XC油TIRF</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス Ti</td><td></td></tr><tr><td>TLA 120.1ローター</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td></td><td></td>362224</tr><tr><td>TLA 120.2ローター</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td></td><td></td>357656</tr><tr><td>チューブリンタンパク質(純度>99%):ブタ脳</td><td>細胞骨格</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>チューブリンタンパク質(ビオチン):ブタ脳</td><td>細胞骨格</td><td>T333P</td><td></td></tr><tr><td>チューブリンタンパク質(蛍光HiLyte 647):ブタ脳</td><td>細胞骨格</td><td>TL670M</td><td></td></tr><tr><td>チューブリンタンパク質(X-ローダミン):ウシ脳</td><td>細胞骨格</td><td>TL620M</td><td></td></tr><tr><td>ベクタボンド&reg;試薬、組織切片接着</td><td>ベクターBiolabs</td><td>SP-1800-7</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg;個人サイズのインキュベーター、120V、50 / 60Hz、0.6A</td><td>VWR</td><td>97025-630</td><td></td></tr></tbody></table>

tirf顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

微小管は、細胞内で別個の構造に組織化するαβ-チューブリンヘテロ二量体のポリマーである。微小管ベースのアーキテクチャとネットワークには、多くの場合、動的特性が異なる微小管アレイのサブセットが含まれています。例えば、細胞を分裂させる際に、架橋微小管の安定な束は、動的非架橋微小管のすぐ近くに共存する。TIRF顕微鏡ベースの インビトロ 再構成研究は、これらの異なる微小管アレイのダイナミクスの同時可視化を可能にする。このアッセイでは、イメージングチャンバは、単一のフィラメントとして存在するか、または架橋束に組織化された表面固定化微小管で組み立てられる。チューブリン、ヌクレオチド、およびタンパク質調節剤の導入により、関連するタンパク質の直接可視化、および単一および架橋微小管の動的特性の直接可視化が可能になります。さらに、動的な単一の微小管がバンドルに編成されるときに発生する変化をリアルタイムで監視することができます。ここで説明する方法は、個々のタンパク質の活性および局在化の体系的な評価、ならびに同一の実験条件下での2つの異なる微小管サブセットに対するタンパク質調節因子の相乗効果を可能にし、それによって他の方法ではアクセスできない機構的洞察を提供する。

上記の実験は、647 nmフルオロフォア標識ビオチン化微小管、560 nmフルオロフォア標識非ビオチン化微小管、および560 nmフルオロフォア標識可溶性チューブリンミックスを用いて実施した。微小管は、架橋タンパク質PRC1(GFP標識)によって架橋された。表面固定化バンドルおよび単一の微小管が生成された後(ステップ5.11)、イメージングチャンバをTIRF 100X 1.49 NAオイル対物レンズに取り付け、560nmおよび647nmの蛍光チャネルで観察した。単一の微小管は、647nmチャネルにおけるそれらの蛍光シグナルによって同定された。両方のチャネルに蛍光シグナルを有する微小管は、予め形成された束として同定された(図4)。同じ蛍光標識を有するビオチン化微小管および非ビオチン化微小管を用いて実験を行った場合、バンドルについて検出された蛍光強度は、単一の微小管の蛍光強度の約2倍以上になる。各集団の割合および密度に基づいて、ステップ5.6および5.10における微小管種子の濃度を最適化することができる。
<p class="jove_content" fo:keep-to...

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ 再構成アッセイを提示し、2つの微小管集団のダイナミクスを同時に定量および比較する。架橋された微小管束および単一の微小管上の複数の微小管関連タンパク質の集合的活性を同時に見る方法が記載されている。

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

細胞微小管アレイは、機能に必要な明確な動的特性を有する微小管の部分集団を含む。このプロトコルは、規制当局の集団的活動が近位微小管亜集団に明確な特性をどのように与えるかを扱っている。このボトムアップ型反発アッセイにより、単一の微小管や束などの近位微小管集団の組織とダイナミクスを同時に可視化し、自己組織化の根底にあるメカニズムを解読することができます。多成分再構成では、pH、イオン強度、タンパク質濃度などの実験パラメータを最適化しながら、それぞれの活性を維持する必要があります。マルチタンパク質アッセイ前の個々の成分の体系的な分析は非常に役立ちます。まず、1マイクロリットルの微小管溶液中の4.5マイクロリットルのBRB ADDTTの混合物を顕微鏡スライド上にピペットでピペットする。18 x 18ミリメートルのカバースリップで覆い、透明なマニキュアまたはVALAPシーラントでエッジをシールします。TIRF 目標をカバースリップの下に配置します。明るい混合物中の蛍光標識されたチューブリンに適した波長で新しく重合された微小管を視覚化し、今後の実験で使用する微小管の希釈を決定する。すべての蛍光タンパク質が照射されるが、実験の経時的経過にわたって有意な光退色を受けないように、実験のレーザー強度を経験的に決定する。顕微鏡の温度を摂氏 28 度に設定して、動的な微小管を表示します。レンズ紙を使用して、70%エタノールで100倍の対物レンズをきれいにします。フィルターキューブと発光フィルターの最適な組み合わせは、画像化する蛍光チャンネルに応じて使用します。イメージングシーケンスを設定します。647ナノメートルのフルオロフォア標識ビオチン化微小管、560ナノメートルのフルオロフォア標識非ビオチン化微小管、および目的のGFP標識タンパク質を用いた実験では、488ナノメートル、560ナノメートル、および647ナノメートルのチャネルを10秒ごとに20分間画像化します。可溶性チューブリンおよび微小管関連タンパク質を添加する前のバンドルの参照画像をキャプチャするには、560ナノメートルおよび647ナノメートルの波長チャネルにそれぞれ1つの画像を持つ配列を設定します。顕微鏡の上の天井のレーザービームの位置を確認し、ソフトウェアを使用してビームに変更を加えます。レーザーイルミネーターの位置が揃っていることを確認します。イメージングの前に、顕微鏡浸漬オイルを対物レンズに一滴加えます。氷の上に保ちながら可溶性チューブリン混合物を調製し、混合物をスピンダウンする。ビオチン-ニュートラアビジン-ビオチン結合を介して微小管を固定化するために、チャンバーが充填されるまで約7.5マイクロリットルのニュートラアビジン溶液を最初に流し、5分間インキュベートする。10マイクロリットルのMBの寒さで洗う。7.5マイクロリットルのブロッキングタンパク質KCを流し込み、2分間インキュベートする。10マイクロリットルのMBを温めて洗浄し、微小管の導入のためのチャンバーを準備する。ビオチン化微小管のストックをBRB ADDTTで希釈し、この希釈液の1マイクロリットルを9マイクロリットルのMBに温める。混合物をチャンバーに流し、10分間インキュベートする。10マイクロリットルのMBの温かい状態で非固定化微小管を洗い流す。7.5マイクロリットルの温かいKCをチャンバーに流し、2分間インキュベートする。インキュベーションの間、KC中の架橋またはタンパク質PRC1の2ナノモル溶液を調製し、溶液をスピンダウンする。この溶液10マイクロリットルをイメージングチャンバに流し、5分間インキュベートする。バンドルを作るには、10マイクロリットルの非ビオチン化微小管をチャンバーに流し、10分間インキュベートする。10マイクロリットルのMBの温かくチャンバーを2回洗浄する。10分間のインキュベーション時間の間に、目的のタンパク質、可溶性チューブリン、ヌクレオチド、脱酸素剤、および抗酸化物質を含むアッセイ混合物10マイクロリットルを調製し、それをスピンダウンする。混合物を氷の上に保管する。準備したイメージングチャンバをスライドホルダーにテープで固定し、100X TIRF対物レンズにロードします。560 ナノメートルおよび 647 ナノメートルのチャネルを使用して、単一の微小管およびバンドルの最適な数と密度を含む視野を見つけます。視野が特定されたら、参照画像を撮影します。アッセイ混合物を、画像化チャンバを乱すことなく注意深く流す。チャンバーの開放端をVALAPシーラントでシールします。微小管を観察し、イメージングシーケンスを開始します。微小管種子を固定化し、バンドルを生成した後、蛍光画像が得られた。単一の微小管は647ナノメートルチャネルの蛍光シグナルによって同定されたが、微小管は両方のチャネルで蛍光シグナルを示したときに予め形成された束として同定された。単一微小管およびPRC1架橋束のダイナミクスをタンパク質KIF4AおよびCLASP1の存在下で研究し、単一微小管がアッセイの過程で伸長する一方で、架橋微小管の成長が停止することが明らかになった。重合した微小管を室温以上に保つように注意してください。可溶性チューブリンを氷上に保管し、イメージングチャンバーと蛍光標識された微小管およびタンパク質を光から保護します。これらのアッセイは、有糸分裂紡錘体で見つかったタンパク質モジュールが、紡錘体内に共存する2つの異なる微小管集団のダイナミクスを差動的に調節する方法についての機構的洞察を提供しました。

simultaneous-visualization-dynamics-crosslinked-single-microtubules

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。...

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、高コントラスト分解能と時間分解能で細胞表面に近い構造を観察するための強力なアプローチです。我々は、全反射は、細胞壁で囲まれた細菌や真菌細胞の皮質でのタンパク質のダイナミクスを研究するために用いることができる方法を示しています。...

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

このビデオでは、アクチンと微小管の重合ダイナミクスを視覚化するための全反射顕微鏡ベースの手法であるTIRFについて説明しています。この手法により、細胞のクロストークを理解するために不可欠な、アクチンと微小管の結合ダイナミクスをリアルタイムで高解像度でイメージングできます。...

アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

このビデオでは、適切なバッファーの存在下でカバースリップ表面に成長する微小管を視覚化する干渉反射顕微鏡(IRM)技術について説明します。入射光で照らすと、カバースリップ-バッファー界面とバッファー-微小管界面が光を反射し、これが組み合わさって干渉パターンを形成することで、明るい背景に対して微小管を高コントラストの画像として視覚化できます。...

微小管ダイナミクスのラベルフリー可視化のための干渉反射顕微鏡法

クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、シグナル伝達受容体を含む多くのタンパク質を内部化する急速で非常に動的なプロセスです。ここで説明するプロトコルは、個々のエンドサイトーシスイベントの動態を直接視覚化します。これは、エンドサイトーシス機構のコアメンバーがどのように互いに協調し、タンパク質カーゴがこのプロセスにどのように影響するかを理解するために不可欠です。...

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

出芽酵母は、その強力な遺伝学とその微小管細胞骨格のシンプルさにin vivoでの微小管ダイナミクスを研究するための有利なモデルです。以下のプロトコルを変換し、培養酵母細胞、共焦点顕微鏡画像を取得し、かつ定量的に酵母生細胞における微小管ダイナミクスを分析する方法について説明します。...

出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

高速・高分解能を可能にする高度な顕微鏡分離膜と周囲の細胞内のボリュームの両方の画像が表示されます。1 つのセットアップでディスクと全反射蛍光顕微鏡を回転の統合により、3.5 まで高い獲得率でライブ...

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

このプロトコルは、インビトロ表面アッセイを用いて微小管の無標識、高コントラスト、高速イメージングのための標準的な蛍光顕微鏡上の干渉反射顕微鏡を実装するためのガイドです。...

微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。...

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

ここでは、微小管束を in vitroで...

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

このプロトコルは、 in vitro 全内部蛍光(TIRF)顕微鏡アッセイを使用して動的アクチンおよび微小管を視覚化するためのガイドです。...

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

学ぶTIRF顕微鏡を用いたインビトロ微小管ダイナミクス可視化法。単一微小管と架橋小管の動態を同時観察し、微小管関連タンパク質の集団的活動を解析します。細胞生物学・神経科学研究に有用です。

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