TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

細胞微小管アレイは、機能に必要な明確な動的特性を有する微小管の部分集団を含む。このプロトコルは、規制当局の集団的活動が近位微小管亜集団に明確な特性をどのように与えるかを扱っている。このボトムアップ型反発アッセイにより、単一の微小管や束などの近位微小管集団の組織とダイナミクスを同時に可視化し、自己組織化の根底にあるメカニズムを解読することができます。

多成分再構成では、pH、イオン強度、タンパク質濃度などの実験パラメータを最適化しながら、それぞれの活性を維持する必要があります。マルチタンパク質アッセイ前の個々の成分の体系的な分析は非常に役立ちます。まず、1マイクロリットルの微小管溶液中の4.5マイクロリットルのBRB ADDTTの混合物を顕微鏡スライド上にピペットでピペットする。

18 x 18ミリメートルのカバースリップで覆い、透明なマニキュアまたはVALAPシーラントでエッジをシールします。TIRF 目標をカバースリップの下に配置します。明るい混合物中の蛍光標識されたチューブリンに適した波長で新しく重合された微小管を視覚化し、今後の実験で使用する微小管の希釈を決定する。

すべての蛍光タンパク質が照射されるが、実験の経時的経過にわたって有意な光退色を受けないように、実験のレーザー強度を経験的に決定する。顕微鏡の温度を摂氏 28 度に設定して、動的な微小管を表示します。レンズ紙を使用して、70%エタノールで100倍の対物レンズをきれいにします。

フィルターキューブと発光フィルターの最適な組み合わせは、画像化する蛍光チャンネルに応じて使用します。イメージングシーケンスを設定します。647ナノメートルのフルオロフォア標識ビオチン化微小管、560ナノメートルのフルオロフォア標識非ビオチン化微小管、および目的のGFP標識タンパク質を用いた実験では、488ナノメートル、560ナノメートル、および647ナノメートルのチャネルを10秒ごとに20分間画像化します。

可溶性チューブリンおよび微小管関連タンパク質を添加する前のバンドルの参照画像をキャプチャするには、560ナノメートルおよび647ナノメートルの波長チャネルにそれぞれ1つの画像を持つ配列を設定します。顕微鏡の上の天井のレーザービームの位置を確認し、ソフトウェアを使用してビームに変更を加えます。レーザーイルミネーターの位置が揃っていることを確認します。

イメージングの前に、顕微鏡浸漬オイルを対物レンズに一滴加えます。氷の上に保ちながら可溶性チューブリン混合物を調製し、混合物をスピンダウンする。ビオチン-ニュートラアビジン-ビオチン結合を介して微小管を固定化するために、チャンバーが充填されるまで約7.5マイクロリットルのニュートラアビジン溶液を最初に流し、5分間インキュベートする。

10マイクロリットルのMBの寒さで洗う。7.5マイクロリットルのブロッキングタンパク質KCを流し込み、2分間インキュベートする。10マイクロリットルのMBを温めて洗浄し、微小管の導入のためのチャンバーを準備する。

ビオチン化微小管のストックをBRB ADDTTで希釈し、この希釈液の1マイクロリットルを9マイクロリットルのMBに温める。混合物をチャンバーに流し、10分間インキュベートする。10マイクロリットルのMBの温かい状態で非固定化微小管を洗い流す。

7.5マイクロリットルの温かいKCをチャンバーに流し、2分間インキュベートする。インキュベーションの間、KC中の架橋またはタンパク質PRC1の2ナノモル溶液を調製し、溶液をスピンダウンする。この溶液10マイクロリットルをイメージングチャンバに流し、5分間インキュベートする。

バンドルを作るには、10マイクロリットルの非ビオチン化微小管をチャンバーに流し、10分間インキュベートする。10マイクロリットルのMBの温かくチャンバーを2回洗浄する。10分間のインキュベーション時間の間に、目的のタンパク質、可溶性チューブリン、ヌクレオチド、脱酸素剤、および抗酸化物質を含むアッセイ混合物10マイクロリットルを調製し、それをスピンダウンする。

混合物を氷の上に保管する。準備したイメージングチャンバをスライドホルダーにテープで固定し、100X TIRF対物レンズにロードします。560 ナノメートルおよび 647 ナノメートルのチャネルを使用して、単一の微小管およびバンドルの最適な数と密度を含む視野を見つけます。

視野が特定されたら、参照画像を撮影します。アッセイ混合物を、画像化チャンバを乱すことなく注意深く流す。チャンバーの開放端をVALAPシーラントでシールします。

微小管を観察し、イメージングシーケンスを開始します。微小管種子を固定化し、バンドルを生成した後、蛍光画像が得られた。単一の微小管は647ナノメートルチャネルの蛍光シグナルによって同定されたが、微小管は両方のチャネルで蛍光シグナルを示したときに予め形成された束として同定された。

単一微小管およびPRC1架橋束のダイナミクスをタンパク質KIF4AおよびCLASP1の存在下で研究し、単一微小管がアッセイの過程で伸長する一方で、架橋微小管の成長が停止することが明らかになった。重合した微小管を室温以上に保つように注意してください。可溶性チューブリンを氷上に保管し、イメージングチャンバーと蛍光標識された微小管およびタンパク質を光から保護します。

これらのアッセイは、有糸分裂紡錘体で見つかったタンパク質モジュールが、紡錘体内に共存する2つの異なる微小管集団のダイナミクスを差動的に調節する方法についての機構的洞察を提供しました。