マウス血清中の試験ワクチンに対する免疫グロブリンGレベルの測定

テストワクチンでコーティングされたマルチウェルプレートから始めて、非特異的相互作用部位をブロックします。

試験ワクチンを注射したマウスから血清サンプルを採取します。

この血清には、試験ワクチンを認識する免疫グロブリンG(IgG)抗体が含まれています。

ワクチンでコーティングされたウェルに、連続希釈した血清サンプルを追加します。

IgGはワクチンに結合します。結合していない抗体を洗浄して除去します。

IgGに結合するペルオキシダーゼ結合二次抗体を追加します。結合していない二次抗体を除去します。

色基質を追加します。ペルオキシダーゼは基質と相互作用し、青色の生成物を生成します。

酸を導入して反応を止めます。pHが変化すると、溶液が黄色に変わります。

分光光度計を使用して、各ウェルの色の強度を測定し、血清サンプル中の IgG 濃度を測定します。

酵素結合免疫吸着アッセイ、またはELISAプレートの抗原コーティングの場合、HIタンパク質抗原をコーティング溶液で1ミリリットルあたり10マイクログラムに希釈し、ELISAプレートにウェルあたり100マイクロリットルの希釈抗原を加えます。プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、ウェルあたり300マイクロリットルのPBSTでプレートを洗浄します。

あたり300マイクロリットルのシーリング溶液で、摂氏37度で2時間ウェルを密閉します。次に、297マイクロリットルのPBSTを加えて、各実験群のマウス血清3マイクロリットルを100倍に希釈し、希釈した血清をボルテックスします。各血清サンプルについて、コーティングされたELISAプレートにウェルあたり100マイクロリットルの希釈血清を加えます。同様に、4マイクロリットルのポジティブまたはネガティブコントロール血清を396マイクロリットルのPBSTに加え、ボルテックス混合することにより、ポジティブおよびネガティブコントロール血清をPBSTで100倍に希釈します。

倍比率希釈を実行するには、以前に希釈した実験血清200マイクロリットルをコーティングされたELISAプレートの最初の列に加えます。次に、1行目と12行目を除くすべてのウェルに100マイクロリットルのPBSTを追加します。次に、ピペットガンを100マイクロリットルに調整し、100マイクロリットルの血清をPBSTを含む1列目から2列目に移します。

ピペットガンを使用して、2列目の内容物を10回混合します。同様に、11行目まで血清を1:2で連続して希釈します。完了したら、11行目から100マイクロリットルの液体を捨てます。

サンプルテンプレートに従って、100マイクロリットルの希釈した陰性血清と陽性血清を、12行目の対応する各ウェルに加えます。ELISAプレートをラップで密封し、摂氏37度で1時間インキュベートします。一方、PBSTを添加して二次抗体抗マウスIgG HRPを10,000倍に希釈します。1時間のインキュベーション後、ELISAプレートをウェルあたり300マイクロリットルのPBSTで洗浄し、結合していない抗体を洗浄します。次に、希釈した二次抗体を100マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で40分間インキュベートします。

ウェルあたり300マイクロリットルのPBSTでプレートを洗浄します。次に、100マイクロリットルのTMB発色液を各ウェルに加えます。プレートを摂氏37度で、光から10分間離します。その後、50マイクロリットルの2モル硫酸ですぐに反応を終了します。終了後15分以内に酵素マーカーを使用して、450ナノメートルの光学密度またはOD値を検出します。