Name: 合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 学ぶアルカンチオールで保護された金ナノ粒子（MPC）の合成と薄膜組立手法。Pseudomonas aeruginosa azurinなどの酸化還元タンパク質の単分子層電気化学解析に応用し、電子伝達動態を詳細に解明する革新的な方法です。

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我々は感謝して国立科学財団（CHE - 0847145）、と寛大にこの研究を支援するためのヘンリードレフュス教師学者賞プログラムを認めます。我々は、特にクリスティンデイビス、断面像と彼女の援助のためのリッチモンドの大学で生物学教室の顕微鏡とイメージングのディレクターを認識したいと思います。特別な感謝は、博士に与えられます。 T.レオポルド、R.カンテール、D.ケロッグ、R.ミラー、およびW.ケース、ならびに、ラスコリンズ、フィルジョセフ、キャロマークス、マンディマロリーとジョンWimbush - すべての大学で可能な学部生の研究を行うリッチモンドの。ありがとう非常に個人的にはレオポルドリサーチラボ内のすべての現在、過去、そして未来の学部の研究者に与えられます。

1。 Hexanethiolate単層保護された金クラスターの合成 Hexanethiolate官能性単分子膜保護金クラスター（MPCはは）のように、金225（C6）75の平均構造を生成するために金のモル比は2:1 1 -ヘキサンチオール（C6）。ブラスト反応〜4-9特定の変更に従って合成されています配位子の種類、特定のチオールから金の比率、温度、および反応の配信速度、または合成後の治療、9-11、それぞれ、さまざまなコアのサイズと機能的な保護基でのMPCの多様な範囲を得ることができる4。MPCの近似（様々なアルカンチオール基で官能化されたMPCはの平均）組成物は、プロトン（1 H）ヨウ素分解試料の核磁気共鳴（NMR）分析により決定することができます。 <ol><li>適切なヒュームフードの換気でトルエン30mLに1.1グラムのtetraoctylammoniumブロマイド（TOABrを）溶かす。 </li><li> 18MΩultrapurified水（H 2 O UP）の〜20mLに0.38グラムの水素化ホウ素ナトリウム（NaBH 4の ） を溶解し、少なくとも30分間氷上で冷やしすることができます。 </li><li> UP H 2 Oの〜20mLに0.31グラムの水素テトラクロロ（HAuCl 4）溶解し、定量的なソリューションの混合物は、追加を使用してTOABr -トルエン溶液に移す〜UP、H 2 Oの5 mLを水、金に相転移するために、非水溶液への解決策。濃いオレンジ水溶液と明確な非水性相がよく混合されるように、軽く30分間蓋をしながら厳密にかき混ぜる。 </li><li>分液漏斗に透明な水性と濃いオレンジ色水系相の両方を転送する。きれいなフラスコに非水系（上）層水（底部）層をデカントして捨てます。 </li><li>非水溶液へHAuCl 4 2:1の割合でC6を追加。赤みがかったオレンジ色から淡黄色、ほぼ無色の溶液に色の変化によって検出されたとして、金（I）ポリマーを形成するために30分間かき混ぜる。 </li><li> 〜0℃で撹拌しながら、少なくとも30分間絶縁氷浴とチルに反応混合物を移す。 </li><li>定量的かつ迅速に瞬時に添加時のMPCの太い黒色の溶液を形成し、チオールの存在下で金属の金へのAu（I）を軽減するために反応混合物に冷却したNaBH 4の溶液を添加する。 0℃で一晩反応をかき混ぜる</li><li> 、分液ロートに反応混合物を譲渡する廃棄物のビーカーに水（底面）層を破棄し、フラスコ内の重い黒い汚泥を残してほぼ完全乾燥するまで非水系（上）トルエン層を蒸発させるロータリー。 </li><li>アセトニトリルを追加し、一晩座ってできるようにすることで、MPCのを沈殿させる。 </li><li>アスピレーターでゴム継手とサイドアームフラスコに培地多孔性のガラスフリットを使用して真空濾過によってのMPCを収集し、アセトニトリルのおびただしい量ですすいでください。 </li><li> 、空気乾燥へのMPCを許可する透過型電子顕微鏡（TEM）およびNMR分析により特徴づける、製品の重量を測定し、将来の使用のために頂いた店。ドロップキャスティングのMPCは銅グリッド（400メッシュ）上formvar /カーボン支持膜上にトルエンに溶解し、80から100 kVでTEM装置を動作させることでTEM像を入手。平均コアサイズは、そのようなイメージJ（フリーウェア）などの画像解析ソフトウェアを使って推定することができます。 </li></ol> 2。フィルムアセンブリ：タンパク質単分子層の電気化学のためのジチオールリンクされたMPCの映画アセンブリ金基板は、最初の電気化学的に最終的にはジチオールリンクされたMPCのフィルムのアセンブリを形成するために数回繰り返される"ディップサイクルを、"補うためにジチオールリンク分子とC6変更のMPCのソリューションを交互に浸漬する前に洗浄し、C6 SAMで修飾されている。として緑膿菌アズリン（AZ）タンパク質が優雅にライス大学とアリゾナ州の博士コーリーウィルソンによって与えられたため、元のプラスミドはドクタージョナサン、リッチモンド教授の大学で精製し、凍結乾燥粉末として提供されていた2、先行研究で説明その後、紫外可視（UV - VIS）の分析によって検証として5〜10μmのソリューションを作成、4.4 mMリン酸カリウム緩衝液（KPB、pHは= 7.0、μ= 10 mM）で再水和したDattelbaum、。 <ol><li>第一ルーサイトのリテーナプレート、作用電極、作用電極、金に真鍮の電気接点、電極面積を定義する最初のゴム製ガスケット、バイトンO -リングなどの金基板：下から上へ、次の順序で電気化学（EChemを）サンドイッチセルを組み立て（0.32 cm 2）を、ガラスの細胞体、第二ゴムのガスケット、もうルーサイトのリテーナープレート。セル全体がねじ山付きロッドによって一緒に保持し、慎重にウィングナットを締めている。セルは、1 M飽和KCl、Ag / AgCl参照線、および白金補助電極のワイヤーでガラスバレルを収納する、市販の参照電極が装備されています。 </li><li>電気化学的にきれいな目100℃0.2〜0.9 V、0.2〜1.2 V、0.2〜1.35 Vの潜在的な窓でサイクリックボルタンメトリー（CV）を実行することにより電子の金基板（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）0.1の溶液中mVの/ sのMH 2 SO 4、0.01 M KClを。 </li><li> 0.1〜0.4 V（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）100でスキャンKPBでMV / sの1破棄KPBの電位窓を含む"標準的な条件、"でCVを行うことにより、洗浄裸の金基板の充電電流を測定し、すすぎ逐次UP H 2、H 2 O UP O、エタノール（EtOH）、、及びEtOHで。 </li><li> EtOH中5mMのC6のソリューションの〜300μlに洗浄金基板を公開し、注文したC6 SAMを形成するために一晩座ってすることができます。セルからC6の液を捨て、H 2 O UPエタノール、エタノール、およびUP H 2 Oで連続的に洗い流し</li><li>標準条件でのSAMの充電電流を測定します。 KPBを破棄し、H 2、H 2 O UP O、エタノール、およびエタノールUPで連続的に洗い流してください。充電電流は著しく裸の金の測定（ステップ2.3）のそれから減少させるべきである。1 </li><li> EtOH中5mMの1,9 - nonanedithiol（NDT）ソリューションの〜300μlにSAM修飾金基板を公開し、C6 SAM内の分子を結びつけるinterdisperse NDTに1時間放置することができます。 NDTの液を捨て、H 2 O UP H 2 O、エタノール、および塩化メチレン（CH 2 Cl 2）をアップ、EtOHで連続して、よくすすぐ。 </li><li>ゆっくりと1時間のためにN 2ガ ​​スでバブリングすることにより攪拌しながらCHのMPC溶液を2 Cl 2中 （〜1 mg / mLの）に金基板を公開。必要に応じて、より多くのCH 2 Cl 2で蒸発MPCソリューションを交換してください。これはフィルムのアセンブリのアンカーMPCの層です。 MPCの液を捨て、再びCH 2 H 2 O UP Cl 2の 、、とKPBで連続してすすいでください。 </li><li>標準条件でのMPCの層の充電電流を測定します。 KPBを破棄し、UP H 2 OとCH 2 Cl 2で連続してすすいでください。 </li><li>ゆっくりと20分間N 2ガ ​​スでバブリングすることにより攪拌しながらCHの5mM NDTソリューション2 Cl 2中の〜300μlのために金基板を公開。 </li><li> NDTを破棄し、CH 2 Cl 2でよくすすぐ。フィルムのアセンブリの第2 MPCの層を堆積するステップ2.7および2.8を繰り返します。 </li><li>追加のMPCの層を堆積させるために、手順2.9、2.10繰り返されます。各追加のMPCの層と充電電流の増加に対応が観察される。 </li><li>ネットワーク化されたMPCのフィルムが完了​​すると、KPBと基板改質膜をすすいでください。 AZのタンパク質は、EChemをサンドイッチセルにKPBの5〜10μMAZソリューションの〜150μLを注入し、蓋をし、少なくとも1時間冷蔵座ってできるようにすることで、MPCのフィルムのアセンブリに吸着される。 </li><li>冷蔵庫からEChemをセルを削除し、それが室温近くに戻ることができます。徹底的に10分間N 2ガ ​​スとKPB、KPBを補充EChemをセル、およびバブルKPBですすいでください。 </li><li>タンパク質単分子層の電気化学的研究が0.25 -0.25 Vから潜在的なウィンドウのCVとして実行されるV（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）100でスキャンしたMV / KPBの秒。 </li></ol> 3。フィルムアセンブリ：オプティカルトラッキングのためのジチオールリンクされたMPCの映画アセンブリ前の光学的評価のための成長MPCフィルム、スライドグラスのセクションピラニア溶液（注意2時01濃H 2 SO 4とH 2 O 2）であらかじめ洗浄とで処理している（3 -メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（3 - MPTMSへ）1-2 MPC膜は、その後、以前に上記のような"ディップサイクル"技術を使用して、これらの修正されたスライドガラス上に組み立てています。 <ol><li> CH 2 Cl 2で3 MPTMS変更したスライドガラスをリンスし、低速でシェーカーで攪拌しながらCH 2のMPCソリューションCl 2の （〜1 mg / mL）は1時間に入れてください。これは、シランのメルカプタンの末端基にMPCはアンカリングによる膜アセンブリの最初のMPCの層を完了します。 CH 2 Cl 2で完全にスライドをすすぎ、およびN 2ガ ​​スで乾燥させます。スライドの紫外可視スペクトル（400から1000nmから）取る、そしてCH 2 Cl 2で、再度洗い流す。 </li><li>低速でシェーカーで攪拌しながら1時間CH 2 Cl 2中の5mM NDTソリューションでスライドを置きます。 CH 2 Cl 2でスライドを洗浄します。 </li><li>低速でシェーカーで攪拌しながら1時間、MPCの溶液中でスライドを置きます。これはフィルムのアセンブリの第2 MPCの層を完了します。 CH 2 Cl 2を 、N 2ガ ​​スと乾燥で十分にスライドをすすぎ、およびスライドの紫外可視スペクトル（400から1000nmから）を取る。追加のMPCの層がフィルムのアセンブリに吸着されるスペクトル全体吸光度は増加する必要があります。 </li><li>追加のMPCの層を堆積させるために、STEPS 3.2から3.3までが繰り返されます。 </li></ol> 4。単分子膜のキャラクタリゼーションは、断面透過型電子顕微鏡による金クラスターのフィルムアセンブリを保護 TEM断面が顔の埋め込 ​​み膜EN RE -埋め込 ​​むことによって調製される。2、12これは、最初にきれいな、標準的な顕微鏡の上に3 - MPTMS改質ガラススライド上に組み立てられたMPCのフィルムを取り付けることによって行われるために可能にするために埋め込 ​​む812エポキシ樹脂を使用してスライド以下の手順の実行中に処理を改善。より高い温度は、フィルム内のMPCを分解するように適用される熱で、十分に注意してください。 <ol><li>ミックスは812エポキシ樹脂を埋め込み、少なくとも12時間太くすることができます。 </li><li>エポキシ樹脂との"00"BEEMカプセルを記入し、MPCのフィルムのサンプル（セクション3で調製した）の上に反転させる。バブルは、カプセルの上部に上昇するようにカプセルの上に置いて圧力、エポキシ樹脂とMPCのフィルムのサンプルの間にシールを作成する。 60歳で少なくとも18時間重合することを許可° Cとし、室温にマウントされているスライドを冷却する。 </li><li>熱は、接続されているMPC 専用の顔のフィルムでブロックの除去を容易にするために200℃アルミダイキャスト、ホットプレート上で20秒間スライドをマウント。 </li><li>宝石商の鋸を使用してBEEMカプセルブロックからフィルムを含むサンプルをカット。 </li><li>よくシリコンの内部に直面してまでMPCフィルム側にシリコンフラット型で取り外した部分を再度埋め込む。室温でエポキシ樹脂と、シリコンを充填し60℃で少なくとも18時間重合することができます℃まで室温に試料を冷却する。 </li><li>ナイフのエッジに対して垂直にセクションをカットするダイヤモンドナイフを使用してライカUCTウルトラミクロトームを60から80 nmの薄いサンプルのセクションを取得します。 </li><li>場所は銅グリッド（400メッシュ）上formvar /カーボン支持膜上のセクションをスライスし、MPCのフィルムのアセンブリの準備断面のTEM像を取る。 </li></ol> 5。代表的な結果： <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig1.jpg"> 5浸漬サイクル（MPC及びNDTソリューションへの露出を交互）の合計MPC膜成長の電流監視を充電1ダブルレイヤー図 。充電電流は、（図2）フィルムへのMPCの"レイヤー"を追加し、各浸漬サイクルを体系的に増加した。サイクリックボルタモグラムは0.1〜0.4、4.4 mMリン酸カリウム緩衝液では100 mV / sの液（pH = 7.0、μ= 10 mm）でのスキャンV（対Ag / AgCl電極、KClを）電位窓を用いて収集した。 ML Vargo、CP Gulka、JK Gerig、CM Manieri、JD Dattelbaum、CBマークス、NTローレンス、ML Trawick、およびMCレオポルド、 ラングミュア26（1）、560〜569から許可を得て転載。著作権2010 American Chemical Societyの。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig2.jpg"> 図2ジチオール架橋MPCのフィルムのアセンブリに吸着AZ蛋白質の（）模式図。 （b）のMPCフィルムアセンブリに吸着AZの典型的なサイクリックボルタモグラムは、Vが（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）4.4 mMのリン酸カリウム緩衝液（pH = 7.0では100 mV / sでスキャン-0.25から0.25への潜在的なウィンドウを使用して収集μ= 10 mM）を。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig3.jpg"> 図3代表的な3 - MPTMS修正されたスライドガラス上にジチオール架橋MPC膜成長の紫外可視スペクトルのモニタリング。ディップのサイクルは、リンカのソリューションは、MPCのソリューションへの暴露を続けてNDTにスライドガラスの露出で構成されています。膜厚の成長と同時吸光度増加の後続の各​​ディップ結果。ディップサイクルの数が増えるにつれて、表面プラズモンのバンドは徐々に〜520nmで定義されています。 ML Vargo、CP Gulka、JK Gerig、CM Manieri、JD Dattelbaum、CBマークス、NTローレンス、ML Trawick、およびMCレオポルド、 ラングミュア26（1）、560〜569から許可を得て転載。著作権2010 American Chemical Societyの。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig4.jpg"> ジチオールリンクされたMPCのフィルムのアセンブリの図4透過電子顕微鏡（TEM）断面画像解析。挿入図：フィルムのアセンブリで使用されているhexanethiolate官能基のMPCの代表的なTEM像。 TEM分析は、画像Jの分析を用いて〜2 nmとするのMPCの平均金のコア径を決定する。 ML Vargo、CP Gulka、JK Gerig、CM Manieri、JD Dattelbaum、CBマークス、NTローレンス、ML Trawick、およびMCレオポルド、 ラングミュア26（1）、560〜569から許可を得て転載。著作権2010 American Chemical Societyの。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

タンパク質の単分子層の電気化学は酸化還元蛋白質と合成吸着プラットフォーム間の相互作用を研究するために使用される有効な手法です。この戦略の有効性は、しかし、分子レベルの制御性の高い吸着インタフェースを設計する能力に依存しています。このプロトコルによって作成されたMPCベースのプラットフォームは、より均質なタンパク質吸着環境3を提供し、alkanethiolateのSAMを採用した従来のPMEのシステムに比べより大きな距離2を介してETを容易にすることができる特別に設計されたプラットフォームを表します。電気インタフェースとしてMPCのフィルムのアセンブリの強度だけでなく、異なるサイズや表面化学/機能、さまざまなナノ材料、および別の電極構成の他の酸化還元タンパク質にその汎用性と適応性です。例えば、説明する手順は、容易にアセンブリに組み込まMPCはの最も外側の層上に、単純な位置交換反応を用いてシトクロム c（CYT C）のET研究するように構成されている11 CYT cはカチオン性であり、基質に結合することができるように静電気的に、カルボン酸末...

<table border="1"><tr><th>試薬と装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> Tetraoctylammonium臭化</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 294136 </td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 213462 </td></tr><tr><td>水素テトラクロロ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 254169 - 5G </td></tr><tr><td> 1 - ヘキサンチオール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 234192 </td></tr><tr><td>透過電子顕微鏡</td><td> JEOL </td><td> 1010 </td></tr><tr><td>核磁気共鳴分光装置</td><td>ブルカーアヴァンセ</td><td> 300 MHzの</td></tr><tr><td>銅グリッド（400メッシュ）上Formvar /カーボン支持膜</td><td>電子顕微鏡学</td><td> FCF400 - Cu系</td></tr><tr><td>金基板</td><td>蒸発した金属フィルム（株） </td><td>カスタム</td></tr><tr><td> Ag / AgCl参照電極</td><td>微小電極、（株） </td><td> MI - 401F </td></tr><tr><td>ポテンショスタット</td><td> CHインスツルメンツ株式会社</td><td> CHI650A、CHI610B </td></tr><tr><td> 1,9 - Nonanedithiol </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> N29805 </td></tr><tr><td> （3 - メルカプトプロピル）トリメトキシシラン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 175617 </td></tr><tr><td>紫外可視分光光度計</td><td>アジレント</td><td> 8453 </td></tr><tr><td> 812エポキシ樹脂を埋め込む</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 14120 </td></tr><tr><td> &quot;00&quot;BEEMカプセル</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 70000 - B </td></tr><tr><td>シリコンフラット型</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 70900 </td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ</td><td> Diatome </td><td> 21 - ULE、S12801 </td></tr></table>

合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

金コロイドは、タンパク質の単分子膜の電気化学（PME）の吸着のプラットフォームとして機能フィルムのアセンブリに合成され、その後に組み込まれている単分子膜保護金クラスター（MPCは）と呼ばれるalkanethiolate配位子で保護されたナノ粒子。 PMEは、電子伝達（ET）反応の酸化還元パートナーとして機能する修飾電極、少なくとも吸着プラットフォームにそれらを制限することで酸化還元タンパク質の電気化学的特性を研究するためのモデル系として利用されている。研究は、このような性質の金ナノ粒子膜のアセンブリは、より均質なタンパク質吸着の環境を提供し、アルカンチオール自己組織化単分子膜（SAM）で修飾された従来のシステムに比べて距離依存せずにETを促進することが示されている。本論文では1-3、のMPCをhexanethiolateリガンドで官能化されたが変更されたブラスト反応4を用いて合成し、紫外可視（UV - VIS）分光法、透過型電子顕微鏡（TEM）、およびプロトン（1 H）核磁気共鳴（NMR）で特徴付けられる。 MPCのフィルムは、MPCの層とジチオールリンク分子を交互の&quot;ディップサイクル&quot;メソッドを使用してSAM修飾金電極のインターフェイス上で組み立てられます。金電極での膜成長は、システムの充電電流二重層の変化を測定することにより電気化学的に追跡されます。シラン改質ガラススライド上に組み立てられた類似した膜は、膜成長及び断面TEM解析の光学的モニタリングを可能に推定膜厚が用意されています。フィルムのアセンブリの間に、MPCの配位子の保護だけでなく、粒子間のリンク機構の操作は、別の吸着機構を有する酸化還元蛋白質とのインタフェースに、容易に適応可能なネットワーク化されたフィルム、を可能にする。例えば、 緑膿菌アズリン（AZ）はhexanethiolate MPCとシトクロム c（CYT C）MPC界面層を変更したカルボン酸で静電的に固定化することができるのジチオール架橋フィルムに疎水性吸着させることができる。このレポートでは、我々は排他的にAZのシステムのためのフィルムのプロトコルに焦点を当てる。 MPC変更された合成プラットフォーム上のタンパク質の吸着を伴う調査では、生体分子と人工材料との相互作用の理解を深める、その結果、バイオセンサー方式、ETモデリングシステム、及び合成生体適合性材料の開発を支援することができます。5-8

単分子層保護のクラスタ（MPCは）として知られているAlkanethiolate安定化金コロイドは、合成の特徴、とのような単純な酸化還元蛋白質の蛋白質の単分子層の電気化学のための吸着インタフェースなどの薄膜に組み立てられる<em&gt;緑膿菌</em&gt;アズリン（AZ）とシトクロム<em&gt; C</em&gt;（CYT<em&gt; C</em&gt;）。

モノレイヤー保護金クラスター（MPC）と呼ばれる、アルカンチオレートリガンドで保護されたコロイド金ナノ粒子を合成し、その後...

本実験の全般的な目的は、モノレイヤー保護クラスター（MPC）として知られるアルキル化安定化金ナノ粒子を合成し、これらの材料をアズリンタンパク質モノレイヤー電気化学の吸収界面として用いられる薄膜アセンブリに構築することです。これはまず、金コロイドを有機リガンドで保護し、アルカンチオール膜に囲まれた金ナノ粒子を作成することで達成されます。次に、MPCを金およびガラス基板に固定し、共有結合で連結された薄い多層膜へとネットワーク化させ、その成長を光学測定、電気化学的測定、および断面顕微鏡観察によって追跡します。次に、電子伝達タンパク質であるazarinを界面に吸着させ、タンパク質単分子層の電気化学測定のためにサイクリックボルタンメトリーを行います。その結果、この手順で作成されたMPCフィルム界面は、MPCフィルムに基づいた吸着タンパク質のより最適化された電気化学的分析を可能にし、より均一な吸着界面と、従来の距離依存性のない高速な電子伝達キネティクスを提供することが示されました。従来のタンパク質電気化学に対する本手法の主な利点は、ナノ粒子フィルムで修飾された電極が、サイクリックボルタンメトリーで測定されるより理想的な電気化学的挙動をもたらす吸着界面を提供することにあります。合成過程には重要な視覚的指標が含まれており、また膜の構築と評価には複雑な工程と分析手法が多数含まれているため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。NPC膜は、MPC層と二価連結分子を交互に用いるディップサイクル法により、修飾金電極またはガラススライド上に構築できます。これにより、これらの層を電気化学的または光学的に追跡し、目的の膜厚まで制御することが可能です。適切な換気設備を備えた・ドラフトチャンバー内で金クラスターを合成するには、まず1.1 gのテトラオクチルアンモニウムブロミドを30 mLのトルエンに溶解します。次に、0.38 gの水素化ホウ素ナトリウムを約20 mLの18 MΩ超純水に溶解し、氷上で少なくとも30分間冷却します。続いて、テトラクロロ金酸水溶液を、さらに5 mLの超純水を用いてテトラオクチルアンモニウムブロミドのトルエン溶液に定量的に移します。水相の金溶液を非水相へ相転移させるため、軽く蓋をして30分間激しく撹拌します。これにより、濃いオレンジ色の水相と透明な非水相が十分に混合されます。透明な水相と濃いオレンジ色の非水相の両方を分液漏斗に移します。水層を廃棄し、非水層を清潔なフラスコに分注します。テトラクロロ金酸を含む非水溶液に、C6を2:1の比率で加えます。30分間撹拌し、溶液の色が赤橙色から淡黄色またはほぼ無色に変化することで確認される金(I)ポリマーを形成させます。反応混合物を断熱氷浴に移し、撹拌しながら0 °Cで少なくとも30分間冷却します。その後、チオール存在下で金(I)を金属金に還元するため、冷却した水素化ホウ素ナトリウム溶液を定量的に、かつ迅速に反応混合物へ加えます。添加すると、直ちに単分子層保護金クラスター（MPC）の濃い黒色の溶液が形成されます。翌日、0 °Cで一晩撹拌してください。その後、反応混合物を分液漏斗に移します。水層を廃棄用ビーカーに捨て、エバポレーターで処理します。非水層のトルエンをほぼ完全に乾固させ、フラスコ内に濃い黒色のスラッジが残るまで蒸発させます。アセトニトリルを加えてMPCを沈殿させ、中孔径のガラスフィルター（ゴム継手付き）とアスピレーターを備えた側arm付きフラスコを用い、一晩静置します。真空ろ過によりMPCを回収し、大量のアセトニトリルで洗浄します。サンドイッチ型セルを電気化学的に組み立てた後、0.1 M硫酸および0.01 M塩化カリウム溶液中において、走査速度100 mV/sで0.2〜0.9 V、0.2〜1.2 V、および0.2〜1.35 Vの電位窓でサイクリックボルタンメトリー（CV）を行い、金基板を洗浄します。洗浄した裸の金基板の二重層充電電流を、リン酸カリウム緩衝液（KPB）中、銀/塩化銀参照電極に対して0.1〜0.4 Vの電位窓、走査速度100 mV/sの標準条件下でCVを行い測定します。バッファーを廃棄し、超純水とエタノールで十分に2回洗浄します。洗浄した金基板に5 mMのC6エタノール溶液を約300 µL加え、一晩静置して秩序だったC6 SAMを形成させます。セルからC6溶液を廃棄し、エタノールと超純水で十分に2回洗浄します。標準条件下でSAMの充電電流を測定します。KPBを廃棄し、超純水とエタノールで十分に2回洗浄します。これにより、充電電流が著しく減少することが確認されるはずです。裸金での測定後、SAM修飾した金基板を5 mMのNDTエタノール溶液約300 µLに浸し、C6 SAM内にNDT連結分子を分散させるため1時間静置します。NDT溶液を廃棄し、エタノールと超純水で十分に入念に2回すすぎ、その後ジメチルジメチル甲烷で1回すすぎます。金基板をジメチルジメチル甲烷を用いたMPC溶液に浸し、窒素ガスをゆっくりとバブリングして撹拌しながら1時間処理します。これは膜アセンブリのアンカリングMPC層です。MPC溶液を廃棄し、ジクロロメタン、超純水、およびKPBで順次洗浄します。標準条件下でMPC層の充電電流を測定します。KPBを除去し、超純水とDIAM methaneで十分に洗浄します。金基板を5 mMのNDT/DIAM methane溶液約300 µLに浸し、窒素ガスをゆっくりとバブリングして撹拌しながら20分間静置します。NDT溶液を除去し、DIAM methaneで十分に洗浄して、2層目のMPC層を堆積させます。フィルムアセンブリをDIAMメタンのMPC溶液に再度浸漬し、窒素ガスをゆっくりとバブルさせて攪拌しながら1時間静置させ、その前に洗浄を行います。その後、標準条件下でMPC層の充電電流を再度測定し、同様の手順で再び洗浄します。必要に応じて、さらにMPC層を堆積させてください。ネットワーク化MPCフィルムが完成した後、KPBで修飾基板を洗浄し、MPCフィルムアセンブリにAZタンパク質を吸着させます。5〜10 µMのAZ溶液（KPB溶液）を約150 µL、E chemサンドイッチセルに注入し、キャップをした状態で冷蔵庫内で少なくとも1時間静置します。ECMセルが室温に戻ったら、KPBで十分に洗浄し、ECMセルをKPBで満たしてから、窒素ガスで10分間バブリングします。-0.25 Vから0.25 Vの電位窓において、CVなどの単分子層電気化学測定を実施します。KPB Rinse Aで処理したDIAM methane修飾ガラススライドを用い、100 mV/sの走査速度で測定します。その後、DIAM methaneを含むMPC溶液中に1時間浸漬し、シェーカーで低速攪拌します。これにより、MPCがMEキャプタン末端基にアンカーされ、薄膜アセンブリの第1MPC層が完成します。スライドをジクロメタンで十分に洗浄し、窒素ガスで乾燥させた後、ジクロメタン中のNDT溶液に浸漬したスライドのUV-visスペクトルを測定します。次に、スライドをMPC溶液に入れ、シェーカーで低速で振盪しながら1時間静置します。これで、フィルムアセンブリの2層目のMPC層が完了します。スライドをDIAMメタンで十分に洗浄し、窒素ガスで乾燥させた後、スライドのUV-visスペクトルを測定します。フィルムアセンブリにMPC層がさらに吸着されるにつれて、スペクトル全体の吸光度が増加するはずです。3M PT MS修飾ガラススライド上に構築したMPCフィルムを、標準的な顕微鏡スライドに貼り付ける方法について説明します。Embed eight 12 エポキシ樹脂を準備し、少なくとも 12 時間かけて硬化させます。ビームカプセルをエポキシ樹脂で満たし、MPC フィルム試料の上に反転させて置きます。カプセルに圧力をかけ、気泡がカプセルの上部に上昇するようにして、エポキシ樹脂と MPC フィルム試料の間にシールを作成します。60 °Cで少なくとも18時間重合させた後、マウントしたスライドを室温まで冷却します。ファストフィルム上のMPCが付着したブロックの取り外しを容易にするため、マウントしたスライドを200 °Cのアルミ鋳造ホットプレートで20秒間加熱します。フィルムを含むサンプルをジュエリーソーでビームカプセルブロックから切り出し、取り出した部分をシリコン製フラットモールドに入れ、MPCフィルム側をシリコンの内側に向けて配置します。シリコンウェルに室温でエポキシ樹脂を充填し、60 °Cで少なくとも18時間重合させます。その後、サンプルを室温まで冷却します。Leica UCTウルトラミクロトームを用い、ダイヤモンドナイフでナイフエッジに対して垂直に、60から80 nmの薄片を切り出します。切り出したセクションを400メッシュの銅グリッド上のFormvarカーボン支持膜上に載せ、示されているMPCフィルムアセンブリの断面のTEM画像を取得します。MPCとNDT溶液に交互に浸漬する計5回のサイクルにおける、MPCフィルム成長の電気二重層充電電流モニタリングの結果を以下に示します。充電電流は、浸漬サイクルごとに系統的に増加しています。これにより、フィルムにMPC層が順次積層されています。以下は、4.4 mM リン酸カリウム緩衝液中において、-0.25 Vから+0.25 Vの電位窓で100 mV/sの走査速度で測定した、MPCフィルムアセンブリへのAZ吸着における典型的なサイクリックボルタモグラムです。3M PT MS修飾ガラススライド上でのジオール連結MPCフィルム成長をUV-visスペクトルでモニタリングした代表的な結果をここに示します。ディップサイクルは、ガラススライドをNDTリンカー溶液にさらした後、MPC溶液にさらす工程で構成されています。浸漬を繰り返すごとに膜厚が増大し、それに伴い吸光度も上昇します。この図は、DIAで連結したMPCフィルムアセンブリの透過型電子顕微鏡（TEM）断面像の解析結果を示しています。挿入図は、フィルムアセンブリのTEM解析に使用したヘキサメトール機能化MPCの代表的なTEM像です。Image Jを用いて測定した結果、MPCの金コアの平均直径は約2 nmであることが判明しました。このビデオを視聴することで、酸化還元タンパク質の吸着およびそれに続く電気化学分析の界面として機能する、MPC金ナノ粒子膜の合成、特性評価、および組み立て方法を十分に理解できたはずです。この膜の組み立てプロセスは、MPCの合成手順や粒子間の結合メカニズムを調整することで、多様なタンパク質の吸着に適応させることが容易に可能です。この手法は、修飾された合成プラットフォームへのタンパク質吸着の電気化学的な知見を提供できるだけでなく、電子伝達モデリングシステム、バイオセンシング手法、および合成生体適合性材料の開発にも応用可能です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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物質 - 細胞相互作用研究ナノポーラス金パターンの微細加工

テンプレート·フリー基板上に肉眼で見える粒子 - リガンド単層フィルムを官能して自己組織化するために、シンプルな堅牢でスケーラブルな技術が、このプロトコルで説明されています。...

テンプレート·フリー基板上に巨視的粒子 - リガンド単層フィルムを官能して自己組織化するための技術

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合成、キャラクタリゼーション、およびハイブリッドのAu / CdSのとAu / ZnSのコア/シェルナノ粒子の機能化

銀ナノキューブサブ10nmのギャップを有するプラズモンナノスケールのパッチアンテナの製造のコロイド合成のためのプロトコルが提供されます。...

プラズモニクスとナノフォトニクスでのアプリケーションのためのNanopatchアンテナのコロイド合成

コロイドのリソグラフィ技術を用いた定期金 nanocup アレイの試作、nanoplasmonic...

コロイド リソグラフィーを用いた定期的な金 Nanocup アレイの試作

このプロトコルの詳細に基づいて広範囲を越えて制御とカスタマイズ可能なナノ粒子薄膜を作るに使用できる新規ナノ製造技術、ディウェッティング...

頂いたディウェッティング経由で制御可能なカスタマイズ可能な金ナノ粒子の大面積基板を用いたナノ加工

親和性金ナノ粒子は、多くの生物学的用途で使用することができる。リガンドのバイナリ混合物によって被覆された金ナノ粒子を合成するプロトコルと、これらの粒子の詳細な特徴付けが提示される。...

親和性金ナノ粒子の合成と特性化

ここでは、プロトコルを提案単一リポソームの脂質膜を渡るプロトン透過の分子機構の研究例としてシトクロムbo3を使用します。電気化学、蛍光顕微鏡、単一小胞、含む単一または複数の酵素のルーメン内の pH...

電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定

この研究は、レーザー照射金ナノ粒子からtBLMへの熱伝達の動的で非侵襲的なモニタリングを達成するためのプロトコルを概説する。このシステムは、インピーダンス分光法を組み合わせて、tBLM全体の伝導変化をリアルタイムで測定し、金ナノ粒子照明を駆動する水平に焦点を当てたレーザービームを熱製造に使用します。...

金ナノ粒子と脂質膜の熱伝達をモニターする二重層脂質膜

有機溶媒中で直径12nmの金ナノ粒子(Auナノ粒子)を合成するプロトコルを提示する。金ナノ粒子は、凝集を防ぐためにオレイラミンリガンドでキャップされています。金ナノ粒子はトルエンなどの有機溶媒に可溶性である。...

ゴールドナノ粒子合成

本プロトコルは、新規自己核生成抑制機構に基づく金ナノ粒子合成技術を用いて細胞内のメタロチオネインタグ付きタンパク質を検出するためのクローン可能な電子顕微鏡標識技術を記載する。...

細胞内EM可視金ナノ粒子の直接合成によるタンパク質局在解析(英語)

学ぶアルカンチオールで保護された金ナノ粒子（MPC）の合成と薄膜組立手法。Pseudomonas aeruginosa azurinなどの酸化還元タンパク質の単分子層電気化学解析に応用し、電子伝達動態を詳細に解明する革新的な方法です。

合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

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