合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

次の実験の全体的な目標は、単層保護クラスターまたはMPCとして知られるアルキル化安定化金ナノ粒子を合成し、これらの材料をアザリンタンパク質単分子膜電気化学の吸収界面として使用される薄膜アセンブリに組み立てることです。これは、まず金コロイドを有機配位子で保護し、アルカンホレート膜に囲まれた金ナノ粒子を作成することによって達成されます。次に、MPCを金基板とガラス基板に固定し、共有結合した薄い多層共有結合膜にネットワーク化し、その成長を光学的および電気化学的測定、および断面顕微鏡法で追跡します。

次に、電子移動タンパク質アザリンが界面で吸収され、タンパク質単層電気化学のためにサイクリックボールトテレメトリーが実行されます。その結果、この手順によって作成されたMPCフィルム界面は、MPC膜に基づく吸着タンパク質のより最適化された電気化学分析を可能にし、従来の距離依存性を欠いたより均一な吸着界面と高速な電子移動速度を提供することを示しています。従来のタンパク質電気化学に対するこの手法の主な利点は、ナノ粒子膜が吸収界面を提供するときに電極が修飾され、サイクル測光によって測定されるより理想的な電気化学的挙動が得られることです。

合成には重要な視覚的な手がかりが含まれる一方で、フィルムの構築と特性評価には複数の複雑なステップと分析技術が含まれるため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。NPC膜は、MPC層とダイル結合分子を交互に行うディップサイクル法を用いて、改質された金電極やスライドガラス上に組み立てることができます。その結果、これらの層を電気化学的または光学的に目的の膜厚まで追跡できます。

適切な換気でヒュームフードの下で金クラスターを合成するには、まず1.1グラムの臭化四酸化アンモニウムを30ミリリットルのトルエンに溶解し、0.38グラムの水素化ナトリウムを約20ミリリットルの18メガオームの超精製水に溶かし、氷上で少なくとも30分間冷やします。次に、テトラクロロロ水素水の溶液を、さらに5ミリリットルの超精製水を使用して、テトライデ臭化アンモニウムトルエン溶液に定量的に移します。金水溶液を非水溶液に相転移するために、軽くキャップをして30分間厳密に攪拌します。

したがって、焦げたオレンジ色の水性相と透明な非水相がよく混ざり合っています。透明な水性相と焦げたオレンジ色の非水相の両方を分離液漏斗に移します。水性層を捨て、非水性層をきれいなフラスコにデカントします。

C 6 と 2 対 1 の比率を水素テトラ クロロまたは非水溶液を含む速度に加えます。赤みがかったオレンジ色から淡黄色のほぼ無色の溶液への色の変化によって検出された金1ポリマーを形成するために30分間攪拌する。反応混合物を断熱氷浴に移し、定量的に攪拌しながら摂氏0度まで少なくとも30分間冷却し、冷やした水素化ホウ素ナトリウム溶液を反応混合物に迅速に加えて、太ももの存在下で金1を金属金に還元します。

さらに、単層で保護された金クラスターまたはMPCの濃厚な黒色の溶液を瞬時に形成します。翌日、摂氏0度で一晩反応を攪拌します。反応混合物をセパレーター漏斗に移します。

水性層を廃棄物ビーカーとロータリーに捨てます。非水性トルエン層をほぼ完全に乾燥するまで蒸発させ、フラスコに重い黒いスラッジを残します。アセトニトリルを添加してMPCを沈殿させ、ゴム製のフィッティングを備えた中程度の多孔性のガラスフリットとアスピレーター付きのサイドアームフラスコを使用して溶液を一晩放置します。

真空ろ過によりMPCを回収し、アセトニトリルを多量に含ませてすすぎます。サンドイッチセルを電気化学的に組み立てた後、0.2〜0.9ボルト、0.2〜1.2ボルト、0.2〜1.35ボルトが0.1モル硫酸と0.01モル塩化カリウムの溶液中で毎秒100ミリボルトである電位ウィンドウでサイクリックボリュームテレメトリーまたはCVを実行して金基板を洗浄します。洗浄された裸の金基板の二重層充電電流を測定するには、リン酸カリウムバッファーまたはKPBで毎秒100ミリボルトでスキャンした塩化銀に対して0.1〜0.4ボルトの電位ウィンドウを含む標準条件でCVを実行します。

バッファーを廃棄し、超精製水とエタノールで2回過度にすすいでください。洗浄した金基質をエタノール中の約300マイクロリットルの5ミリモルC 6溶液にさらし、一晩放置して順序付けられたC six Samを形成します。細胞からC six溶液を捨て、エタノールと超精製水で過度に2回すすいでください。

標準状態でのSAMの充電電流を測定します。KPBを廃棄し、超精製水とエタノールで過度に2回すすいでください。充電電流は大幅に減少させる必要があります。

裸の金の測定から、SAM修飾金基板をエタノール中の約300マイクロリットルの5ミリモルNDT溶液にさらし、1時間放置して、Cシックスサム内のNDT結合分子を相互に分散させます。NDT溶液を廃棄し、エタノールと超精製水で2回過剰かつ十分にすすぎ、ジアムメタンで1回よりも過度かつ完全にすすぎます。金基板をDIAMメタンのMPC溶液に攪拌しながら、窒素ガスで1時間ゆっくりと泡立たせます。

これは、フィルムアセンブリの固定MPC層です。MPC溶液を廃棄し、再度ジクロロメタン超精製水とKPBで連続してすすいでください。標準条件でのMPC層の充電電流を測定します。

KPBは廃棄し、超精製水とDIAMメタンで過度にすすいでください。金基板をDIAMメタン中の約300マイクロリットルの5ミリモルNDT溶液に曝露し、窒素ガスで20分間ゆっくりと泡立てて攪拌します。NDTを廃棄し、DIAMメタンで十分にすすぎ、2番目のMPC層を堆積させます。

DIAMメタンのMPC溶液にフィルムアセンブリを再浸し、窒素ガスでゆっくりと泡立たせて攪拌しながら座らせてから1時間洗います。次に、MPC層の充電電流を標準状態で再度測定し、同じ手順で再度すすぎます。必要に応じて、追加の MPC レイヤーをデポジットします。

ネットワーク化されたMPCフィルムが完成したら、フィルム改質基板をKPBですすぎ、AZタンパク質をMPCフィルムアセンブリに吸収します。KPB中の5〜10マイクロモルAZ溶液の約150マイクロリットルをEケムサンドイッチセルに注入し、キャップを付けて少なくとも1時間冷蔵します。ECMセルが室温に戻ったら、KPBで十分にすすぎ、ECMセルにKPBを補充し、KPBを窒素ガスで10分間泡立てます。

CVなどの単層電気化学研究を、マイナス0.25ボルトから0.25ボルトまでの電位ウィンドウで実行します。KPB Rinse A 3M PT MS modified glass slide with DIAM methaneで毎秒100ミリボルトでスキャンし、低速でシェーカーで攪拌しながら、DIAMメタンのMPC溶液に1時間置きます。これにより、MPCを正気のMEキャプタン末端グループに固定することにより、フィルムアセンブリの最初のMPC層が完成します。

スライドをDiorメタンで十分にすすぎ、窒素ガスで乾燥させ、スライドのUV可視スペクトルを取ります スライドをdiamメタンのNDT溶液に浸した後。スライドをMPC溶液に1時間入れ、シェーカーで低速で攪拌します。これで、フィルムアセンブリの2番目のMPCレイヤーが完成します。

スライドをDIAMメタンで十分にすすぎ、窒素ガスで乾燥させ、スライドのUV可視スペクトルを採取します。スペクトル全体の吸光度は、追加のMPC層がフィルムアセンブリに吸収されるにつれて増加するはずです。3M PT MS改質ガラススライドに組み立てたMPCフィルムを標準的な顕微鏡スライドに貼り付けます。

埋め込み8つの12エポキシ樹脂を準備し、少なくとも12時間増粘させます。ビームカプセルにエポキシ樹脂を充填し、MPCフィルムサンプルの上に反転させます。カプセルに圧力をかけ、カプセルの上部に気泡が立ち上るようにし、エポキシ樹脂とMPCフィルムサンプルとの間にシールを作成します。

摂氏60度で少なくとも18時間重合させ、取り付けられたスライドを室温まで冷却します。高速フィルムにMPCが取り付けられたブロックの取り外しを容易にするために、鋳造アルミニウムホットプレート上で200°Cで取り付けられたスライドを20秒間加熱します。フィルムを含むサンプルを、ジュエラーソーリードを使用してビームカプセルブロックから切り取り、MPCフィルム面を上にしてシリコンの内部を向くシリコンフラットモールドで除去した部分

シリコンを室温でエポキシ樹脂で十分に充填し、摂氏60度で少なくとも18時間重合させます。次に、サンプルを室温に戻します。ライカUCTウルトラミクロトーム上で60ナノメートルから80ナノメートルの薄い試料切片をダイヤモンドナイフで切断し、ナイフの刃先に対して垂直な切片を切断し、スライスした切片を400メッシュの銅グリッド上に形成VARカーボン支持フィルムに載せ、MPCフィルムアセンブリの断面のTEM画像を撮影します。

これは、MPC溶液とNDT溶液への交互の曝露を含む合計5回の浸漬サイクルでMPC膜の成長を2層充電電流モニタリングした結果です。充電電流は、浸漬サイクルごとに体系的に増加します。フィルムにMPCのレイヤーを追加します。

これは、AZの典型的なサイクリックボルタグラハムは、マイナス0.25からプラス0.25ボルトの電位ウィンドウを使用して収集されたMPCフィルムアセンブリに吸収を追加し、4.4ミリモルリン酸カリウム緩衝液で毎秒100ミリボルトでスキャンしたものです。3M PT MS改質ガラススライド上のジオール結合MPC膜成長の代表的な紫外可視スペクトルモニタリングをここに示します。ディップサイクルは、スライドガラスをNDTリンカー溶液に曝露し、続いてMPC溶液に曝露することで構成されます。

その後のディップごとに、膜厚が増大し、同時に吸光度が増加します。この図は、DIA結合MPC膜アセンブリの透過型電子顕微鏡による断面画像解析を示しています。挿入図は、膜アセンブリTEM分析で使用されるヘキサメトール官能基化MPCの典型的なTEMイメージを示しています。

画像Jを使用して、MPCの平均金コア直径は約2ナノメートルであると決定しました。このビデオを見れば、酸化還元タンパク質の吸収とその後の電気化学分析のインターフェースとして機能するMPCゴールデンナローパーの膜を合成、特性評価、および組み立てる方法について十分に理解できるはずです。フィルムの組み立てプロセスは、MPC合成手順と内部粒子結合メカニズムを操作して、多様なタンパク質の吸収に対応することにより、容易に適応できます。

この手法は、修飾合成プラットフォームへのタンパク質吸収の電気化学に関する洞察を得ることができますが、電子伝達モデリングシステム、バイオセンシングスキーム、および合成生体適合性材料の開発にも適用できます。