合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

本実験の全般的な目的は、モノレイヤー保護クラスター（MPC）として知られるアルキル化安定化金ナノ粒子を合成し、これらの材料をアズリンタンパク質モノレイヤー電気化学の吸収界面として用いられる薄膜アセンブリに構築することです。これはまず、金コロイドを有機リガンドで保護し、アルカンチオール膜に囲まれた金ナノ粒子を作成することで達成されます。次に、MPCを金およびガラス基板に固定し、共有結合で連結された薄い多層膜へとネットワーク化させ、その成長を光学測定、電気化学的測定、および断面顕微鏡観察によって追跡します。

次に、電子伝達タンパク質であるazarinを界面に吸着させ、タンパク質単分子層の電気化学測定のためにサイクリックボルタンメトリーを行います。その結果、この手順で作成されたMPCフィルム界面は、MPCフィルムに基づいた吸着タンパク質のより最適化された電気化学的分析を可能にし、より均一な吸着界面と、従来の距離依存性のない高速な電子伝達キネティクスを提供することが示されました。従来のタンパク質電気化学に対する本手法の主な利点は、ナノ粒子フィルムで修飾された電極が、サイクリックボルタンメトリーで測定されるより理想的な電気化学的挙動をもたらす吸着界面を提供することにあります。

合成過程には重要な視覚的指標が含まれており、また膜の構築と評価には複雑な工程と分析手法が多数含まれているため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。NPC膜は、MPC層と二価連結分子を交互に用いるディップサイクル法により、修飾金電極またはガラススライド上に構築できます。これにより、これらの層を電気化学的または光学的に追跡し、目的の膜厚まで制御することが可能です。

適切な換気設備を備えた・ドラフトチャンバー内で金クラスターを合成するには、まず1.1 gのテトラオクチルアンモニウムブロミドを30 mLのトルエンに溶解します。次に、0.38 gの水素化ホウ素ナトリウムを約20 mLの18 MΩ超純水に溶解し、氷上で少なくとも30分間冷却します。続いて、テトラクロロ金酸水溶液を、さらに5 mLの超純水を用いてテトラオクチルアンモニウムブロミドのトルエン溶液に定量的に移します。水相の金溶液を非水相へ相転移させるため、軽く蓋をして30分間激しく撹拌します。

これにより、濃いオレンジ色の水相と透明な非水相が十分に混合されます。透明な水相と濃いオレンジ色の非水相の両方を分液漏斗に移します。水層を廃棄し、非水層を清潔なフラスコに分注します。

テトラクロロ金酸を含む非水溶液に、C6を2:1の比率で加えます。30分間撹拌し、溶液の色が赤橙色から淡黄色またはほぼ無色に変化することで確認される金(I)ポリマーを形成させます。反応混合物を断熱氷浴に移し、撹拌しながら0 °Cで少なくとも30分間冷却します。その後、チオール存在下で金(I)を金属金に還元するため、冷却した水素化ホウ素ナトリウム溶液を定量的に、かつ迅速に反応混合物へ加えます。

添加すると、直ちに単分子層保護金クラスター（MPC）の濃い黒色の溶液が形成されます。翌日、0 °Cで一晩撹拌してください。その後、反応混合物を分液漏斗に移します。

水層を廃棄用ビーカーに捨て、エバポレーターで処理します。非水層のトルエンをほぼ完全に乾固させ、フラスコ内に濃い黒色のスラッジが残るまで蒸発させます。アセトニトリルを加えてMPCを沈殿させ、中孔径のガラスフィルター（ゴム継手付き）とアスピレーターを備えた側arm付きフラスコを用い、一晩静置します。

真空ろ過によりMPCを回収し、大量のアセトニトリルで洗浄します。サンドイッチ型セルを電気化学的に組み立てた後、0.1 M硫酸および0.01 M塩化カリウム溶液中において、走査速度100 mV/sで0.2〜0.9 V、0.2〜1.2 V、および0.2〜1.35 Vの電位窓でサイクリックボルタンメトリー（CV）を行い、金基板を洗浄します。洗浄した裸の金基板の二重層充電電流を、リン酸カリウム緩衝液（KPB）中、銀/塩化銀参照電極に対して0.1〜0.4 Vの電位窓、走査速度100 mV/sの標準条件下でCVを行い測定します。

バッファーを廃棄し、超純水とエタノールで十分に2回洗浄します。洗浄した金基板に5 mMのC6エタノール溶液を約300 µL加え、一晩静置して秩序だったC6 SAMを形成させます。セルからC6溶液を廃棄し、エタノールと超純水で十分に2回洗浄します。

標準条件下でSAMの充電電流を測定します。KPBを廃棄し、超純水とエタノールで十分に2回洗浄します。これにより、充電電流が著しく減少することが確認されるはずです。

裸金での測定後、SAM修飾した金基板を5 mMのNDTエタノール溶液約300 µLに浸し、C6 SAM内にNDT連結分子を分散させるため1時間静置します。NDT溶液を廃棄し、エタノールと超純水で十分に入念に2回すすぎ、その後ジメチルジメチル甲烷で1回すすぎます。金基板をジメチルジメチル甲烷を用いたMPC溶液に浸し、窒素ガスをゆっくりとバブリングして撹拌しながら1時間処理します。

これは膜アセンブリのアンカリングMPC層です。MPC溶液を廃棄し、ジクロロメタン、超純水、およびKPBで順次洗浄します。標準条件下でMPC層の充電電流を測定します。

KPBを除去し、超純水とDIAM methaneで十分に洗浄します。金基板を5 mMのNDT/DIAM methane溶液約300 µLに浸し、窒素ガスをゆっくりとバブリングして撹拌しながら20分間静置します。NDT溶液を除去し、DIAM methaneで十分に洗浄して、2層目のMPC層を堆積させます。

フィルムアセンブリをDIAMメタンのMPC溶液に再度浸漬し、窒素ガスをゆっくりとバブルさせて攪拌しながら1時間静置させ、その前に洗浄を行います。その後、標準条件下でMPC層の充電電流を再度測定し、同様の手順で再び洗浄します。必要に応じて、さらにMPC層を堆積させてください。

ネットワーク化MPCフィルムが完成した後、KPBで修飾基板を洗浄し、MPCフィルムアセンブリにAZタンパク質を吸着させます。5〜10 µMのAZ溶液（KPB溶液）を約150 µL、E chemサンドイッチセルに注入し、キャップをした状態で冷蔵庫内で少なくとも1時間静置します。ECMセルが室温に戻ったら、KPBで十分に洗浄し、ECMセルをKPBで満たしてから、窒素ガスで10分間バブリングします。

-0.25 Vから0.25 Vの電位窓において、CVなどの単分子層電気化学測定を実施します。KPB Rinse Aで処理したDIAM methane修飾ガラススライドを用い、100 mV/sの走査速度で測定します。その後、DIAM methaneを含むMPC溶液中に1時間浸漬し、シェーカーで低速攪拌します。これにより、MPCがMEキャプタン末端基にアンカーされ、薄膜アセンブリの第1MPC層が完成します。

スライドをジクロメタンで十分に洗浄し、窒素ガスで乾燥させた後、ジクロメタン中のNDT溶液に浸漬したスライドのUV-visスペクトルを測定します。次に、スライドをMPC溶液に入れ、シェーカーで低速で振盪しながら1時間静置します。これで、フィルムアセンブリの2層目のMPC層が完了します。

スライドをDIAMメタンで十分に洗浄し、窒素ガスで乾燥させた後、スライドのUV-visスペクトルを測定します。フィルムアセンブリにMPC層がさらに吸着されるにつれて、スペクトル全体の吸光度が増加するはずです。3M PT MS修飾ガラススライド上に構築したMPCフィルムを、標準的な顕微鏡スライドに貼り付ける方法について説明します。

Embed eight 12 エポキシ樹脂を準備し、少なくとも 12 時間かけて硬化させます。ビームカプセルをエポキシ樹脂で満たし、MPC フィルム試料の上に反転させて置きます。カプセルに圧力をかけ、気泡がカプセルの上部に上昇するようにして、エポキシ樹脂と MPC フィルム試料の間にシールを作成します。

60 °Cで少なくとも18時間重合させた後、マウントしたスライドを室温まで冷却します。ファストフィルム上のMPCが付着したブロックの取り外しを容易にするため、マウントしたスライドを200 °Cのアルミ鋳造ホットプレートで20秒間加熱します。フィルムを含むサンプルをジュエリーソーでビームカプセルブロックから切り出し、取り出した部分をシリコン製フラットモールドに入れ、MPCフィルム側をシリコンの内側に向けて配置します。

シリコンウェルに室温でエポキシ樹脂を充填し、60 °Cで少なくとも18時間重合させます。その後、サンプルを室温まで冷却します。Leica UCTウルトラミクロトームを用い、ダイヤモンドナイフでナイフエッジに対して垂直に、60から80 nmの薄片を切り出します。切り出したセクションを400メッシュの銅グリッド上のFormvarカーボン支持膜上に載せ、示されているMPCフィルムアセンブリの断面のTEM画像を取得します。

MPCとNDT溶液に交互に浸漬する計5回のサイクルにおける、MPCフィルム成長の電気二重層充電電流モニタリングの結果を以下に示します。充電電流は、浸漬サイクルごとに系統的に増加しています。これにより、フィルムにMPC層が順次積層されています。

以下は、4.4 mM リン酸カリウム緩衝液中において、-0.25 Vから+0.25 Vの電位窓で100 mV/sの走査速度で測定した、MPCフィルムアセンブリへのAZ吸着における典型的なサイクリックボルタモグラムです。3M PT MS修飾ガラススライド上でのジオール連結MPCフィルム成長をUV-visスペクトルでモニタリングした代表的な結果をここに示します。ディップサイクルは、ガラススライドをNDTリンカー溶液にさらした後、MPC溶液にさらす工程で構成されています。

浸漬を繰り返すごとに膜厚が増大し、それに伴い吸光度も上昇します。この図は、DIAで連結したMPCフィルムアセンブリの透過型電子顕微鏡（TEM）断面像の解析結果を示しています。挿入図は、フィルムアセンブリのTEM解析に使用したヘキサメトール機能化MPCの代表的なTEM像です。

Image Jを用いて測定した結果、MPCの金コアの平均直径は約2 nmであることが判明しました。このビデオを視聴することで、酸化還元タンパク質の吸着およびそれに続く電気化学分析の界面として機能する、MPC金ナノ粒子膜の合成、特性評価、および組み立て方法を十分に理解できたはずです。この膜の組み立てプロセスは、MPCの合成手順や粒子間の結合メカニズムを調整することで、多様なタンパク質の吸着に適応させることが容易に可能です。

この手法は、修飾された合成プラットフォームへのタンパク質吸着の電気化学的な知見を提供できるだけでなく、電子伝達モデリングシステム、バイオセンシング手法、および合成生体適合性材料の開発にも応用可能です。