ティッシュエンジニアーコンストラクトの成長評価のための磁気共鳴エラストグラフィの方法論

構築された組織構築物を調べる際、サンプルの破壊を伴うことが多い従来の機械的試験は適していません。本手法では、小さな軟組織の機械的特性を測定するための非侵襲的技術として、顕微鏡的磁気共鳴エラストグラフィ（micro MRE）を用います。まず、組織を生成するために、細胞をバイオマテリアル・スキャフォールド上に播種します。

組織をaros gelに懸濁させ、アクチュエータの先端をゲル内に配置します。次に、アクチュエータの動作をサンプルに伝達させ、レーザードップラー速度計を用いて検出することで、その動作を特性評価します。

サンプルとアクチュエータを磁石および磁気共鳴装置へ移送します。エラストグラフィ画像を撮影します。得られた画像の解析により、骨分化および脂肪分化の両構築物におけるせん断剛性の変化を明らかにします。

私たちはまずこの技術を考案し、疾患診断への応用として磁気共鳴フォトリソグラフィー（magnetic residency photography）を観察し、それが組織工学に拡張可能であることに気づきました。機械的試験などの既存の他の技術に対するこの技術の主な利点は、MRIという非侵襲的な技術を組織の主要な機械的特性に適用できることです。機械的特性に関する知見があれば、骨および軟骨工学における意図した用途に適していることを保証できるため、本技術の応用範囲は組織工学にまで及びます。

これらの手法は組織工学において貴重な知見を提供しますが、例えば肝線維症、外傷性脳損傷、脳腫瘍など、さまざまな臓器の疾患診断にも利用可能です。本手法には習得が困難な工程が含まれており、また組織工学や磁気共鳴イメージング（MRI）に関する事前知識が必要となるため、視覚的な実演が不可欠です。組織構築物の作製プロセスは、細胞集団の増殖、バイオマテリアル・スキャフォールドへの細胞播種、および化学的シグナル分子を用いた分化誘導という3つの主要な段階で構成されています。

細胞株の培養および拡大後、骨形成のため、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）を1 × 10⁶ cells/mLの密度でゼラチンスポンジに播種します。約3日後、分化を誘導するために、細胞がスキャフォールド上でコンフルエントになっていることを確認してください。培地を除去し、脂肪分化誘導培地と交換します。

その後、細胞を37°C、5% CO2条件下で3日間インキュベートします。培地を、10 µg/mLのヒト組換えインスリンを含む増殖培地で構成される維持培地に交換します。24時間インキュベートした後、維持培地を誘導培地に交換します。

このサイクルを3回繰り返します。その後、骨分化を誘導するため、4週間にわたって2日ごとに維持培地を交換してください。研究期間中は、2日ごとに新鮮な骨分化誘導培地に交換します。

本研究の期間は4週間であり、毎週MREを実施します。磁気共鳴エラストグラフィ（MRE）は、機械的なせん断波の伝播を利用して、局所的な機械的特性の値を評価します。そのため、圧電アクチュエータを用いて、対象組織内でこれらの機械的振動を発生させ、特性を評価する必要があります。サンプルの調製には、組織培養物を、固体ベースと0.5% AGROSゲルの層を含む直径10 millimeterの試験管に移してください。

次に、暖かい0.5%アガロースゲルを加え、それを密封します。アガロースゲルを5分間静置して凝固させます。

室温にて、ピエゾ電気曲げモーターのチップをゲルの表面に挿入します。次に、サンプルが入ったチューブとアクチュエーターを剛性のある支持台に固定します。レーザードップラー振動計のビームを、機械的アクチュエーターのチップに向くように調整します。

バロメーターに表示される反射信号強度を最適化するように、システムの配置を調整します。反射を最大化するため、必要に応じて反射テープを使用し、約 250 microns という十分な振幅を持つ無害なせん断波をアクチュエータで発生させます。ファンクションジェネレーターを設定し、ホワイトノイズ信号を用いて、動作電圧 20 volts peak to peak で目的の周波数範囲をスイープさせます。

本実験では、目的の周波数範囲を20〜2000 hertzに設定します。Polytech Rsofプログラムで特性スペクトルを確認するには、velocityおよびFFT表示を選択してください。信号のキャプチャを開始し、スペクトルのピークに基づいてシステムの共振周波数を特定します。

次に、アクチュエータのたわみを測定するため、アクチュエータを特性評価した共振周波数で連続正弦波を出力するように設定します。ピーク間電圧200 Vの動作電圧を使用し、アクチュエータによってゲルの表面に伝えられている変位を計測し、変位をY軸とするFFTを表示するように設定します。アクチュエータの特性評価が完了したら、サンプルとアクチュエータを入れた試験管を10 mm RFコイルのスロットに挿入し、サンプルとアクチュエータをMRIスキャナーの中心に配置します。

構築物の位置を確認するため、スカウト画像を撮影します。組織構築物の位置が特定されたら、撮影パラメータを設定します。一般的なin vitroでのサジタル断像スキャンの場合、繰り返し時間は1000 millisecondsに設定します。

エコー時間は20から40ミリ秒、スライス厚は0.5から1ミリメートル、視野（FOV）は12×10mm²とし、マトリックスサイズは128×128ピクセルに設定します。エラストグラフィのパラメータについては、アクチュエータ周波数をレーザードップラー振動計による特性評価で決定した値に設定します。本サンプルでは、勾配振幅50 gauss/cmの1バイペアが必要であり、MRE遅延はゼロに設定します。

ファンクションジェネレーターをバーストモードに切り替え、周波数やサイクル数など、ファンクションジェネレーターのパラメータをエラストグラフィの取得パラメータに合わせて調整します。また、ファンクションジェネレーターを外部トリガー設定にします。サジタル像を取得するには、モーションセンシタイゼーションをスライス正方向（positive slice direction）に設定し、取得後にスキャンを開始します。

画像を確認し、組織構築物の信号品質を評価します。画像が暗すぎる場合は、MRパラメータを調整して再度スキャンを行ってください。次に、感度をスライス方向のネガティブ側に変更します。

MRIスキャナーからMATLABを搭載した別のコンピューターにファイルを転送し、せん断波の伝播を描写する画像を生成するための複素除算を行うMATLABプログラムを実行します。画像を確認してせん断波の存在やアーチファクトの有無を評価します。波の品質と振幅をより詳細に評価するために、位相ラッピングのラインプロファイルなどをプロットすることが可能です。ラッピングが発生した場合は、勾配振幅を下げて再度スキャンを行ってください。

画像の調整が不要な場合は、パラメータ配列のサイズを、0秒から特性共鳴周波数の全周期までの等間隔の8つの値に設定します。画像の取得が完了したら、正および負の両方のスライス方向でスキャンを実行します。

せん断波データおよびサンプル内を伝播する波の対応するムービーを生成するために設計されたMATLABプログラムを使用します。このファイルは、機械的特性を推定するために必要となります。MREの最終ステップは、せん断波画像からせん断剛性を算出することです。

まず、3次元データセットを評価するMATLABプログラムにデータを入力し、視野、勾配、振幅、バイポーラペア数などのイメージングパラメータを指定して、コードを実行します。このアルゴリズムでは、関心領域（ROI）を選択し、各パラメータの平均値および標準偏差を算出することができます。組織構築物の輪郭を描き、関心領域を選択してください。

選択した関心領域内における剛性、貯蔵弾性率、および損失弾性率の平均値と標準偏差が表示されます。また、本プログラムは、フィルタ適用後の波形、方向性フィルタリング後の波形、およびラインプロファイルを含む中間結果を提供し、これにより復元の忠実度の推定に役立てることができます。正確な推定を行うためには、フィルタリング後の波形が滑らかである必要があります。

特定の関心領域におけるパラメータの標準偏差は、必要に応じて計算精度の指標となります。機械的特性の正確な値を得るために、必要に応じて他のパラメータを調整し、作製した構築物の成長に伴う機械的特性の変化を観察してください。MRE試験は4週間にわたって実施されました。この構築物開発マップには、脂肪分化（文字Aで表示）および骨分化（文字Oで表示）の構築物が示されており、対応する強度画像、せん断波画像、ELA、および平均せん断剛性が表示されています。

ELAのカラーマップは、バーの配色に対応しています。チャートとエラーバーは、各コンストラクトの関心領域（ROI）内における標準偏差を示しています。時間の経過とともに、脂肪分化コンストラクトの剛性は低下し、脂肪組織に類似した特性を示しました。

同様に、骨形成構 constructs は4週間の期間で剛性が高まり、骨様分化が進んでいることが示されました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで約2時間で完了させることができます。この手順を行う際は、 procedure の後にアクチュエータを完全に特性評価することが重要です。鉱質沈着の確認などの疑問を解消するために、生化学的分析や組織学的解析などの手法を用いることができます。

ヒト細胞材料およびMRIを使用する場合、極めて危険な可能性があるため、適切なBSL-2およびMRIの予防措置を十分に認識し、これらの手順を実行する際は細心の注意を払ってください。