ティッシュエンジニアーコンストラクトの成長評価のための磁気共鳴エラストグラフィの方法論
2012年2月9日
の手順では、微細な磁気共鳴エラストグラフィ（μMRE）を使用して機械的特性の非侵襲的局所評価を通して脂肪と骨組織設計構造物の設計された結果を監視するための磁気共鳴エラストグラフィの方法論を示しています。
人工組織構造を調べるには、サンプルの破壊につながることが多い従来の機械的試験は受け入れられません。この方法は、小さな軟組織の機械的特性を測定するための非侵襲的技術として、顕微鏡的磁気共鳴エラストグラフィーまたはマイクロMREを使用します。まず、細胞を生体材料の足場に座らせて組織を生成します。
組織をarosゲルに懸濁し、アクチュエーターの先端をゲルに入れる。次に、アクチュエータの動きを特性評価するために、サンプルに伝達され、レーザーを使用して検出されます。ドップラービター。
サンプルとアクチュエータは磁石と磁気共鳴に伝達されます。エラストグラフィ画像が取得されます。得られた画像の分析は、骨形成物と脂肪形成物の両方の純粋な剛性の変化を示しています。
この手法のアイデアは最初に思いつき、疾患診断に使用するための磁気レジデンシーフトグラフィーを観察し、組織工学に拡張できることに気づきました。この技術が機械的試験などの他の既存の技術よりも優れている主な利点は、MRIの非侵襲的技術を組織の主要な機械的特性に適用できることです。この技術の応用は、機械的特性の知識が骨および軟骨工学における意図された使用に適していることを確実にするため、組織工学にまで及びます。
これらの方法は、組織工学に関する貴重な洞察を提供しますが、肝線維症、外傷性脳損傷、脳腫瘍など、さまざまな臓器の疾患を診断するためにも使用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、習得が困難なステップと、組織工学とマグニチュードリズムイメージングの事前認識が含まれているため、非常に重要です。ガース。組織構築物の調製プロセスは、細胞集団の拡大、生体材料の足場への細胞の播種、および化学シグナル伝達分子の使用による分化の3つの主要な段階で構成されています。
細胞株の培養および増殖後、ヒト間葉系幹細胞またはHMCをゼラチンスポンジ上に、骨形成のために1ミリリットルあたり6細胞の10倍の密度で播種します。約3日後、細胞は分化を誘導するために足場上でコンフルエントに見えるはずです。培地を取り外し、脂肪誘導培地と交換します。
次に、3日後に細胞を5%二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。培地を、1ミリリットルあたり10マイクログラムのヒト組換えインスリンを含む拡張培地からなる維持培地と交換します。24時間インキュベートした後、メンテナンス培地を誘導培地と交換してください。
このサイクルを3回繰り返します。その後4週間、2日ごとに維持培地を交換して骨形成を誘導します。.研究期間中、2日ごとに新鮮な骨形成培地と交換してください。
ここでは、研究は 4 週間続き、MRE は毎週実行されます。磁気共鳴エラストグラフィーは、機械的横波の伝播に依存して、機械的特性の局所的な値を評価します。したがって、これらの機械的振動は、ピソ電動アクチュエータを使用して目的の組織内で発生し、特性評価する必要がありますサンプルを準備するには、組織培養物を固体ベースと0.5%AGROSゲルの層を含む直径10ミリメートルの試験管に移します。
次に、温かい0.5アクロゲルを追加します。それを囲むために。アグロスジェルを5分間硬化させます。
室温で、ピソ電動ベンディングモーターの先端をゲルの表面に挿入します。次に、サンプルとアクチュエーターが入ったチューブを剛性のあるサポートに取り付けます。レーザードップラー気圧計のビームをメカニカルアクチュエータの先端に向けます。
システムの位置を調整して、気圧計に表示される反射信号強度を最適化します。反射を最大化するには、必要に応じて反射テープを使用して、約250ミクロンの大きな振幅を持つ無害な薄波を生成するようにアクチュエータを設定します。ホワイト ノイズ信号で 20 ボルトのピーク トップの動作電圧を使用して目的の周波数範囲をスイープするように関数発生器を設定します。
この実験では、目的の周波数範囲は20〜2000ヘルツです。Polytech Rsof プログラムで特性評価されたスペクトルを表示するには、速度と FFT ディスプレイを選択します。信号のキャプチャを開始し、スペクトルのピークに基づいてシステムの共振周波数を特定します。
次に、アクチュエータのたわみを測定するために、特性化された共振周波数で連続的な正弦波を供給するようにアクチュエータを設定します。200ボルトのピークtopeの営業電圧を使用して、Y軸として変位とFFTを表示するために柔らかいゲルセット繊維の表面にアクチュエータによって供給されている生成された変位を示します。アクチュエータの特性評価が完了したら、サンプルとアクチュエーターの入った試験管を10mmRFコイルのスロットにセットし、サンプルとアクチュエーターをMRIスキャナーの中央に置きます。
コンストラクトの位置を特定するためのスカウト画像を取得します。組織コンストラクトが特定されたら、取得のパラメータを設定します。一般的なin vitro矢状スキャンの繰り返し時間は1000ミリ秒です。
エコー時間は 20 ミリ秒から 40 ミリ秒、スライスの厚さは 0.5 から 1 ミリメートル、視野は 12 x 10 ミリメートルの 2 乗で、マトリックス サイズは 1 28 x 1 28 ピクセルです。エラストグラフィパラメータについては、アクチュエータの周波数をレーザードップラービターの特性評価によって決定された値に設定します。このサンプルでは、勾配振幅が50ガウス/センチメートルで、MRE遅延がゼロに設定された1つのバイペアが必要です。
ファンクションジェネレータをバーストモードに変更し、周波数やサイクル数など、エラストグラフィ取得パラメータのパラメータと一致するようにファンクションジェネレータのパラメータを調整します。また、関数発生器を外部トリガーするように設定します。矢状画像を取得するには、モーションセンシサイゼーションを正のスライス方向に設定し、取得後にスキャンを開始します。
画像を確認して、組織コンストラクトの信号品質を評価します。画像が暗すぎるように見える場合は、MRパラメータを調整して、別のスキャンを取得します。次に、感度をネガティブスライス方向に変更します。
MRIスキャナーからMATLABを搭載した別のコンピューターにファイルを転送し、横波の伝播を表す画像を生成するための複雑な除算を実行するMATLABプログラムを実行します。横波の存在について画像を評価し、位相ラッピング ライン プロファイルなどの可能性のあるアーチファクトをプロットして、波の品質と振幅をより適切に評価できます。ラッピングが発生した場合は、グラジエント振幅を小さくして、別のスキャンを取得します。
画像の調整が不要な場合。パラメータ配列のサイズを、0秒から特性化された共振周波数の全周期までの8つの等間隔の値に調整します。画像が取得されたら、ポジティブスライスとネガティブスライスの両方の向きでスキャンを取得します。
純粋な波データと、サンプル内を伝搬する波の対応するムービーを生成するために設計された MATLAB プログラムを使用します。これは、機械的特性を推定するために必要なファイルです。MREの最後のステップは、シアーウェーブ画像からシアー剛性を計算することです。
まず、3 次元データセットを評価する MATLAB プログラムにデータを配置し、視野、勾配、振幅、バイポーラ ペアの数などのイメージング パラメーターを指定して、コードを実行します。このアルゴリズムでは、各パラメータの平均と標準偏差を計算する対象領域を選択できます。組織コンストラクトの輪郭を描画して、関心のある領域を選択します。
選択した対象領域内の剛性、貯蔵弾性率、弾性率、および損失弾性率の平均と標準偏差が表示されます。このプログラムは、フィルタ後の波、指向性フィルタリング後の波、リカバリの忠実度を見積もるのに役立つラインプロファイルなどの中間結果も提供します。正確な推定のためには、フィルタリングされた波が滑らかである必要があります。
特定の関心領域におけるパラメータの標準偏差は、必要に応じて計算の品質の指標でもあり、必要に応じて他のパラメータを調整して機械的特性の正確な値を取得し、エンジニアリングコンストラクトの機械的特性の変化を観察します。MREテストは4週間にわたって適用されました。このコンストラクト開発マップは、文字Aで示される脂肪形成性、文字Oコンストラクトで示される骨形成物を示し、対応する大きさの画像、シアーウェーブ画像、ELA、および平均せん断剛性が表示されます。
ELA のカラーマップは、バーの配色に対応しています。チャートとエラーバーは、各コンストラクトの関心領域内の標準偏差を表します。時間が経つにつれて、脂肪形成構築物の硬さは低下し、脂肪組織に類似した特性を示しています。
同様に、骨形成物は4週間の期間でより硬くなり、骨のような分化をマスターすると、この技術は適切に実行すれば約2時間で行うことができます。この手順を試行するときは、この手順に従ってアクチュエータを完全に特性評価することが重要です。生化学的分析や組織学などの方法を使用して、鉱物の沈着の確認などの質問に答えることができます。
忘れてはならないのは、ヒトの細胞材料やMRIを扱う際には、非常に危険であり、適切なBL 2とMRIを意識する可能性があることです。これらの手順を実行する際には、予防措置を講じる必要があります。
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概要
この手順は、エンジニアリングされた脂肪組織および骨形成組織構造をモニタリングするための磁気共鳴エラストグラフィ（MRE）の方法論を実証します。これは、機械的特性の非侵襲的評価に顕微鏡的磁気共鳴エラストグラフィ（μMRE）を利用しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 組織工学
背景
- 従来の機械的試験はしばしばサンプルを破壊します。
- 非侵襲的技術は小さな軟組織に不可欠です。
- 顕微鏡的磁気共鳴エラストグラフィが解決策を提供します。
- この方法により、機械的特性の局所評価が可能になります。
研究の目的
- 組織構造を評価するための非破壊的方法を開発すること。
- エンジニアリングされた組織の機械的特性をモニタリングすること。
- 組織工学の成果の理解を深めること。
使用された方法
- 細胞を生体材料のスキャフォールドに配置します。
- 組織をアロスゲルに懸濁します。
- アクチュエーターの先端をゲルに配置して運動を生成します。
- アクチュエーターの運動はレーザー・ドップラー・バイブロメーターを用いて検出します。
主な結果
- 機械的特性の非侵襲的測定に成功しました。
- アクチュエーターの運動が組織サンプルに伝達されることの特徴づけ。
- 組織工学におけるμMREの有効性を実証しました。
- エンジニアリングされた構造の機械的挙動に関する洞察を提供しました。
結論
- 顕微鏡的MREは従来の試験の実行可能な代替手段です。
- エンジニアリングされた組織サンプルの保存を可能にします。
- この方法は組織工学の分野を進歩させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Non-destructive mechanical property assessment is critical for longitudinal tissue engineering studies where destructive testing compromises sample integrity and longitudinal tracking. Magnetic resonance elastography (MRE) enables repeated, quantitative monitoring of construct maturation without sample destruction, supporting go/no-go decisions in preclinical development. This approach reduces biological attrition risk by providing predictive, mechanistically relevant readouts aligned with functional tissue outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of structure-function relationships by correlating mechanical stiffness with differentiation states in adipogenic and osteogenic lineages.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of biomaterial and signaling conditions through longitudinal, non-invasive tracking of construct maturation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative shear stiffness maps with high correlation (R²>0.9914) to dynamic mechanical analysis, enabling assay standardization.
- Operational Value: Provides reproducible, voxel-level mechanical readouts suitable for high-content screening of scaffold and cell conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks mechanophenotypic changes during hMSC differentiation, linking mechanical evolution to tissue functionality.
- Operational Value: Enables continuous monitoring over multi-week studies, reducing need for endpoint destructive assays and supporting longitudinal study designs.
Pipeline & Workflow Integration
Positioned between early construct formation and functional validation, μMRE serves as a mechanistic bridge in the discovery continuum, informing lead candidate selection through quantitative biomechanical phenotyping.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by correlating temporal stiffness changes with lineage-specific differentiation, reducing ambiguity in target validation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (shear stiffness, storage/loss modulus) enabling comparison across construct formulations and culture conditions.
- Analytics: Supports statistical analysis of mechanical property trajectories, facilitating data-driven go/no-go decisions in construct optimization.
- Translational Research: Aligns mechanical readouts with tissue functionality, providing a translational biomarker proxy for construct maturity and host integration potential.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, non-destructive platform applicable across multiple tissue types (bone, cartilage, adipose) and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by linking mechanical phenotypes to functional tissue outcomes, reducing mechanistic ambiguity in preclinical models.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability through standardized actuator calibration, MRI synchronization, and automated stiffness mapping workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by preserving samples for multimodal analysis (e.g., histology, biochemical assays) and reducing replicate construct needs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of construct candidates based on quantitative, longitudinal mechanical maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in MRI physics, mechanical actuation, and inverse algorithm analysis for accurate stiffness quantification.
- Dependent on specialized instrumentation including piezoelectric actuators, laser Doppler vibrometers, and MRI-compatible delivery systems.
- Necessitates cross-team standardization of elastography parameters (frequency, gradient amplitude, bipolar pairs) across sites for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for varying construct sizes, gel compositions, and maturation timelines to optimize wave propagation and signal-to-noise.
- Practical limitations include longer acquisition times versus endpoint assays and potential signal attenuation in highly dense or calcified constructs.
