Name: メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル黄色ブドウ球菌（MRSA）ラットにおける (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶラットにおけるMRSA誘発感染性心内膜炎の実験モデル構築法。カテーテル挿入と尾静脈注射による感染誘導、組織の定量培養までの手順を解説。抗菌薬効果評価や病態研究への応用が可能です。

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この作品は、アメリカの心臓協会[助成金SDG 0630219NとAID 09GRNT2180065にYQX] [ASBに助成R01AI-39108]米国国立衛生研究所によってサポートされていました。

1。感染のMRSA菌株を準備する<ol><li>大豆寒天（TSA）平板トリプチケースヒツジ血液（特定の試薬や機器の表を参照）、-80の在庫管からのMRSAの文化の白金耳°Cを接種し、37℃で一晩インキュベートします。 </li><li>全く汚染がないことを確認する血液寒天プレート（同じようなコロニー表現型）に文化の純度を確認してください。 </li><li>ヒツジ血液TSAプレートから1コロニーを採取し、15ミリリットルスナップキャップチューブに5ミリリットルトリプチケースソイブロス（TSB）にコロニーを接種する。 </li><li> 200 rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートします。 </li></ol> 2。手術カテーテルの準備 10cmの長さに、滅菌鉗子で先端を押すことによって、一方の端を溶かし、ポリエチレンチューブ（Becton Dickinson社製、注文番号427401。PE10）を切り取ります。カテーテルの一端を封止する目的は、カテーテル検査中に出血を避けるためです。 3。事前のurgeryの準備と麻酔<ol><li>イソフルランと酸素の混合ガス（50％：50％）を含むチャンバー内で行われたSprague-Dawleyラット（ハーラン、インディアナポリス、インディアナ州の女性、250〜300グラム）は、麻酔薬が有効になるまで（例えば、筋肉が緩和され、ペダルの反射は存在しない）、およびガス混合物と、手術中に麻酔状態の動物を維持します。 </li><li>顎からちょうどBetadine、70％エタノールで胸骨下の首のエリアを清掃してください。 </li></ol> 4。外科的処置<ol><li>手術中無菌テクニックを使用しています。胸骨上に首だけの皮膚層を介して垂直に切開（1〜1.5 cm）を確認します。 </li><li>鈍的切開を使用して、湾曲した歯鉗子の2ペアを使用して、右頸動脈を露出させる筋膜を分離します。 </li><li>そっと首キャビティの動脈をプルアップ、シルク縫合糸の代わりに2つの10センチの長さ動脈の下に、露出した頭部の端に動脈を縛る、アルテにクリップを配置出血を防ぐために、RY。 </li><li>カテーテルイントロデューサー（Becton Dickinson社製、注文番号406999）を使用して、動脈の上部に小さな穴を作り、動脈の穴から鉗子でカテーテルを挿入し、クリップを削除し、心臓に向かってカテーテルをプッシュダウンするまでの抵抗満たされている。 </li><li>動脈の尾側端周りに緩い縫合糸を結ぶとによって決定されるカテーテルが所定の位置にあるときに絹縫合糸で固定カテーテルを固定します。i）カテーテルの長さ（4-5センチ）を挿入し、ⅱ）更なる発展への抵抗及びiii）のハートビートとカテーテルの脈動。実験の残りの場所にカテーテルを残す。 </li><li>過剰な縫合糸、カテーテルの端をカットし、カテーテルからの出血がないことを確認してください。首の皮膚の下に緩い端を押し込むと皮膚のクリップで皮膚を閉じます。 </li><li>麻酔から回復するまで暖かい場所にケージにラットを入れ、食料や水を提供しています。中に頻繁にラットをチェックして、後、麻酔からの回復。 </li><li>この手術は &quot;カテゴリE&quot;の手順です。痛みを生成手順は、動物に苦痛を伴うMRSA感染以来、鎮痛薬によって単調です。 </li></ol> 5。 MRSA感染<ol><li>感染症は、1と7日後に手術との間で行われるが、実験内での一貫性を保つことができます。 </li><li>クリーンラットの70％エタノールで尾、所望の細胞数（4月 10日から6月 10日までCFUほとんどの黄色ブドウ球菌株のために/動物）で0.5ミリリットルMRSAを注入します。尾静脈から静注し27 G 1/2インチの針で注意：MRSA培養はバイオセーフティーレベル2（BSL2）に属しており、人員や環境への適度な潜在的な危険を持っています。 </li><li>止血は、ケージにラットを返す前に発生するまで、サイトでの圧力を保持します。 </li></ol> 6。ラットおよび文化標的組織を生け贄に捧げる<ol><li>ペントバルビタールナトリウム（200 mgの腹腔内注射によってラットを犠牲にする/ kg）を1から6日後に感染後。 </li><li>彼女の背中にラットを置き、70％エタノールで胸を拭いてください。 </li><li>胸骨下の胸のV字型の切開を行い、心臓を露出させる胸骨の両側に肋骨の軟骨を切った。 </li><li>優しく心をプルアップし、心臓組織を介してクリップに近い大動脈へと心を解放するまで解剖する。 </li><li> 4x4のインチガーゼ内部に滅菌ペトリ皿に心を置き、左心室内壁カットスルーを行い、左サイド室を開きます。 </li><li>カテーテル留置のために視覚的に確認してください。調べ、ハサミとピンセットでバルブから植生を削除します。 </li><li>重さと均質化植生し、定量培養のためにPBSで段階希釈を行います。 </li></ol> 7。代表的な結果すぐに動脈にカテーテルを挿入し、心臓に向かって4〜5センチメートル約カテーテルを押し下げた後、抵抗値がexperienになりますCED。全く抵抗が検出されていない場合は、カテーテルが正常にカテーテルの配置に影響を与える可能性が心腔の左側に挿入されていない可能性があります。以前に9を公開し、適切なカテーテル留置は、 図1に示されています。 MRSA感染のサンプルの一部は、感染サンプルの感染率と純度の正確な生菌数を確認して定量的に培養する必要があります。さらに、植生から回収された生物は、接種で使用されているものと同じである必要があります。 表1は、Sの病原性の例を示し9以前に発行されたラットの心内膜炎モデルにおける黄色ブドウ球菌株 。感染症は、高Sでendocarditsを開発した後、すべての動物は10 5 10 6 CFUの接種で挑戦して3から6日の間に犠牲に心臓の疣贅と同様に、腎臓および脾臓における黄色ブドウ球菌の密度（ <st栄&gt;表1）。無菌バルブ培養したラットは感染していないと見なされます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3863/3863fig1.jpg" /> 図1。カテーテルは正しい場所（心腔の左側）にあり、多数の疣贅は、大動脈弁9の周りに表示されます。 <table border="1"><tbody><tr><td> 接種（アニマス数） </td><td colspan="3"> 組織の10 CFU / gをログに記録平均値±SDで： </td></tr><tr><td></td><td> 植生 </td><td> 腎臓 </td><td> 脾臓 </td></tr><tr><td> 10 6 CFU /動物（9） </td><td> 10.36±0.85 </td><td> 7.30±0.64 </td><td> 6.70±0.57 </td></tr><tr><td> 10 5 CFU /動物（8） </td><td> 9.93±0.53 </td><td> 7.14±0.53 </td><td> 6.44±0.63</td></tr><tr><td> 10 4 CFU /動物（7） </td><td> 3.46±0.50 * </td><td> 1.81±0.74 * </td><td> 1.58±0.59 * </td></tr></tbody></table> SD、標準偏差、P &lt;0.001 10 5 10 6 CFU-挑戦の動物に関して。 表1。S.ラットの心内膜炎モデル9の異なる接種と心臓の植生における黄色ブドウ球菌の密度。

<ol><li>Petti, C. A., Fowler, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+bacteremia+and+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis.</a> Cardiol. Clin. 21, 219-233 (2003).</li>
<li>Bashore, T. M., Cabell, C., Fowler, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Probl.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Update on infective endocarditis.</a> Curr. Probl. Cardiol. 31, 274-352 (2006).</li>
<li>Fowler, V. G. Jr, Justice, A., Moore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+hematogenous+complications+of+intravascular+catheter-associated+Staphylococcus+aureus+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Risk factors for hematogenous complications of intravascular catheter-associated Staphylococcus aureus bacteremia.</a> Clin. Infect. Dis. 17, 313-320 (1993).</li>
<li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals%3A+analysis+of+24%2C179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clin. Infect. Dis. 39, 309-317 (2004).</li>
<li>Hoen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+issues+in+the+management+of+infective+endocarditis+caused+by+gram-positive+cocci%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Special issues in the management of infective endocarditis caused by gram-positive cocci.</a> Infect Dis. Clin. North Am. 16, 437-452 (2002).</li>
<li>Moise, P. A., Hershberger, E., Amodio-Groton, M. I., Lamp, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+outcomes+when+utilizing+high-dose+%28%3E+or+%3D8+mg%2Fkg%29+daptomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical outcomes when utilizing high-dose (> or =8 mg/kg) daptomycin therapy.</a> Ann. Pharmacother. 43, 1211-1219 (2009).</li>
<li>Sakoulas, G., Brown, J., Lamp, K. C., Friedrich, L. V., Lindfield, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcomes+of+patients+receiving+daptomycin+for+the+treatment+of+Staphylococcus+aureus+infections+and+assessment+of+clinical+factors+for+daptomycin+failure%3A+a+retrospective+cohort+study+utilizing+the+Cubicin+Outcomes+Registry+and+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Ther%22%5BJournal%5D)">Clinical outcomes of patients receiving daptomycin for the treatment of Staphylococcus aureus infections and assessment of clinical factors for daptomycin failure: a retrospective cohort study utilizing the Cubicin Outcomes Registry and Experience.</a> Clin. Ther. 31, 1936-1945 (2009).</li>
<li>Xiong, Y. Q., Willard, J., Kadurugamuwa, J. L., Yu, J., Francis, K. P., Bayer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+evaluating+the+efficacy+of+antibiotics+in+a+rat+Staphylococcus+aureus+endocarditis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo bioluminescent imaging for evaluating the efficacy of antibiotics in a rat Staphylococcus aureus endocarditis model.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 380-387 (2005).</li>
<li>Peerschke, E. I., Bayer, A. S., Ghebrehiwet, B., Xiong, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gC1qR%2Fp33+blockade+reduces+Staphylococcus+aureus+colonization+of+target+tissues+in+an+animal+model+of+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an animal model of infective endocarditis.</a> Infect. Immun. 74, 4418-4423 (2006).</li>
<li>Ganesh, V. K., Rivera, J. J., Smeds, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+model+of+the+Staphylococcus+aureus+ClfA-fibrinogen+interaction+opens+new+avenues+for+the+design+of+anti-staphylococcal+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics.</a> PLoS Pathog. 4, e1000226(2008).</li>
<li>Boles, B. R., Horswill, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+biofilm+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal biofilm disassembly.</a> Trends Microbiol. , (2011).</li>
<li>Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+Infection+of+Methicillin+Resistant+Staphylococcus+Aureus+%28MRSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA).</a> J. Vis. Exp. (48), e2528(2011).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

ラットの心内膜炎は、細菌感染症9-11の治療における病態と抗菌薬のin vivo試験のために重要で、十分に特徴付けられた動物モデルである。さらに、ラットの心内膜炎モデルでは、急性および亜急性感染症の複合を表しており、密接に人間相手と人間の自然弁心内膜炎に似ています。また、住居内のカテーテルを伴って、それは古典的なバイオ関連感染症、臨床12一般的で困難な問題を表しています。最も重要なのは、ラットの心内膜炎モデルで生成された結果は高い再現性があります。 S.の病原性ラットの心内膜炎モデルにおける黄色ブドウ球菌は 、他の動物モデルとして、接種量、細菌の増殖期（ログ対固定）、動物の年齢、および動物の遺伝的背景9、13を含むパラメータの数によって異なります。手術の成功率は、Hです。研究者の技術的な専門知識と手術のスキルに依存ighly依存しています。手術の成功はによって測定することができる：1）手術から回復する動物の数、2）犠牲の時に正しい場所にカテーテル、3）植生心臓弁...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>血液寒天プレート、トリプチケースソイ寒天培地で5％ヒツジ血液（TSA） </td><td>ハーディ診断</td><td> A10BX </td><td></td></tr><tr><td>トリプチケースソイブロス（TSB） </td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 211825 </td><td></td></tr><tr><td>振とう培養</td><td> Labnet </td><td> I5311-DS </td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 427401 </td><td></td></tr><tr><td>カテーテルイントロデューサ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 6999 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isofluorance </td><td>西洋医学SUPPyは、（株） </td><td> 2147 </td><td>安全性および取り扱い情報に従ってください。 </td></tr><tr><td>外科手術用の器具</td><td>ファイン科学ツールと生物医学研究·インスツルメンツ株式会社</td><td></td><td>あなたのニーズに両社からインストゥルメントを見つける</td></tr></tbody></table>

メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;（mrsa）ラットにおける

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

心内膜炎を含む血管内感染症は、生命を脅かす感染症症候群は1-3である。 黄色ブドウ球菌でも、適切な抗菌剤の治療4-6容認できないほど高い罹患率と死亡率とそのような症候群の最も一般的なワールドワイドな原因となっています。メチシリン耐性S.による感染の増加黄色ブドウ球菌 （MRSA）は、バンコマイシンの臨床治療の障害とリネゾリドおよびダプトマイシン抵抗の増大の問題率の高さは、このような感染症患者のそれ以降のすべての複雑な管理を持っており、高い医療費の7、8に導いた。さらに、それは抗生物質による治療の成果と最新の研究が臨床現場で基づいているため、よく患者への患者から様々な宿主因子によって影響を受ける可能性があることが強調されるべきである。したがって、宿主因子は、動物から動物から類似しているでは血管内感染症の適切な動物モデルは、より多くのです。微生物の病原性と同様に、新規の抗菌剤の有効性を検討することが重要。ラットにおける心内膜炎は、密接に人間の自然弁心内膜炎を近似する十分に確立された実験動物モデルである。このモデルは、特定のブドウ球菌病原性因子の役割とブドウ球菌性心内膜炎のため抗生物質の治療レジメンの有効性を調べるために使用されています。本稿では、細菌の病原性と抗生物質治療に対する反応を調査するために使用することができる。MRSAによる実験的心内膜炎モデルを説明します。

メチシリン耐性による実験的ラットの心内膜炎モデル<em&gt; S.黄色ブドウ球菌</em&gt;。

メチシリン耐性の実験的心内膜炎モデル<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;（MRSA）ラットにおける

心内膜炎を含む血管内感染症は、生命を脅かす感染症候群である1-3。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、世界的に最も一般的な原因菌であり...

本手順の全体的な目的は、ラットにおける感染性心内膜炎の実験モデルを構築することです。まず、aureusを培養し、感染に使用する手術用カテーテルを準備します。次に、手術部位を処置し、動物に麻酔を施します。動物を麻酔した後、右総頚動脈から心臓に向かってカテーテルを挿入します。最終ステップとして、尾静脈注射によりaureusを動物に感染させます。最終的に、標的組織を摘出し、定量培養の準備を行います。急速性心内膜炎モデルなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、赤色心内膜炎モデルをin vivoイメージングシステム（Ivus）で使用できる点にあります。この手法は、病原性と抗菌薬の有効性など、口腔病原性の段階における重要な課題の解明に寄与します。一般的に、外科的手技が困難であるため、本手法に不慣れな方は習得に苦労する可能性があります。まず、冷凍ストックからM SSA培養物をループ一杯分、羊血寒天ス strips ケースに接種します。コンタミネーションがないことを確認した後、大豆カゼイン消化培地（Soy auger plate）で37 °Cで一晩培養します。プレートから1つのコロニーをピックアップし、15 mLスナップキャップチューブに入った5 mLのtry toay soy brothに接種します。接種物を振盪インキュベーターで37 °Cにて一晩培養します。まずカテーテルを準備するため、200 RPMに設定します。ポリエチレンチューブを10 cmの長さに切り、cex消毒液で30分間カテーテルを滅菌します。次に、滅菌済みのチューブの一端を加熱した滅菌鉗子で押して溶かし、右総頸動脈から左心室へと挿入し、心拍時に心内膜に損傷を与えるためのカテーテルを作成します。その後、麻酔が効くまで、イソフルランと酸素を1:1で混合したガスが入ったチャンバーにラットを入れ、麻酔をかけます。筋肉が弛緩し、足底反射が消失していることを確認して、麻酔状態を確認してください。ガス混合気につながれたノーズコーンを用いて、手術中の麻酔状態を維持します。手術の間、throughout the surgery、滅菌操作を用いてベタジンと70% ethanolで手術部位を洗浄します。ラットを背臥位に置き、鈍的剥離を用いて、胸骨上の頸部の皮膚層を垂直に切開します。筋膜を剥離して右総頸動脈を露出させます。右総頸動脈は、鎖骨より上の正中線からわずかに右側に位置しています。頸部腔から慎重に動脈を引き出し、露出した頭側端で結紮させるため、2本の10 cmのシルク縫合糸を動脈の下に通します。次に、出血を防ぐために動脈にクリップを留めます。鉗子を用いてカテーテル導入針で動脈の上部に小さな穴を開けます。カテーテルの密封されていない端を、動脈に開けた穴から挿入します。クリップを取り外し、カテーテルを心臓方向へ押し込みます

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JoVE Journal

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免疫能力のあるげっ歯類における肺感染症の確立方法が説明されています。熟練度があれば、この方法は迅速かつ容易に実行でき、肺炎球菌、インフルエンザ菌、緑膿菌、肺炎菌、バウマニー菌の多くの分離株で安定した感染を誘発することができます。...

免疫担当げっ歯類で堅牢な肺炎モデルはに対して抗菌有効性を評価するために<i&gt; S。ニューモニエ</i&gt;、<i&gt; H。インフルエンザ</i&gt;、<i&gt; K。ニューモニエ</i&gt;、<em&gt; P。緑膿菌</em&gt;または<em&gt; A。バウマニ</em

皮膚が負傷したに生得の免疫反応のリアルタイム検出とマウスの黄色ブドウ球菌感染症のためのアプローチを説明します。比較する LysM EGFP でマウス (蛍光好中球を所有) する LysM EGFP...

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