Name: 強制振動法を用いたマウスにおける呼吸器系の力学の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学ぶ強制振動法によるマウスの呼吸器系力学測定と気道過敏性評価の手法。flexiVentシステムを用いて正確な肺機能測定を行い、呼吸生理学研究の再現性を向上させる詳細なプロトコルを提供する。

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TKMcGは、カナダ胸部学会から学生の身分によってサポートされています。 レビューアの貢献すべての著者は原稿の構想に参加しました。また、TKMcGは、プロジェクトを開始した実験結果を収集、原稿の執筆とその批判的検討に貢献した。 ARは、収集、分析実験結果を、原稿を起草し、その批判的検討に貢献した。 LFは、実験結果を収集し、原稿の重要な見直しに貢献した。 TFSとJGMは、原稿の批判的検討に貢献した。

以下に説明する手順は、アニマルケア（CCAC）カナダ評議会のガイドラインに沿ってマギル大学動物実験委員会によって承認された。 1。準備手順<ol><li>ソリューション： <ol><li>メサコリン：50 mg / mlので原液を準備し、5をテストする濃度に基づいて段階希釈（1:1）を行う。溶液は5噴霧前に室温に到達させる。 </li><li>麻酔薬：さまざまなレジメンはマウスの種々の株（ 表1）の文献に報告されている注 ：レジメン1は、本プロトコルの下で使用されていました。 </li></ol></li><li>機器：現在のプロトコルはflexiWare 7ソフトウェアでサポートされている2つflexiVent世代のどちらにも適用されます。 研究の定義＆プランニング 、 実験Sessio：ソフトウェアの機能は、3つのモジュールの下にグループ化されnおよびレビュー＆レポーティング 。 <ol><li>システムの電源をオン（flexiVent FXのみ）および/ ​​またはソフトウェアを起動します。 </li><li>最初の実験セッションまたはそれ以前に、いつでも勉強構造を事前に定義するために研究の定義＆プランニングモジュールを開きます。 </li><li> 新しい研究でボタンを作成して、スタディを作成プロトコルの概要を説明し、検討するための実験グループと対象者を定義するには、ウィザードの指示に従ってクリックしてください。 </li><li> 実験セッションモジュールを開いて勉強し、テンプレートを選択するための起動シーケンスに従って実験·セッションを開始します。 </li><li>測定部位の対象を割り当て、その重量を確認。 </li><li>オペレーティングソフトウェアに記載されている手順に従うことにより、システムのキャリブレーションを続行します。あなたは、キャリブレーションのためにY-チューブに使用するカニューレ（ステップ1.3.3）を取り付けるために、1つの時点でプロンプトが表示されます。 </li><li> 重要なステップ。Repea取得した校正値が許容範囲外にある場合tは1.2.6のステップ。 （flexiVent FXや校正値のモジュール固有の許容範囲についてflexiWare 7のユーザマニュアルを参照してください）。 </li><li>キャンセルは、実験を開始する準備ができていない限り換気およびデータの記録を開始するように要求されます。これらは、後の時点で開始することができる。 </li></ol></li><li>被験者： <ol><li>麻酔薬の適切な用量（ 表1）を用いて被写体を麻酔。 </li><li>被写体が麻酔の手術レベルに達していることを確認します。被験者は、つま先のピンチに全く反応を示すべきではありませんし、その呼吸が規則的こじつけではないでなければなりません。 </li><li>気管切開を行い、気管カニューレを挿入。 <ol><li>その背中に動物を配置し、熱の源（ 例えば 、温度制御された加熱毛布やマウスから約45センチ過度の加熱を避けるために、位置60ワット電球とランプ）を提供します。 </li><li>クリーン番目アルコールを含む電子スロート面積を、皮膚切開を作り、そっと顎下腺、それをカバーする筋層を分離することにより気管を公開します。 </li><li>優しくマイクロ鉗子のペアを使用して気管を持ち上げ、その下に縫合糸を渡す。 </li><li>それを区画することなく、気管に小さな切開をする喉頭最寄りの軟骨の二つのリング間で切断。 </li><li>切開に以前に較正されたカニューレを挿入し、気管の内側に軽く約5リングの長さを、それを進める注 ：本実験は、1.2センチメートル長い金属18ゲージカニューレを用いて行った。 </li><li> 重要なステップは縫合糸を使用して所定の位置にカニューレを固定します。添付ファイルは、カニューレの周りに気密シールを形成すべきである。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2。人工呼吸器<ol><li>人工呼吸器に近い動物を持参してください。 </li><li>事前定義されたを選択することにより、機械的な換気を開始換気ドッキングウィンドウ内またはカスタマイズされた換気プロファイル。 </li><li> Y-チューブを経由して人工呼吸器に動物を接続します。 </li><li> 重要なステップは人工呼吸器に動物の位置を合わせ、気管カニューレが可能カニューレ閉塞または気管ねじれを避けるために、人工呼吸器と同じレベルであることを確認します。 </li><li> 重要なステップは 、カニューレを挿入し、添付ファイルを確認するために摂動名をダブルクリックすることで、 ディープインフレ摂動を実行します。漏れの不在下では、システムは、過度の体積変位（ 図1）を使用せずに3秒かけて30 CMH 2 Oの圧力を保持することができるべきである。これらはカニューレ閉塞または紛失している可能性がありますとして記録容積と圧力トレースはまた、オフセットなしの兆候や変形をスムーズにする必要があります。 </li><li>必要に応じて、心拍数、体温監視用バイタルサイン変換器を接続します。データ記録はeithe開始することができスクリプトを経由して、手動または自動でR。 </li></ol> 3。肺機能測定測定またはコマンド（ 例えばネブライザー活性化、イベントマーカー）高度に制御し、再現実験のプロセス（ 図2）のために事前定義されたか、またはカスタマイズされたスクリプトを使用して自動化することができます。パラメータの数を生じさせる摂動の六ファミリーはベースラインで被検体の呼吸器系の仕組みを説明するために使用され、指定されたチャレンジ（ 表2）に続くことができる。 <ol><li> 重要なステップ 。計測を開始する準備ができたら、閉じた肺領域を募集し、肺容量の履歴を標準化するディープインフレを実行します。 </li><li> 重要なステップ 。試験測定（ 例えばのPV-PまたはPVを-V）を実行して、自発吸気努力の不在を確認してください。 選択されたデータセットビュー内の圧力信号トレースを観察します。段階的なPV曲線と、圧力プラトーはよくない下向きのたわみを使用して定義されるべきである。圧力の下向きのスイングは、動物（ 図3）からの吸気努力を示すことになる。 </li><li>そのタイトルをダブルクリックすることで選択したスクリプトを開始します。本研究で使用されるスクリプトは、一般的な測定のために含まれて： <ul><li>三重のベースライン測定値のシーケンス。 </li><li>吸入メサコリンに対する気道反応性の評価のための噴霧器の活性化注 ：システムによってメッセージが表示されたら、食塩水またはネブライザーにメサコリンの溶液を約100μlのをロードします。噴霧が開始し、自動的に停止します。 </li><li>ネブライザーの活性化後、約3分の期間に密接に間隔測定（毎10〜15秒）のシーケンス。 </li><li>プロンプトは別の課題を実行し、測定のシーケンスを繰り返す注：Bで綿棒でネブライザーマウント内部乾燥etweenの課題は、吸気ラインの建物アップから水滴や結露を防ぐことができます。 </li></ul></li><li>実験の最後に、換気を停止し、件名を切り離す。 </li><li>オペレーティングソフトウェアの次の対象者に切り替え、その重量を確認。 </li><li> 重要なステップは、洗い流して乾燥した噴霧器、アダプタ、Y-チューブ、および被験者間カニューレ。 </li><li> 3.6手順1.2.6を繰り返します。 </li><li>一日の終わりには、実験的なセッションを閉じます。すすぎ、乾燥噴霧器、アダプタ、Y-チューブ、及びカニューレを、製造業者の指示に従って実験室を離れる前に、システム呼気バルブをきれいにすることを忘れないでください。 </li></ol> 4。データ解析ソフトウェアは自動的に計算し、摂動に関連付けられているパラメータが表示されます。また、データに数学的モデルの適合を反映し決定係数（COD）を提供します。 INSUと各データセットソフトウェアによって除外としてfficient CODはラベルが付いています。実験的なセッションの見直し、データの再解析およびエクスポートのシナリオの作成 ​​は、ソフトウェアのレビュー＆レポーティングモジュールで行われます。 <ol><li> レビュー＆レポートのモジュールを開き、輸出シナリオを作成し、唯一の十分なCODを持つデータセットを含むように世話をして。 </li><li>必要なパラメータ、圧力またはフローボリューム曲線、生のデータセット信号またはスプレッドシート·アプリケーションの対象情報（ 表3参照）としてエクスポートします。 </li><li>時間の関数としてプロットし、各パラメータの平均ベースライン測定は、すべての測定（ 図4参照）。その後、曲線下面積を計算曲線の一般的なプロファイルを分析したり、統計分析を実行することもできます。 </li><li> 、メサコリン濃度の関数としての気道反応の結果を表現し、各被験者には、パラメータおよび実験条件を決定し、特定するには点（ 例えばピーク時）または各メタコリンチャレンジ後の特定の時間。各実験条件（ 表4、図5）のグループの平均およびレポートやプロットの結果を計算します。 </li><li>正規化を適用する（ 例：％ベースライン）や統計分析を行う;また指定されたパラメータのベースライン値（ 図5C PC 200）の倍増を生産濃度を算出考えるかもしれません。 </li></ol>

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それは喘息や他の肺疾患に関連する気道機能障害の継続的な研究は、疾患および治療の選択肢の発達の根底にあるメカニズムの理解に優先ままである。モデル気道疾患へのマウスの使用は、これらの病気のメカニズムへの理解を得るに不可欠となっています。マウスのような小さな対象における気道機能障害を評価検討する際に、肺機能を測定するためにそれによって信頼性の高い正確なツールを持つことは重要である。また、気道機能障害又は治療効果の位置に洞察を提供することができるツールを有する非常に貴重である。 FOT技法は、すべてのこれらの属性を組み合わせて、生理的変化を評価するために、強力な統合及び翻訳アプローチを提供します。 マウスにおけるこのタイプの測定を成功させるために、特別な注意が気管内でCAの抵抗、システムの較正、すなわち、いくつかの手順に与えられるべきであるnnula、ネブライザーの種類（だけでなく、その動作設定）動物の位置と肺ボリューム·ヒストリーの標準化。また、被験者の呼吸器系は、測定中の受動有効なままであるデータセットを得るために不可欠である。これは、無呼吸（ 表1参照） を誘導するために被験体の深い麻酔平面で、または過呼吸による仕事、筋麻痺剤の投与によって達成することができる。必要に応じて、マウスでの測定のために必要なスキルを取得しながら、研究者は、テスト負荷で、マスタリングシステムとそのオペレーティングソフトウェアによって起動することができます。その後、疾患モデルや処置マウスに移動する前に、ナイーブ動物での再現性のある結果を生成するために論理的であろう。呼吸研究における疾患モデルの重要な割合は、そのようなアレルゲン、毒素、汚染物質、タバコの煙やガス、measuremenで得られた結果の変動としてエージェントに動物をさらす伴うのでこの資料に記載されているT技術が故に使用される露光手順によって影響を受けることができた。キー実験プロセスの標準化（ 例えば、コンピュータ制御露光及び測定システム6,13を用いて、14）は 、潜在的にばらつきを減らすのに重要な影響を及ぼす可能性がある。 強みと同様の手法の限界を強調しながら、この記事で紹介した例には、ナイーブと塩素曝露したマウスの実験からの典型的な結果の選択を表す。 図6の例から分かるように、この技術は、再現性の肺機能測定値を生成することができる。同様の基準抵抗値はマウス系統との間に報告されたが、エラスタンスの違いは、しかし、15を観察した。実質的な変化は、乳児および成体マウス16との間予想されることもある。このような目のような生体内の生理学的評価、高精度の結果、 内の他の場合とFOTによって生成された大証は、被験者の自然な状態へと譲歩が付属しています。表現型の不確定性原理1と呼ばれているこの原則は、測定値は、麻酔で行われた（または経口挿管）tracheotomisedと機械的に科目を換気する必要があるという意味で、現在のプロトコルに適用されます。技術のもう一つの制限は、データに一定の位相モデルのフィット気管支収縮の程度のレベルの上に貧弱であるため、データは塩素曝露群の最高濃度では使用できません図5D-5Fで観察されています。しかしながら、深刻なbronchoconstricted動物を直接ZRS 15を分析することによって、または例えば基準に機械的機能17の不均一性を取って、より複雑な数学的モデルに適合するように、サードパーティのポスト解析ソフトウェアを用いて評価することができる。動物の気道が十分に電話でない場合は除外されたデータセットも観察することができますassiveまたはカニューレの抵抗値が高すぎる場合。経験則として、カニューレの抵抗はベースライン時に動物の抵抗を超えてはならない。大きな内径および/またはより短い長さのカニューレの操作カニューレ抵抗を減らすのに役立ちます。最後に、マウスにおけるFOT測定の本デモンストレーションは時間がかかり、したがって、あまり効率的手法として知覚され得るか、または低侵襲性の技術と比較して長期的な研究にはあまり適用可能である。しかし後者は、その成果の基礎に関して不確実性が多大に関連付けられており、1欠陥があるとして多くの人に見られる。繰り返し侵襲的測定は技術的に難しく17が、経口挿管動物で可能です。 提供された例から、結果は呼吸力学の測定値を生産でflexiVentシステムの2つの世代の同等性を実証し、同様に気道hyperreacマウスで塩素暴露後吸入メタコリンへtivityと過敏。生理学的変化又は疾患モデルを特徴付けるまたは理解するために使用される場合、技法に関連した詳細な測定の態様は、現在の知見を拡張するために寄与することができる。

小動物における肺の機械的性質を十分に特性化は、呼吸器科学にマウスモデルで急成長するので、必要不可欠となっています。強制振動法（FOT）、また、ヒト被験者に使用される技術を使用して実行する場合は、これらの測定は、意味のある生理的な変化を研究するための強力な、統合および並進的なアプローチを提供します。 FOT測定は、典型的には事前に定義され、小振幅、被験者の気道開口部1で適用気流振動波形（また、摂動又は入力信号と称する）に反応して取得した圧力および容量信号を分析することによって得られる。最も単純な形式では、FOT摂動は、明確に定義された周波数で単一の正弦波形となる。より複雑な摂動は通常広いスペクトルをカバーする特定の（互いに素）周波数の波形の選択の重ね合わせで構成されています。マルチ周波数の分解フーリエ変換を使用して構成要素への入力信号と出力信号は、呼吸器系の入力インピーダンス（ZRS）の計算を可能にする、摂動2に含まれるすべての周波数で、入力信号と出力信号との間の伝達関数、即ち 。したがって、FOTは、単一のマニューバー2の周波数範囲にわたって呼吸力学の同時評価を可能にします。インピーダンスデータへのフィッティング高度な数学モデル（ 例えば一定の位相モデル3）その後、気道（中枢および末梢）と実質肺組織に依存するパラメータ1、3への応答のパーティショニングを許可します。生理学的反応（ 例えば、呼吸頻度、一回換気量、肺容量、上気道、自発呼吸努力、測定のタイミング）に影響を及ぼす多くの要因は、測定システムおよび実験手順によって制御され、標準化されているので、1の技術は、キャップですそれが正しく行われていることを条件に正確で再現性のある測定値を生成することができる。この記事の目的は、マウスにおいてこのような測定を実行するために必要な手順の詳細な時系列な説明を提供することである。準備段階（試薬、機器や科目）、機械換気、肺機能測定、データ解析：プロトコルは4つの部分から構成されています。コンピュータ制御ピストンベンチレーター（flexiVent、SCIREQ株式会社、モントリオール、QC、カナダ）を使用して生成された呼吸器系の力学の代表的な結果の例が提供されています。これらはナイーブマウスから同様に気道炎症、上皮細胞の損傷や吸入エアロゾルメタコリン4へ増加気道過敏性によって特徴付けられる気道損傷の酸化ストレスドリブンモデルから得られた。このプロトコルは、多くの場合、吸入メタコリンに対する気道応答性を評価するために使用されているが、それは他の成果とvariouのに延び喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺気腫、肺線維症、肺損傷、並びにヒトの疾患に類似病状のトランスジェニックマウスモデルに含め秒病理。このツールを使用して研究成果は、生理学的な変化や疾患モデルのよりよい特性評価および理解するだけでなく、新たな研究分野への展開に貢献することができます。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;試薬&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acetyl-&amp;#946;-methylcholine chloride </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2251</td><td>メタコリン</td></tr><tr><td>マイクロアドソン鉗子、鋸歯付き 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC31 鉗子、鋸歯付き・湾曲型</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>アイリス剪刀、タフカット、直線型 11.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>スプリング剪刀、刃 2.5 mm、直線型</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>非滅菌鈍端針 (18g x &amp;frac12;")</td><td>Brico Medical Supplies Inc.</td><td>BN1805</td><td>気管内カニューレ</td></tr><tr><td>非滅菌 5-0 シルク縫合糸</td><td>Seraflex</td><td>IDI58000</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ</td><td>Starstedt</td><td>SS-4001</td><td></td></tr><tr><td>1 ml TB シリンジ</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l フィルターチップ</td><td>Biosphere</td><td>70.760.211</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;装置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flexiVent&lt;/em&gt; FX</td><td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SCIREQ Inc.</a></td><td>sales@scireq.com</td><td>&lt;a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"&gt;www.scireq.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Aerogen Aeroneb ネブライザー</td><td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SCIREQ Inc.</a></td><td>sales@scireq.com</td><td>&lt;a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"&gt;www.scireq.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

強制振動法を用いたマウスにおける呼吸器系の力学の評価

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

強制振動法（FOT）は、包括的な、詳細、正確かつ再現性のある方法で、マウスでは肺機能の実験的評価を可能に強力な、統合及び翻訳ツールです。それは、事前定義された、小振幅、通常は、被験者の気道開口部に適用される振動気流波形への反応で得られた圧力と容積信号の解析を通じて呼吸器系の力学の測定値を提供します。現在のプロトコルの詳細を十分にコンピュータ制御ピストンベンチレーター（flexiVent; SCIREQ株式会社、モントリオール、QC、カナダ）を使用して、マウスでは強制振動の測定を実行するために必要な手順。準備工程、機械式換気、肺機能測定、データ分析：記述は、4つの部分に分かれている。また、麻酔したマウスに吸入メサコリンに対する気道反応性を評価する方法の詳細は、このtechniquの一般的なアプリケーションが含まれていますまた、他の成果や各種肺病態にも及ぶ電子。ナイーブマウスで同様に気道損傷の酸化的ストレスドリブンモデルから得られた測定値は、このツールは新しい研究分野のアプリケーションに同様に研究さ生理的変化や疾患モデルのよりよい特性評価および理解にどのように貢献できるかを説明するために提示される。

呼吸器系の力学測定 。 表4は、ベースラインとflexiWare 7ソフトウェアでサポートされる2つのflexiVent世代のどちらかを使用して、次のメサコリン誘発性気管支収縮（12.5 mg / mlの）で得られたナイーブ/ Jマウスからの典型的な結果を示しています。呼吸器系の力学、閉胸条件下ですなわち、（スナップショット150、プライム3クイック、それぞれ）密集した形で発振家族を強制シングルとブロードバンド周波数の摂動を交互にすることにより評価した。換気は、測定中に一時停止しているので、プライム-8と同様の周波数範囲をカバーする、より短い期間（3対8秒）を有するクイックプライム-3、の影響を最小限に抑える、無呼吸の期間を短縮するために、選択された血液ガス上の摂動とレスポンスの良好な分解能を提供します。各摂動に関連付けられたパラメータをAUTOMATICA算出したLLYオペレーティングソフトウェアによって。結果はflexiVentシステムの2つの世代が呼吸力学の同等の測定値を生成していることを示しています。 肺応答のサイト 。肺応答のサイトを区別することは薬理学的介入6の潜在的なポイントを識別するために、調査員はさらに同様に影響を受けた地域を特定することができます。測定が行われる、それに対して呼気終末圧力は3〜9 CMH 2 O（ 図6A、スナップ-150）に増加した場合、例えば、ナイーブ/ Jマウスは、基準抵抗の増加を示す。本実施例では、広帯域FOT測定（クイックプライム-3）の使用は、抵抗値の変化のための基礎を明確にするために詳細を設け：呼気終末圧力の変化と一致して（R N）気道抵抗における減少をもたらし高肺気量の気管支拡張効果と大きなインフレプレスURE（ 図6D）及び組織減衰（G; 図6E）の増加、密接に組織粘弾性、おそらく小気道7の抵抗を反映した組織抵抗に関するパラメータ。後者は増加する肺容量を増加することが知られている。 気道過敏性 。塩素ガス曝露後、吸入メサコリンに対する気道反応、気道損傷4（ 図2）の結果として、BALB / cマウスにおける大気暴露に比べて増加します。塩素は、特に上皮細胞に、気道における構造的な細胞の破壊につながる、および炎症性細胞の動員を誘導し、酸化ストレスを誘発することが知られている。 図5に示されるように、呼吸器系の仕組みを説明するすべてのパラメータの変化が増大メタコリンの課題に応じて見ることができる。空気にさらされたマウスと比較して、マウスは、塩素系に曝さneのガスは、全てFOTパラメータ（ 図5A、5B、5D〜5F）ならびに抵抗が2倍 ​​を引き起こすのに必要メタコリン濃度の減少によって例示濃度応答曲線の統計的に有意な左方向にシフトで大きな最大の応答を表示とエラスタンス（PC 200、 図5C）。これらの結果は、それぞれ、塩素ガスへの暴露後吸入メサコリンに対する気道過敏性と過敏性を示しています。 他の測定 。 FOTに加えて、flexiVentシステムは、肺機能8-10又は心血管系11の測定値の他のタイプを収集するために使用することができる。 図7は、ベースライン条件の下でナイーブ/ Jマウスにおける代表段階的に、圧力駆動圧力容積曲線を表示する。曲線のデフレ手足の上部はサラザール·ノウルズ方程式12にフィットさ</<html> &gt;（商標）とパラメータは、ソフトウェアによって自動的に計算されます。 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table1.jpg" alt="表1" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table1highres.jpg" fo:content-width="6in" /> 表1。マウスで使用される麻酔薬レジメンの例としては、。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table1large.jpg" target="_blank">大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table2.jpg" alt="表2" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table2highres.jpg" fo:content-width="5in" /> 表2。マウスでの肺機能測定に使用摂動。システムに必要*延長。主題はまた、測定中に閉じたプレチスモグラフチャンバ内にする必要がある。痩せ細った&quot;&gt;大きな表を表示するには、ここをクリックしてください。 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table3.jpg" alt="表3" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table3highres.jpg" fo:content-width="6in" /> 表3。シングルとブロードバンド周波数強制振動摂動家族からエクスポートされたパラメータの例は <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table3large.jpg" target="_blank">大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table4.jpg" alt="表4" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table4highres.jpg" fo:content-width="6in" /> 表4。システム比較。肺力学の比較パラメータはflexiWare 7ソフトウェアによって運営flexiVentシステムの2つの世代を使用して収集。結果は、ナイーブ/ Jのマウス（n = 5 /で生成された<html>ベースラインと次のメサコリン誘発性気管支収縮（MCH 12.5 mg / mlの）でのグループ）。 *グループが繰り返し測定し、分散の均一性（;グラフパッドソフトウェア、サンディエゴ、USAグラフパッドプリズム、バージョン5.03）のための個々の応答のログ10のための2つの配置ANOVAを用いて比較した。 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1highres.jpg"/> 図1。深い肺インフレのスクリーンショット。上部パネルは、人工呼吸器のピストン（赤のトレース）と被写体（グレーのトレース）に配信ボリュームによって変位量を示しています。下部パネルは3秒かけて30 CMH 2 Oの設定圧力まで上昇シリンダ圧を表示し、同じ期間一定に保持した。 172/50172fig2.jpg &quot;ALT =&quot;図2 &quot;/&gt; 図2。ベースライン時の呼吸器系の力学を評価するために使用される典型的なスクリプトの一例を示す。 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。段階的に圧力-容積曲線の実行中に自発吸気努力。 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4.jpg" alt="図4" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4highres.jpg"/> 図4。経時応答以下は、吸入メサコリンの課題を増やし 、 その結果を 5ナイーブ自発的に過敏/ Jマウスの群の平均（±標準偏差）として表されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig4large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot; FO：キープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5.jpg" alt="図5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5highres.jpg"/> 図5。増加メサコリンにおける課題塩素と空気暴露BALB / cマウスに続く呼吸器系の力学の変化。ピーク値は、すべての教科や実験条件の各パラメータに同定された。グループの平均は、次いで（であり、n = 4-6、平均値±標準偏差）を算出した。群間の差は、分散の均一性のための個々の応答のログ10を用いて分散分析によって評価した。ベースラインの倍増（PC 200）を製造メタコリンの濃度は、個々の用量応答曲線と近似曲線の補間に二次多項式を当てはめることによって得た。データポイントは、塩素に暴露したマウスでD、EとFで欠落している。データへの数学的モデルの貧弱なフィット感を反映して決定不十分高い係数による2最高メサコリン濃度で。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig5large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6.jpg" alt="図6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6highres.jpg"/> 図6。気道および肺組織の力学に呼吸応答の分割。実験トレースは、2つの異なる呼気終末圧力で三重の呼吸力学のシングル（2.5 Hz）で、ブロードバンド（1-20.5Hz）周波数強制振動の測定を示すナイーブ/ Jマウスから（3＆9 CMH 2 O）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig6large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するにはここをクリック</a> </&gt;。 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7.jpg" alt="図7" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7highres.jpg"/> 図7。ベースライン条件の下でナイーブ/ Jマウスにおける圧力-容積曲線。圧力-容積曲線はそれぞれのマウスの肺を独立してその状態を、同一の圧力に膨張されたことを確認するために段階的に圧力駆動摂動（のPV-P）を使用して生成された。個々の圧力 - 容積曲線から抽出されたサラザール-Knowlesの式のパラメータもまた平均化され、テーブル形式で報告された。結果は平均±標準偏差（n = 6）のように表される。

SCIREQ株式会社、モントリオール、QC、現在のプロトコルでは、呼吸器系の力学の測定と同様に強制振動技術を使用してマウスで吸入メサコリンに対する気道反応性の評価（flexiVentを実行するために必要な手順の詳細なステップバイステップの説明を提供しています、カナダ）。

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

本手順の全体的な目的は、市販のコンピュータ制御ピストンベンチレーターであるflex eventを用いて、マウスの呼吸力学における強制振動測定を実演することです。これは、吸入メチルコリンに対する気道反応性の評価を通じて行われます。最初のステップは、必要な試薬、装置、および被験体の準備です。次に、被験者を人工呼吸器に接続し、機械的換気および呼吸力学の測定を行います。あらかじめ定義されたスクリプトを用いて、ベースライン時およびメチルコリン負荷後の高度に制御された一連の自動測定を実施します。結果を解析することで、対照群と比較して塩素に曝露したマウスにおいて、抵抗およびエラスチンの最大反応がより大きいことから、気道過敏性が認められることが示されます。既存の手法に対する本手法の主な利点は、包括的かつ詳細で、トランスレーショナルな方法で肺機能を測定するための正確なツールを提供できる点にあります。これは、被験者の気道開口部に適用された事前定義の振動気流波形に対する反応として得られた圧力および容量シグナルの解析を通じて達成されます。さらに、生理的反応に影響を与える多くの要因を制御し、標準化することが可能です。本法を用いて、Flex event FXシステムを起動し、ソフトウェアを開始します。本プロトコルは、flexiでサポートされている2つのflex event世代のいずれかに適用可能です。最初の実験セッション時、またはそれ以前の任意のタイミングでソフトウェアを起動してください。スタディ定義・プランニングモジュールを開き、スタディ構成を事前定義します。「新しい研究を作成」ボタンをクリックし、ウィザードに従って研究を作成します。プロトコルの概要をまとめ、実験群および研究対象者を定義します。「実験セッション」モジュールを開き、起動シーケンスに従って実験セッションを開始します。研究およびテンプレートの選択を行います。測定部位に被験者を配置し、体重を確認します。操作ソフトウェアに記載されている手順に従い、システムのキャリブレーションを進めてください。キャリブレーションに使用するカニューラをY字チューブに取り付けるようプロンプトが表示されます。キャリブレーションウィザードの手順に従ってカニューラのキャリブレーションを継続し、得られたキャリブレーション値が指定範囲内にあることを確認してください。必要に応じてキャリブレーションプロセスを繰り返します。準備が整うまで、換気およびデータ記録を開始するプロンプトはキャンセルしてください。これらは後で開始することができます。適切な用量の麻酔剤を用いて被験体を麻酔してください。被験体が外科的麻酔レベルに達していることを確認します。被験体は足指へのピンチ刺激に反応せず、呼吸は規則的で努力性呼吸がない状態である必要があります。適切な体温を維持するために、熱源を用いて動物を背臥位に配置します。マウスから45 centimeter離して設置した60 wattの電球で十分です。次に、気管を露出させるために喉の周辺をアルコールで清浄します。切開を行い、顎下腺とその被覆筋層を慎重に分離します。マイクロフォーセップスを用いて、気管をそっと持ち上げます。次に、その下に縫合糸を通します。喉頭に最も近い2つの軟骨環の間を切断します。これにより、気管を完全に切断することなく、小さな切開を加えることができます。校正済みのカニューレを切開部に挿入し、気管輪5個分を通過するようにゆっくりと進めます。この例では、1.2 centimeterの18ゲージ金属製カニューレを使用しています。縫合糸を用いてカニューレを確実に固定することが重要です。アタッチメントはカニューレの周囲を気密に密封する必要があります。カニューレを挿入した動物をベンチレーターに近づけます。ベンチレータードッカーで事前定義済みまたはカスタマイズされた換気プロファイルを選択し、機械換気を開始します。次に、Y字チューブを介して動物を人工呼吸器に接続します。動物と人工呼吸器の位置を慎重に合わせ、気管カニューレが人工呼吸器と同じ高さにあることを確認してください。これにより、カニューレの閉塞や気管のねじれが発生するのを防ぐことができます。摂動名の項目をダブルクリックして深部膨張摂動を実行し、カニューレの挿入および接続を確認します。リークがない限り、システムは過度な容量変位を伴わず、3秒間にわたって30 cmH₂Oの圧力を維持します。記録された容量および圧力のトレースは、オフセットや変形の兆候がなく、滑らかである必要があります。それ以外の場合、この時点でカニューレによる閉塞や、挿入位置の誤りがある可能性があります。必要に応じて、心拍数および体温モニタリング用のバイタルサイン・トランスデューサーを接続できます。これらの信号のデータ記録は、手動またはスクリプトによる自動操作で、いつでも開始することが可能です。ネブライザーの作動、イベントマーカーなどの測定やコマンドは、定義済みまたはカスタマイズされたスクリプトを使用して自動化でき、これにより高度に制御された再現性の高い実験プロセスが可能になります。ベースライン時および特定の負荷後における被験者の呼吸器系力学を記述するために、多数のパラメータを導き出す6つの摂動（perturbation）ファミリーを使用できます。測定を開始する際は、まず深吸気摂動（deep inflation perturbation）を行い、閉塞した肺領域をリクルートさせ、肺容量の履歴を標準化することが重要です。次に、テスト測定を行い、自発呼吸がないことを確認します。選択したデータセットビューで圧力信号のトレースを観察してください。段階的なPV曲線を用いて行います。圧力プラトーは、下方への偏向がなく、明確に定義されている必要があります。圧力が低下した場合は、動物による吸気努力を示しています。次に、そのタイトルをダブルクリックして、吸入メチルコリンに対する気道反応性の評価用スクリプトを開始してください。この例では、スクリプトによってベースライン測定を3回ずつ繰り返し行います。次に、ネブライザーに生理食塩水を充填するように促すプロンプトが表示されます。または、この例のようにメチルコリン溶液を使用する場合は、約100 µLの溶液をネブライザーに充填してください。ソフトウェアに情報を入力すると、すぐにネブライゼーションが自動的に開始されます。ネブライゼーション終了後まもなく、約3分間にわたって間隔を詰めた一連の測定が開始されます。次に、実行を促すプロンプトが表示されます。別のチャレンジが提示され、各チャレンジ間で測定シークエンスを繰り返すことができます。綿棒でネブライザーマウント内部を拭き取ることで、吸気ライン内への液滴の蓄積や結露を防ぐことができます。データが収集されるにつれて、ソフトウェアが摂動に関連するパラメーターを算出し、データとモデルの適合度に基づいた決定係数を提供します。その後、ソフトウェアのレビューおよびレポート作成モジュールを通じて実験データにアクセスし、データの書き出しやさらなる解析を行うことができます。実験終了後、換気を停止して被験体を切り離します。切り離した後、ペントバルビトールナトリウムを過剰投与して速やかに動物を安楽死させ、その後、気管支肺胞洗浄を行うか、あるいはさらなる解析のために肺を摘出します。次の被験者に移行する前に、ネブライザーアダプターのY字チューブとカニューラをすすいで乾燥させます。操作ソフトで次の被験者に切り替え、その体重を確認してください。その後、実験を続行する前に、推奨される校正手順を行ってください。一日の終わりに、装置をすすいで乾燥させてください。システムの性能を維持するため、実験セッションを終了する前に、製造元の指示に従ってシステムの呼気弁を洗浄することを忘れないでください。以下の例は、ナイーブマウスおよび塩素曝露マウスの実験から得られた典型的な結果の選択例であり、ナイーブ aj からも同等の結果が得られています。FlexiWear 7でサポートされている2つのFlexEvent世代のいずれかを用いて、ベースライン時およびメチルコリン誘発気管支収縮後のマウスのデータを取得しました。広帯域FOT測定では、肺の反応を気道パラメータと肺実質組織パラメータに分割できるため、影響を受けた肺領域を特定する手段となります。例えば、未処置のAJマウスでは、呼気終末圧を3 cmH₂Oから9 cmH₂Oに上昇させると、ベースライン抵抗が増加しました。呼気終末陽圧の変化により、肺容量の増大と膨張圧の上昇に伴う気管支拡張作用と一致して気道抵抗が減少し、組織抵抗に関連し組織の粘弾性や小気道の抵抗を反映するパラメータである組織ダンピングが増加しました。後者は肺容量の増加に伴い増大することが知られています。このプロトコルは、塩素ガス曝露後の吸入メチルコリンに対する気道反応性を評価するためにしばしば用いられます。B.SEAマウスは、空気曝露対照群と比較して気道過剰反応を示しました。本例では、塩素ガスに曝露したマウスは、すべてのFOTパラメータにおいてより大きな最大反応を示しました。また、これらのマウスは、吸入メチルコリンに対する濃度反応曲線の統計的に有意な左方シフト、すなわち過敏症を示しました。これは、抵抗およびエラスチンを2倍に増加させるのに必要なメチルコリン濃度の低下によって例証されます。FOTに加えて、flexイベントシステムでは、圧力-容量曲線などの他の測定値を記録することができます。呼気相の上部はSalazar Knolls式に適合させ、関連するパラメータはソフトウェアによって算出されます。この手法を成功させるには、各ステップに注意を払うことが重要であり、特にシステムのキャリブレーション、気管カニューレの抵抗、動物の配置、および肺容量の標準化が重要となります。これらの手順を正確に踏むことで、本手法によりマウス肺の機械的特性を正確に特性評価することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

呼吸生理学の評価は、伝統的に、動物の拘束や鎮静を必要とする技術、に頼っています。非拘束全身プレチスモグラフィは、しかし、動物モデルにおける呼吸生理学の正確な、非侵襲的、定量的な分析を提供する。また、この技術は長期的な研究を可能にしたマウスの繰り返し呼吸評価を可能にする。...

拘束されていない全身プレチスモグラフィを使用したマウスにおける呼吸機能の測定

本稿の目的は、二重チャンバー容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能を評価するための推奨される手順の詳細な説明を提供するためにです。...

ダブル室容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能の評価

非拘束的な気圧胸膜造影は、目覚めたマウスの呼吸パターンを定量化するために使用される。標準化されたプロトコルの下の15のセグメントは、静かな呼吸の延長持続時間と同様の値を表示することを示しています。この方法論はまた、チャンバーの最初の1時間の間に無呼吸および拡張呼吸の定量化を可能にする。...

非拘束的な圧膜検査を通じた老化マウスの呼吸パターンの取得方法

呼吸力学を特徴付けるために強制振動技術(FOT)の使用がますます利用されるにつれて、初期の技術ガイドラインおよび様々な製造業者の勧告に関して方法を標準化する必要がある。方法の標準化を容易にするために、2つのケースのFOT評価と解釈を含む詳細なプロトコルが提供されています。...

成人の呼吸力学の評価のための強制振動技術の採用

呼吸オシロメトリーを実施するための標準操作プロトコルを実証し、主要な品質管理と保証手順を強調しています。...

外来患者環境での呼吸オシロメトリーの実施

提案されたセットアップにより、マウスとラットの 3D...

人工呼吸器マウスとラットの呼吸運動の3Dシネ磁気共鳴画像法

DNA二本鎖切断に対する応答のSer -...

電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価

DT40、モデル脊椎動物の遺伝学的システムは、タンパク質の機能を解析する強力なツールが用意されています。ここでは、単一分子レベルでのDT40細胞におけるS期の間にDNA合成に影響を与えるパラメータの定性的な分析を可能にするシンプルな方法を説明します。...

DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化

我々は、ライブでキューティクルを可視化する手法を提案...

の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）</em親油性生体染色色素、DIIを使用する>キューティクルの構造

ここでは、液体窒素を充填したデュワータンクからサンプル取得のための低コスト、耐久性のあるcryotolerantデバイスを提示します。装置の構成とモジュール設計のしやすさ、安全かつ容易に極低温タンクからのサンプル取得のプロセスになります。...

凍結保存サンプルの回復のための日曜大工のデバイスが誤って低温貯蔵タンクに落とし

学ぶ強制振動法によるマウスの呼吸器系力学測定と気道過敏性評価の手法。flexiVentシステムを用いて正確な肺機能測定を行い、呼吸生理学研究の再現性を向上させる詳細なプロトコルを提供する。

強制振動法を用いたマウスにおける呼吸器系の力学の評価

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