Name: の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）キューティクルの構造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学ぼう、Caenorhabditis elegansのキューティクル可視化法。親油性蛍光色素DiIを用いて、生きた線虫のクチクラ構造を蛍光顕微鏡で観察する簡便かつ高解像度の手法です。

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我々はS.タネジャ-バゲスワル、K. Beifuss、S. Kedroske、そしてHCに感謝したい。有用な議論のためのシャオ。この作品は、分子細胞医学のTAMHSC省からの資金投​​入を開始することによって資金を供給された。化合物の範囲や回転するディスクは、部門とディーンのTAMHSC Officeが提供する資金で購入した。一部の菌株は、研究資源のためのナショナルセンターによって資金を供給される線虫遺伝学センターによって提供されていました。 pRF4は（ROL - 6（su1006））A.火災の贈り物だった。

1。 DIIの調製染色<ol><li> DMF中20 mg / mLのDII（Biotium、（株）、ヘイワード、カリフォルニア州）のストック溶液を調製。 DIIは、敏感な光なので、ホイルで包むことによって光からDIIを保護する。 </li><li>各集団に対して399.4μLM9は0.6μLDIIの株式を追加することにより、DIIの希釈率を作成します。これは、30μgの/ M9のmLのDIIの最終的な希釈率を与える必要があります。これは、同時に複数の集団を染色するためにスケールアップすることができます。ホイルにチューブ（s）をラップすることによって、光からシールドDII。 </li></ol> 2。線虫の調製<ol><li>汚染されていない線虫の人口を含む60 mmのプレートを使用してください。静かにすべての幼生と成体の動物を緩めるために板の表面全体に円を描くように液体を渦巻くことでM9バッファーに0.5％トリトンの解X - 100を用いてプレートから動物を洗う。滅菌済み1.5 mLチューブに洗って移す。 </li><li>すぐに30秒間2000rpmで動物をスピンダウン。できるだけ多く渉取り外して廃棄チューブの底に動物の質量を邪魔することなく可能な限りernatant。 </li><li>残留トリトンX - 100を削減するために、M9バッファー、スピンを使って動物をすすぎ、そして上清を除去します。一度この手順を繰り返します。 </li><li>溶液中で動物を懸濁するためにチューブとボルテックスで短時間にM9の作業DIIの溶液400μLを加える。 </li><li> 20℃水平に光で保護された環境で350 rpmで3時間チューブを振る。必要に応じて、動物は染色のために16時間までインキュベートすることができる。 </li><li>バインドされていない染料の量を減らすために、20秒間2000rpmで動物をスピンダウン。削除して、動物の質量を乱すことなく、上清をできるだけ捨てる。 </li><li> 400μLM9バッファーで再懸濁し、動物とOP50 E.を接種したNGM寒天プレートの無菌の部分に水などの液体を注ぐ大腸菌 。動物は少なくとも30分を回復することができます。回復時間の間、動物は、DIIの染色液から、食品へはい出るてください。このステップフリーDIIからバックグラウンド蛍光が減少します。 </li></ol> 3。マウントと観察標本<ol><li>オートクレーブやマイクロ波を用いた水の4％の寒天を溶かす。 </li><li>スライドガラス上にラボのテープのレイヤーの2つの部分で、寒天のパッドの均一な厚さを確保するために使用できる再利用可能なスペーサーを、作成します。 twoスペーサ​​ースライドは合計してください。 </li><li> twoスペーサ​​ースライド間のきれいなガラスのスライドを手配する。きれいなスライドガラスの中央上に溶融4％寒天のピペット約150μL（4滴）。すぐに寒天のパッドを形成するために追加のスライドを使用して溶融寒天をカバーしています。慎重に取り付けスライドの上部を中心にパッドを保ち、カバースライドを削除します。 </li><li>パッドの上に - 線虫麻酔薬（1mMのレバミゾール、例えば100μM）の5μL約ピペット。 </li><li>マウント8 - 麻酔薬および顕微鏡のカバーガラスとカバーで12匹。 </li><li>少なくとも40倍objectiを装備した化合物または共焦点顕微鏡を用いて動物を観察 VEとTRITC / DsRedの（または他の互換性のある）フィルタ。 DIIの蛍光励起極大が549 nmであり、その排出量の最大値は、バインドされた色素（Biotium、（株）、ヘイワード、カリフォルニア州）のための565 nmである。 </li></ol> 4。代表的な結果野生型と変異体CのDIIの汚れは、クチクラエレガンス 。クチクラ表面はannulusの複数形、いくつかの段階では、円周畝で区切られて含まれ、長手方向の尾根はalaeと呼ばれる。それぞれの発達段階は、異なる組成2のクチクラ構造を持っています。 alaeとannulusの複数形の両方の尾根や畝は蛍光幼虫と大人の段階を通じて、表面組成に応じて、染色とまでこの方法を使用して回復の翌日から見えます。バックグラウンド蛍光斑点が、時には（図1、図2A - E、H、I）（図2F、G）観察ではなく、日常的にされています。すべての画像は、記載され、回転するディスク共焦点または、、広視野（WF）化合物の顕微鏡で撮影されました。 ENT"&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 DIIは、汚れキューティクルと環境にさらされるニューロンを 。 L2段の動物。 630x倍率。モザイク画像の部品は、iVision - Macのソフトウェア（バイオビジョンテクノロジーズ、エクストン、ペンシルバニア州）を用いて捕獲された。画像は、Adobe Photoshop CS3（アドビシステムズ社、サンノゼ、CA）を使用して結合した。スケールバー=10μmである。 DIIはまた、蛍光染色をそれぞれ頭と尾のamphidとナナフシ類の感覚ニューロン（矢印があるマークを付ける）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 DII蛍光染色C.後胚発生のすべての段階で虫がキューティクル 。 630x倍率。スケールバー=10μmである。 B）L2; C）dauer; D）L3; E）L4;）L1における野生型動物の染色およびF）大人のステージが。 alaeと環状の尾根は、蛍光（A、C）L1とdauer動物で染色される。 L2の動物のDIIの汚れ環状隆起部（B）。環状は、L3とL4の動物（D、E）で染色畝。 alaeの畝とannulusの複数形は、成熟した動物（FH）で染色されています。 Alaeは、動物の長さを実行する2つ、五、三尾根（L1、dauer、または成体動物で、それぞれ）（矢）16で構成されています。 annulusの複数形は、動物の周りの周方向の隆起（矢頭、FとJ）を作成します。成人変異動物のキューティクルは、中程度のクチクラ組織の欠陥（GH）を表示。 G）alaeの尾根は、（WF）不連続です。 H）リナalaeの尾根が融合され、分岐または（WF）二股されています。コラーゲン遺伝子の変異体はalaeと環状の組織の欠陥（IJ）を示す。 I）トランスジェニック動物において過剰発現しpRF4（ROL - 6（su1006））、動物の長さに斜めにalaeの嘘の尾根。トランスジェニック動物を過剰発現pRF4（ROL - 6（su1006））におけるJ）annulusの複数形が不規則なパターンが表示されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。 externをらの形態学的構造は、DIIの染色により照明されています。630x倍率は。スケールバーは=10μmである。 DIIも）成人雌雄同体外陰部、B）成人男性の尾線とファン、およびC）両性テールスパイク（この変異体バックグラウンドでforkされた）を含む他の外部の機能を、強調表示されます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。キューティクルは、環境にさらされるニューロンよりも、DIIで染色するのに時間がかかります。 630x倍率。スケールバー=10μmである。染色の2時間後、amphid（図示せず）とナナフシ類の感覚ニューロン（矢印）十分に染色されています。対照的に、若い動物のキューティクルは、部分的にのみパッチ（矢頭）で染色される。 <table border="1"><tbody><tr><td> 洗う </td><td> 染色液（+ DII） </td><td> インキュベーション時間 </td><td> キューティクルのステンドグラス </td></tr><tr><td> M9 + 0.5％Trのiton X - 100 </td><td> M9 + 0.5％トリトンX - 100 </td><td> 2時間</td><td>ない</td></tr><tr><td> M9 + 0.5％トリトンX - 100 </td><td> M9 + 0.5％トリトンX - 100 </td><td> 3時間</td><td>ない</td></tr><tr><td> M9 + 0.5％トリトンX - 100 </td><td> M9 </td><td> 2時間</td><td>部分</td></tr><tr><td> M9 + 0.5％トリトンX - 100 </td><td> M9 </td><td> 3時間</td><td>はい</td></tr><tr><td> M9 + 0.5％トリトンX - 100 </td><td> H 2 0 </td><td> 2時間</td><td>部分</td></tr><tr><td> M9 + 0.5％トリトンX - 100 </td><td> H 2 0 </td><td> 3時間</td><td>はい</td></tr></tbody></table> 表1。異なる条件下でのクチクラ染色。様々なインキュベーションのソリューションおよび時刻は、動物でクチクラ染色を最適化するためにテストされました。 H 2 0、滅菌蒸留水。大人キューティクル汚れCも部分的な染色では、幼虫のクチクラの斑状の染色（図4）を示していますonsistently。

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</ol>

我々は、開示することは何もない。

ここで紹介するDIIの染色法は、C. elegansのキューティクルを視覚化するため、比較的迅速かつ便利な方法が可能になります。一般的に画像環境にさらされる感覚ニューロン15,17に使用される方法を再利用して最適化することにより、DIIは、蛍光alaeと環状構造（図1および図2）だけでなく、外陰部、男性の尾、および両性テールスパイクの両方を染色するために使用することができます（図3）。我々は、インキュベーション溶液と時間が常にキューティクル（表1、図4）を染色するためにDIIの能力に影響を及ぼすことを見出した。 DIIの染色環境にさらされるニューロンのための方法は、トリトンX - 100 15とM9で2時間のインキュベーション時間を使用しています。界面活性剤とM9の初期洗浄には、トリトンX - 100は、クチクラ表面から汚れを除去する手助けをし、凝集から動物を防ぐことができます。しかし、同じバッファ内の染色液中での動物三時間インキュベートするキューティクル（表1）染色から色素を防ぎます。これは、洗剤の溶液中で長期の治療によって取り除かれている線虫の表面の脂質が原因である可能性...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> シノニム </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DII </td><td> 1,1&#39; - ジオクタデシル- 3、3,3&#39;、3&#39; - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩</td><td> Biotium、（株） </td><td> 60010 </td><td>株式の希釈： DMF中20 mg / mLの 希釈率：30 mg / mLの</td></tr><tr><td> DMF </td><td>ジメチルホルムアミド</td><td> Sigma - Aldrich社、（株） </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td>トリトン X - 100 </td><td>オクチルフェノキシポリエトキシエタノール</td><td> VWRインターナショナル、LLC。 </td><td> EM - 9410 </td><td></td></tr><tr><td> M9 </td><td> 22mmのKH 2 PO 4、42mmののNa 2 HPO 4、86mMのNaCl、1mMのMgSO 4を </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NGM &lt;/ TD&gt; <td>線虫の増殖培地</td><td> IPMサイエンティフィック株式会社</td><td> 11006-501 </td><td> NGM寒天プロトコル18に従って調製することができる</td></tr><tr><td>寒天</td><td></td><td> EMDケミカルズ（株） </td><td> 1.01614 </td><td>水、4％ </td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>塩酸レバミゾール</td><td> Sigma - Aldrich社、（株） </td><td> 31742 </td><td> 100μM - 必要に応じて、1 mMのレバミゾール</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td></td><td> VWRインターナショナル、LLC。 </td><td> 16005-106 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス</td><td></td><td> VWRインターナショナル、LLC。 </td><td> 16004-302 </td><td></td></tr><tr><td>化合物の範囲</td><td></td><td>カールツァイス株式会社</td><td> A1m </td><td>実験のニーズに合わせて目標を使用</td></tr><tr><td> TRITCまたは他の互換性のあるフィルタ</td><td> ＆ニッポン放送p; </td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> 49005 </td><td> ET - DsRedタンパク質は、（TRITC/Cy3）フィルタセットをスパッタ</td></tr></tbody></table>

の可視化線虫（caenorhabditis elegans）</em親油性生体染色色素、diiを使用する>キューティクルの構造

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

C.のクチクラelegansは動物1-4の外側を取り囲む非常に強い構造です。キューティクルだけではなく環境から動物を保護するだけでなく、ボディの形状を決定し、運動性4-6に役割を果たしている。表皮細胞から分泌されるいくつかの層は最も外側の脂質層7を含む、キューティクルを構成しています。 キューティクルの円周尾根はannulusの複数形のパターン動物の長さと呼ばれ、開発8のすべての段階で存在している。 AlaeはL1、dauer、そして大人のステージ2,9を含む開発の特定の段階で、中に存在する縦方向の尾根です。クチクラコラーゲンの組織に影響を及ぼす遺伝子の変異は、クチクラ構造と動物の体の形態5,6,10,11を変更することができます。 DIC光学系と化合物の顕微鏡を使用してクチクラのイメージングが可能ですが、クチクラ構造を強調する現在の方法は、蛍光を含むセントジーン発現12、抗体染色13、および電子顕微鏡1。ラベルの付いた小麦胚芽レクチン（WGA）もクチクラ糖タンパク質を可視化するために使用されていますが、細かいクチクラ構造14を解決するために制限されています。蛍光色素を使用してクチクラ表面の染色が観察されたが、詳細に15に特徴がないされています。我々は、ライブCでキューティクルを可視化する手法を提案一般的にC言語で使用されている赤色蛍光親油性色素DII（1,1&#39; -ジオクタデシル- 3、3,3&#39;、3&#39; - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩）を、使用して虫elegansの環境にさらされるニューロンを可視化する。 DIIの染色のためのこの最適化されたプロトコルは、annulusの複数形、alae、外陰部、男性の尾、およびCの雌雄同体尾のスパイクの高分解能蛍光可視化するための、シンプルで堅牢な方法です。 エレガンス 。

我々は、ライブでキューティクルを可視化する手法を提案<em&gt; C.エレガンス</em&gt;一般的に使用される赤色蛍光親油性色素DII（1,1&#39; - ジオクタデシル- 3、3,3&#39;、3&#39; - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩）を使用して、<em&gt; C.エレガンス</em&gt;環境的に露出した神経細胞を可視化する。この最適化されたプロトコルで、alaeと環状のクチクラ構造は、DIIによって染色し、化合物の顕微鏡を用いて観察される。

の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）</em親油性生体染色色素、DIIを使用する>キューティクルの構造

C. elegansのクチクラは、動物の外周を囲む非常に耐性の高い構造である1-4。クチクラは、動物を...から保護するだけでなく、

本手順の全体的な目的は、赤色蛍光親油性染料であるdye eyeを用いて、透明な生きたC. elegansのクチクラを可視化することです。まず、染色のための線虫集団を調製します。次に、希釈したdye eyeをこの集団に加え、インキュベートします。その後、動物を染色液から回収します。Daiで染色したクチクラの蛍光イメージングでは、AileyおよびAnn eyeの生殖構造やその他の外部形態学的特徴を含む表面の詳細が示されます。直接イメージング、蛍光、トランスジェーン発現、抗体染色、電子顕微鏡、および標識小麦胚芽凝集素などの、この透明な生物のクチクラを可視化するための既存の手法に対する本手法の主な利点は、比較的迅速かつ安価に簡単に実施でき、生体動物におけるクチクラ構造の高い解像度を得られることです。この手法は、細胞分泌やクチクラの構成、表皮細胞の発達、ヘテロクロニック遺伝子経路、自然免疫、形態的形質の形成、および線虫の進化など、C. elegansモデルシステムとそのクチクラを利用する多くの分野における重要な疑問の解決に役立ちます。手順の実演は、私の研究室の大学院生であるRobbie Schultzが行います。DiIを取り扱う際は、光感受性であることに注意してください。D eyeは常にホイルで包み、遮光してください。また、DMFは毒性があり、DAIは発がん性物質であるため、手袋と白衣を着用してください。シアン化Daiは非常に強力です。標準強度の作動希釈液は、M9緩衝液に30 µg/mLのDIIを溶解させたものであり、単一の個体群につき400 µLの作動希釈液のみが必要です。まず、汚染のない線虫が飼育されている60 mmプレートを用意します。プレートから動物を回収し、1.5 mLの0.5% Triton X 100で洗浄します。M9バッファー中で、液体を円を描くようにゆっくりと揺らして、すべての幼虫および成虫を剥離させ、洗浄液を1.5 mLチューブに移します。直ちに2000 rpmで30秒間遠心分離し、チューブの底に個体を回収します。個体を乱さないように、上清を可能な限り除去します。欲張らずに慎重に行ってください。動物を1 mLのM nineで洗浄します。遠心分離し、上清を除去します。洗浄を繰り返します。再度遠心分離し、上清を除去します。次に、M9培地で調製した30 µg/mLのDai 400 µLをチューブに加えます。チューブを短時間ボルテックスし、動物を再懸濁させます。次に、遮光条件下でチューブを水平に置き、20 °C、350 RPMで3時間から16時間振盪します。これら直前のステップのタイミングは重要です。まず、daiが結合する脂質が除去されないよう、Triton Xを洗い流す必要があります。次に、キューティクルが均一に染色されるまで、動物をdye eye溶液で十分に染色します。その後、結合していないeyeを除去するため、動物を餌の上で十分に回復させます。染色の終了後、動物を遠心分離して沈殿させ、染料溶液を除去します。1 mLのM9バッファーで動物を洗浄します。結合していない染料を除去するため、動物を遠心分離して上清を除去します。動物を400 µLのM9バッファーで再懸濁し、OP50 E. coliを播種したNGMマイクロプレートの細菌がいない部分に注ぎます。暗所で少なくとも30分間、ただし最長でも1日で動物を回復させます。回復時間中に染料の蛍光が減衰するためです。動物は染料の染色液から離れ、餌の方へ移動します。これらの動物は、遊離染料による眼の背景蛍光が少ないため、イメージングがより容易です。まず、スライド上にアガロースパッドを準備します。使用するアガロースパッドの厚さを均一にするために、2つのスペーサーを使用してください。2枚のラボテープをガラススライドに重ねてスペーサーを作成します。スペーサーは繰り返し使用することが可能です。次に、2枚のスペーサー付きスライドの間にきれいなガラススライドを縦方向に配置し、溶融した4%アガロースを約150 µLピペットで分注します。清潔なガラススライドの中央に滴下します。溶融したAERの上に、別のスライドを垂直に配置して素早く覆い、2つのスペーサーとともにアガーパッドを形成します。カバースライドを慎重に滑らせて外し、パッドがマウンティングスライドの上部の中央に位置するように保持します。次に、線虫麻酔剤5 µLをパッド上にピペッティングし、8〜12匹の個体を麻酔剤の中に載せ、マイクロスコープカバーガラスで静かに覆います。40倍以上の対物レンズとTRITCフィルターまたはその他の互換フィルターを備えた、複合顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて個体を観察します。Dye Iの蛍光励起極大は549 nm、蛍光放出極大は565 nmです。結合ダイのイメージングは、本プロトコルにおいて最も困難な工程です。ここでは動物のイメージング用マウント方法を示しますが、使用する共焦点顕微鏡や複合顕微鏡については、適切にトレーニングを受けておく必要があります。染色法によって照らされた詳細な構造を分解するには、少なくとも60倍以上の倍率を持つ対物レンズを使用するのが最適であることがわかりました。このセクションの画像はすべて、胚後期のC. elegansを63x対物レンズを用いて撮影したものです。クチクラ表面は、環状の溝によって年次的に区切られており、一部のステージではアイルと呼ばれる縦方向の隆起が見られます。このセクションの画像はすべて、胚後期のC. elegansを63x対物レンズを用いて撮影したものです。キューティクルの表面には、周方向の溝によって分けられた環状の領域と、一部のステージではaleyと呼ばれる縦方向の隆起が存在します。各発生段階のキューティクル構造は、表面組成に応じて、aleyおよびAlyの隆起や溝がそれぞれ異なる組成とパターンを持っており、蛍光染色することが可能です。この染色定置法を用いれば、幼虫および成虫のすべての段階において、回収後最大1日間は可視状態が維持されます。背景に蛍光の斑点が観察されることがありますが、日常的に起こることはありません。これは、中程度のクチクラ組織欠損を示す成虫変異体のクチクラです。Ailey ridge（アイリーリッジ）は不連続で過剰に存在します。Ailey ridgeは融合し、分枝または二分しており、一般的なトランスジェニックマーカーとなります。dominant roll six対立遺伝子はクチクラのねじれを引き起こし、これがaileyに観察され、環状構造（annuli）を不規則なパターンにさせることがあります。Daiは、成体雌雄同体、陰門、および成体雄の尾部挙上部やファンを含む、その他の外部クチクラ構造も染色します。また、このように二股に分かれた尾のような、外部形態のわずかな欠陥を強調することも可能です。例えば、2時間の染色ではクチクラの染色にムラが生じますが、環境に露出しているニューロンは染色される場合があります。適切に実施すれば、この手法は習得後、イメージング時間を除いて4時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、クチクラやその他の外部形態構造を観察するために、Daiを用いてC. elegansを染色する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）キューティクルの構造

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