の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）キューティクルの構造
January 30th, 2012
我々は、ライブでキューティクルを可視化する手法を提案 C.エレガンス一般的に使用される赤色蛍光親油性色素DII（1,1' - ジオクタデシル- 3、3,3'、3' - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩）を使用して、 C.エレガンス環境的に露出した神経細胞を可視化する。この最適化されたプロトコルで、alaeと環状のクチクラ構造は、DIIによって染色し、化合物の顕微鏡を用いて観察される。
この手順の全体的な目標は、赤色蛍光親油性染料染料の目を使用して、透明な生きた海の優雅さでキューティクルを視覚化することです。これは、染色用の線虫の集団を準備することによって達成されます。次に、希釈した色素眼を集団に加え、インキュベートします。
その後、動物を染色液から回収します。Dai染色されたキューティクルの蛍光イメージングは、エイリーとアンの目の生殖構造やその他の外部形態学的特徴を含む表面の詳細を示します。この透明な生物のキューティクルを視覚化するための既存の方法(直接イメージング、蛍光、導入遺伝子発現、抗体染色、電子顕微鏡法、標識コムギ胚芽凝集素など)に対するこの技術の主な利点は、この技術が比較的迅速かつ安価に実施しやすく、生きた動物のクチクラ構造の美しい解像度が得られることです。
この方法は、細胞分泌とキューティクル組織化、表皮細胞の発生、ヘテロ慢性遺伝子経路、自然免疫、形態学的形質の発達、線虫の進化など、シーエレガンスモデルシステムとそのキューティクルを使用する多くの分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるRobbie Schultzです。D Eyeを使用するときは、光に敏感であることに注意してください。
Dの目を常にホイルで包んで光から保護してください。また、DMFは有毒であり、DAIは車であるため、手袋と白衣を着用してください。シアン化物Daiは非常に強力です。
標準的な強度の作業希釈は、M nineのDIIのミリリットルあたり30マイクログラムであり、単一の集団は400マイクロリットルの作業希釈のみを必要とします。汚染されていない線虫が充填された60ミリメートルプレートから始めます。0.5%Triton X 100の1.5ミリリットルでプレートから動物を洗います。
M nineバッファーでは、液体を円を描くように静かに渦巻き、すべての幼虫と成体動物をほぐし、洗浄液を1.5ミリリットルのチューブに移します。すぐにRRP M2000で動物を30秒間スピンダウンして、チューブの底に動物を集めます。動物を邪魔しないように、できるだけ多くの上澄みを捨ててください。
欲張らず、注意してください。1ミリリットルのMナインで動物を洗います。スピンダウンして上清を取り除きます。
洗濯を繰り返します。再度スピンダウンして、上清を取り除きます。次に、MナインのDaiのミリリットルあたり30マイクログラムの400マイクロリットルでチューブに
。チューブを短時間渦巻きにして、動物を再懸濁します。次に、チューブを水平位置で摂氏20度で3〜16時間、350 RP Mで軽く保護された環境で振とうします。この数ステップのタイミングが重要です。
まず、Triton Xは、Daiが結合する脂質を取り除く前に洗い流す必要があります。第二に、動物は、キューティクルが均一に染色されるのに十分な時間、染料眼液で染色されなければならない。少し後に、動物は縛られていない目を取り除くのに十分な時間食物で回復することを許されるべきです。
染色の最後に、動物をスピンダウンし、染料溶液を取り除きます。1ミリリットルのMナインで動物を洗います。未結合の染料を除去するには、動物をスピンダウンして上清を取り除きます。
動物を400マイクロリットルのM nineバッファーに懸濁し、NGMマイクロプレートのバクテリアフリー部分に注ぎます。OP 50 Eコリを播種すると、動物は少なくとも30分間暗闇で回復することができますが、回復時間中に色素の蛍光が衰えるため、1日以上は回復できません。動物は染料染色液から離れて食物の上に這い上がるべきです。
これらの動物は、遊離色素の目からの背景蛍光が少ないため、画像化が容易です。スライド上にアグリパッドを準備することから始めます 使用するアグリパッドの厚さが均一になるようにします。スペーサー2個。
スペーサーは、スライドガラスに2枚のラボテープを重ねて作られます。スペーサーは無期限に使用できます。次に、2つのスペーサースライドの間に縦にきれいなガラススライドを配置し、溶融した4つの寒天の約150マイクロリットルをピペットで挟みます。
きれいなスライドガラスの中央に。溶かしたAERを、AERと両方のスペーサーの上に垂直に配置された追加のスライドですばやく覆い、寒天パッドを形成します。パッドを取り付けスライドの上部の中央に保持しながら、カバースライドから慎重にスライドさせて外します。
次に、5マイクロリットルの線虫麻酔薬をパッドにピペットで固定し、8〜12匹の動物を麻酔薬に取り付け、顕微鏡カバースリップで優しく覆います。少なくとも40倍対物レンズとトリッシーフィルターまたはその他の互換性のあるフィルターを取り付けた化合物顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して動物を観察します。色素眼の蛍光励起最大は549ナノメートル、発光最大は565ナノメートルです。
結合ダイの場合、イメージングはこのプロトコルの最も困難な部分です。イメージングのために動物をマウントする方法を示しますが、使用するコンパウンドスコープまたは共焦点スコープについて適切なトレーニングを受ける必要があります。染色法で照らされた詳細を解像するには、倍率60倍以上の対物レンズを使用するのが最善であることがわかりました。
このセクションの各画像は、ポスター胚性シールのエレガンスで63倍対物レンズを使用して撮影されました。キューティクルの表面には、円周方向の溝で区切られた年々含まれており、一部の段階ではエイリーと呼ばれる縦方向の隆起があります。このセクションの各画像は、胚後Cのエレガンスで63倍の対物レンズで撮影されました。
キューティクルの表面には、円周方向の溝で区切られた年数化され、一部の段階ではアリーと呼ばれる縦方向の隆起が含まれています。各発達段階には、異なる組成とパターンを持つキューティクル構造、アリーとアリーの両方の蛍光染色の隆起または溝があります。表面組成によって異なります。
この染料スタンディング法を使用したすべての幼虫および成虫の段階を通じて、回復後最大1日間は見えるままです。背景の蛍光斑点は時々観察されますが、日常的には観察されません。これは、中程度のキューティクル組織欠損を示す成体変異動物のキューティクルです。
エイリーリッジは不連続で過剰です。エイリーリッジは融合し、分岐または分岐し、一般的なトランスジェニックマーカーです。ドミナントロール6対立遺伝子はキューティクルのねじれを引き起こし、これはエイリーに見られ、環状が不規則にパターン化される可能性があります。
Daiはまた、成体の雌雄同体、外陰部、成体の雄の尾の隆起、ファンDaiなどの他の外部のキューティクル構造を染色し、この二股の尾のような外部形態の微妙な欠陥を強調することもできます、不十分な染色。例えば、2時間の染色は斑状のクチクラ染色につながりますが、環境にさらされたニューロンは染色する可能性がありますが、習得すると、この技術は4時間で行うことができますが、適切に実行されていればイメージングは含まれません。このビデオを見た後、キューティクルやその他の外部形態学的構造を観察するために、ダイアイで海の優雅さを染色する方法をよく理解しているはずです。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この記事では、赤色蛍光性親油性染料DiIを使用して、生きたC. elegansのキューティクルを可視化する方法を紹介します。最適化されたプロトコルにより、複合顕微鏡を用いて翼状構造と環状の角質層構造を観察することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 画像技術
背景
- 透明な生物でのキューティクルの可視化は、形態学の研究に不可欠です。
- 既存の方法には直接画像化と抗体染色が含まれます。
- DiIはC. elegansのニューロンの可視化に一般的に使用されています。
- この研究は、角質層構造の可視化を改善することを目指しています。
研究の目的
- 生きたC. elegansのキューティクルを染色する簡単で効果的な方法を開発する。
- 角質層構造の画像の解像度を向上させる。
- 既存の可視化技術に対するコスト効果の高い代替案を提供する。
使用された方法
- C. elegansの集団を染色用に準備する。
- 希釈したDiI染料で線虫をインキュベートする。
- 染色溶液から動物を回収する。
- 蛍光イメージングを使用して染色された角質層の詳細を観察する。
主要な結果
- DiI染色は翼状構造と環状構造を効果的に強調します。
- 蛍光イメージングは詳細な表面形態を明らかにします。
- この方法は迅速で、実行が容易で、費用対効果が高いです。
- 結果は生きた動物での角質層構造の高解像度を示しています。
結論
- この技術は従来の方法に比べて大きな利点を提供します。
- 生きたC. elegansの角質層特徴の詳細な可視化を可能にします。
- この方法は様々な研究応用に広く採用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Visualizing cuticular structures in live C. elegans enables mechanistic de-risking of epidermal development and cuticle organization pathways. This method supports target validation by providing quantitative phenotypic readouts for genetic and pharmacological perturbations. The approach offers predictive confidence in early discovery by linking cuticle morphology to motility, innate immunity, and nematode evolution models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cuticle collagen organization and epidermal cell development.
- Operational Value: Provides a robust, reproducible assay for functional target validation in nematode-based disease models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking cuticle defects to morphological traits and hetero-chronic gene pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers high-resolution fluorescent readouts of annuli, alae, vulva, and tail structures for compound screening.
- Operational Value: Offers a quick, inexpensive, and scalable staining protocol compatible with live-animal imaging workflows.
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable morphological outputs for downstream hit validation and lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects cuticle visualization to preclinical models of innate immunity and developmental disorders.
- Mechanistic De-risking: Enables observation of cuticle defects in mutants, supporting biomarker alignment for epidermal integrity.
- Disease-Relevant System: Applicable to studies of nematode evolution and morphological trait development relevant to parasiticide screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to phenotypic screening and preclinical validation, enabling iterative refinement of cuticle-modulating compounds.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification of cuticle organization and epidermal secretion through direct visualization of structural perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible staining with quantitative imaging outputs for compound effect assessment.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts of cuticle integrity, enabling statistical comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Bridges discovery to preclinical continuity by visualizing cuticle structures linked to motility and immunity phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal studies of cuticle dynamics across developmental stages and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in cuticle-related pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability across laboratories using a simple, cost-effective protocol.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of cuticle-mediated toxicity or efficacy signals.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on cuticle phenotype severity and reversibility.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and live-animal handling.
- Needs access to compound or confocal microscopes with appropriate filter sets (excitation 549 nm, emission 565 nm).
- Demands cross-team standardization of staining duration, washing steps, and recovery conditions to minimize variability.
- Involves adaptation considerations for different C. elegans strains and developmental stages due to varying cuticle composition.
- Includes practical limitations such as dye photobleaching during recovery and potential background fluorescence from unbound dye.
