DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化

この手順の全体的な目的は、単一分子レベルでDNA複製を可視化することです。まず、新たに合成されたDNAにハロゲン化ヌクレオチドアナログを組み込みます。生細胞において、標識されたDNAを含む細胞を顕微鏡上にスポットします。

次に、細胞をスライドガラス上に配置し、DNAを伸展させます。続いて、DNAファイバーの免疫染色を行い、蛍光顕微鏡画像を解析することで、全般的な複製フォークのダイナミクスを明らかにし、全体の複製プログラムに影響を与えるパラメータの定量的な解析が可能になります。ここ数年で、生細胞内における個々の複製フォークの動きを可視化するために、DNAファイバー法（DNA fiber Fluor techniques）のさまざまな改良版が開発されてきました。

これからご覧いただくDT 40細胞を用いたこのin vivo実験は、1日で完了することができ、一般的な実験器具と蛍光顕微鏡のみで実施可能です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるRebecca Schwab博士が行います。DT 40細胞をin vivoで標識するには、対数増殖期の培養細胞から開始します。最終濃度が25 micromolarになるようにIDU標識剤を加え、細胞懸濁液を混ぜ合わせます。

細胞を38 °C、5% CO2条件下で20分間インキュベートします。次に、CLDUラベルを最終濃度250 µMになるように添加します。細胞懸濁液を混ぜ合わせ、インキュベートします。

次に、DT 40細胞を氷冷したPBSで洗浄します。細胞ペレットを冷PBSに懸濁し、標識した細胞を氷上に保持します。細胞懸濁液2 µLをガラススライドの一端に滴下し、液滴の容量が大幅に減少するまで（完全に乾燥しない程度まで）自然乾燥させます。

次に、細胞懸濁液の上にfiber lysis solutionを7 µL加え、ピペットチップで混ぜてゆっくりと撹拌し、2分間インキュベートします。続いて、スライドを15度に傾けて、繊維がスライドに沿って広がるようにします。繊維溶液がスライドの底部に達したら、スライドを水平に置いて風乾させます。

この時点で、スライドに沿って薄く不透明な線が見えるはずです。伸展した繊維の開始点を鉛筆でマークします。まず、スライドをメタノールと酢酸を3:1の割合で混合した液に10分間浸します。

スライドを蒸留水で洗浄し、次に 2.5 molar 塩酸に80分間浸漬させます。PBSで5分間の洗浄を3回行い、軽く叩くようにして水気を切ります。余分なPBSはペーパータオルで吸収させて回収してください。

次に、スライドを水平に配置します。各スライドの上にPBSで調製した5%BSAをピペットで滴下し、カバーガラスを被せて20分間インキュベートします。その後、カバーガラスをガラススライドに沿ってゆっくりとずらして移動させます。

ペーパータオルで余分なBSAを取り除きます。次に、anti BRDU一次抗体溶液 50 µLを各スライドにピペッティングします。

カバーガラスで封止し、加湿チャンバー内で2時間インキュベートします。カバーガラスを取り除いた後、PBSで5分間ずつ3回スライドを洗浄します。二次抗体溶液を50 µL添加してカバーガラスを被せ、スライドを遮光して保護します。

その後、1時間インキュベートします。カバーガラスを取り外し、スライドをPBSで5分間、3回洗浄します。最後に、各スライドにVector Shield封入剤を1滴滴下します。

カバーガラスを軽く押し、周囲の余分な液体を除去します。ペーパータオルの後、透明なマニキュアでカバーガラスを封印し、風乾させます。スライドは−20 °Cで保存してください。

スライド上の鉛筆の印の近くに浸漬オイルを1滴滴下し、繊維の探索を開始します。メインの束から離れ、繊維同士が明確に分離している領域を探します。一般的な実験では、バイアスを避けるために、単一のカラーチャンネルのみを使用して画像を選択してください。

次に、各サンプルにつき約10枚の写真を撮影します。スライド上の1つの領域だけでは、代表的な繊維長や複製構造が得られない可能性があるため、スライド上を移動して異なる箇所の写真を撮影してください。撮影した写真を画像解析プログラムに取り込みます。

100本の線維束の長さを測定するか、あるいは150〜200個の異なる複製構造をカウントします。二重標識線維法を用いることで、異なる複製構造を区別することが可能です。新しく複製されたDNAは、抗体標識されたヌクレオチドアナログの線として可視化されます。

ここでは、伸長中のフォークを隣接する赤色と緑色のシグナルとして示しています。新規の開始イベントは、最初のラベルでインキュベーションしている間に発火した複製起点と、2番目のラベルでインキュベーションしている間に発火した複製起点に分けることができます。前者は隣接する緑色、赤色、緑色のシグナルで構成され、後者は緑色のラインのみで構成されます。

終結イベントは、隣接する赤色と緑色として現れます。赤色のシグナルが点在しています。起点領域は、連続する起点シグナルと終結シグナルで構成されています。

実験デザインによって、ストールまたは崩壊したフォークは、赤色のみのシグナル、あるいは赤色の線に続いて短い緑色の領域がある状態として定義されます。本実験では、野生型DT 40細胞の平均フォーク速度は0.4 microns per minuteです。内訳は、進行中のフォークが63%、複製起点（オリジン）が10%、ストールしたフォークが16%、終結部位が8%、そして分散したファイバーが3%となっています。

このビデオを視聴することで、DT 40細胞における複製フォークダイナミクスの可視化および解析方法について十分に理解することができます。これにより、DNA複製の欠陥を調査するための不可欠なツールを習得できます。