1次元および2次元^1HNMRを用いたペプチド-金属錯体の構造と配位決定

この手順の総合的な目的は、銅と複合体を形成したメタロシャペロンタンパク質模倣ペプチドの構造を決定することです。これは、まず酸素のない環境でサンプルを調製することで達成されます。第二のステップは、水素原子間の相互作用を示す核磁気共鳴（NMR）分光法データを取得することです。

次に、空間的な相互作用を線状のペプチドテンプレートにマッピングします。最後のステップは、データに適合する代表的な低エネルギー構造を特定することです。最終的に、NMRから得られた構造を用いて、結合様式の決定および銅結合複合体の構造解析を行います。

X線結晶構造解析などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、弱く結合した複合体や、結晶化しない分子および複合体の観察に利用できることです。本手法は銅結合タンパク質の知見を得るために有用であるだけでなく、他の金属シャペロンなどの系にも適用でき、細胞内環境においてタンパク質がどのようにして不可欠でありながら潜在的に毒性を持つ金属イオンを安全に輸送するかを研究することが可能です。

まず、銅の酸化を防ぐため、酸素のない環境で試料を調製します。APO試料を調製するには、約1〜2 mgのペプチドを450〜500 µLの重水素化NMRグレード溶媒に溶解します。銅反応試料については、APOペプチドと同量のペプチドを、等モル量の金属塩とともに450〜500 µLのNMR溶媒に溶解します。各溶液を、センターグラスろ紙または、調査対象の化合物に適しており、かつ化合物が吸着されないその他の手法を用いてろ過します。これは、均一性に影響を及ぼす金属粒子を除去するために不可欠です。

溶液をNMRチューブに移し、チューブ内でサンプルを密閉します。グローブボックスから出る前に、サンプルを外に出して封印します。NMR装置を用いて、APOおよび銅反応サンプルの1次元プロトンスペクトルを測定し、比較します。

APOペプチドは柔軟であり、平均的なコンフォメーションを示しますが、銅と反応すると、結合したペプチドアミドはより剛直な構造になります。したがって、銅含有ペプチドのスペクトルでは、アミド領域の化学シフトに顕著な変化が見られ、ピークが分離される可能性があります。テキストプロトコルに記載されている同一条件下で、最適化されたCOSY、TOCSY、NOESYまたはROSY NMR実験をセットアップし、順次実行してください。

データ収集の間、各実験の合間に一次元実験を行い、サンプル組成がデータ収集全体を通じて一定に保たれていることを確認してください。テキストプロトコルで説明した方法でデータを処理した後、NOEスペクトルとROSYスペクトルに重ね合わせるためのCOSYおよびTOCSYスペクトルのセットを準備します。これにより、スペクトル内のすべてのNOEピークを割り当てます。

まず、フィンガープリント領域で毒性信号と重複しているピークの割り当てから開始します。これにより、Sparkyプログラムを用いたその後のピーク割り当て入力が容易になります。割り当てられたピークをHα-アミドプロテインカップリング値から二面角へと変換して記録してください。また、プログラム内でピークを積分し、既知の距離を持つ相互作用を用いて変換することで、ピークを距離拘束へと変換してください。

ピークが重複している場合や自動積分法が使用できない場合は、目視による推定でピークを強、中、弱、または極めて弱としてラベル付けし、これらの指定をそれぞれ最大 2.5、3.5、4.5、および 5.5 angstroms の距離に変換することができます。explore 用の正しい形式で距離拘束と二面角をインポートします。Explore はコンフォメーション空間を探索し、標準的な化学幾何学に準拠した構造を特定します。

これらのパラメータのいずれも違反しないアンサンブルを生成するために、実験的に得られた距離拘束を追加します。これが初期アンサンブルとなります。バイアスなくどの残基が金属結合に関与しているかを特定するため、金属に対する拘束を一切使用せずに最初の構造決定ランを実行します。

テキストのプロトコルに記載されている通り、構造を共役勾配法によるエネルギー極小化で4,000回反復して最小化する前に、割り当ての誤り、NOEエネルギー、およびシミュレートされたニーリングパラメータを特定しやすくするため、拘束条件を徐々に導入します。通常50メンバーで構成される最終的なアンサンブルを作成し、アンサンブル全体に対して反復的に拘束条件を導入して、検出された各タイプのNOE相互作用の数を報告します。最後に、標準的な化学幾何構造および経験的なNMR由来の拘束条件に準拠した構造アンサンブルを作成します。全コンフォメーション数、そのうちNMR由来の拘束条件に違反がある数、および主鎖と全重原子の両方のRMSD値を含むアンサンブル全体のRMSDを報告してください。

低エネルギーアンサンブルを解析し、金属イオンに結合するために、どの残基の側鎖が互いに適切な近接位置にあるかを決定します。これらが決定したら、銅結合データを含めて解析を繰り返します。NMRから得られた距離拘束に加えて、決定した残基に金属結合拘束を追加します。

金属イオンおよびそのトポロジーを記述するための適切なパラメータを追加します。質量、他原子との結合距離、角度、および非結合反発パラメータなどの適切な物理情報をパラメータファイルに入力します。結合情報をトポロジーファイルに追加します。

この情報には、結合の結果としてどの結合が形成または切断され、どの形式電荷が変化したかが含まれます。最後に、解決されたアンサンブルがペプチドの採用するコンフォメーション空間を表すため、前述と同様に構造のアンサンブルを取得します。NMR測定中、構造のすべてのコンフォメーションをMal Mallプログラムにインポートし、開始アンサンブルを作成します。

アンサンブルを検討し、分子の局所的な安定性を決定します。配列に沿って4残基ずつの領域を順次選択し、プログラムを用いて最低エネルギー構造または平均構造に対するRMSD値を算出することで、バックボーンおよび側鎖のRMSD値を決定します。局所的なRMSDを配列の関数としてプロットし、分子のどの領域が局所的な安定性を示すかを判断し、分子のこの領域に沿ってアンサンブルを重ね合わせ、このアンサンブルをさらなる解析に使用します。NMR由来の拘束条件に準拠する低エネルギーコンフォメーションを選択してください。

これらは低エネルギーアンサンブル記録を構成し、アンサンブル内のコンフォメーション数、それらの選択基準、およびRMSD値を報告します。金属結合モードがまだ決定していない場合は、低エネルギーアンサンブルを解析し、どの残基の側鎖が不適切であるかを判断してください。金属イオンを結合させることができる互いの近接性を確認します。

KYMERAを使用して、金属結合が疑われる原子間の分子内距離を決定します。これらの距離が決定した後、アンサンブルにおける平均距離を算出してください。銅結合データを含めて、同様の解析を繰り返します。

アンサンブルを解析し、MAL mallプログラムのデフォルト検索パラメータを用いて、分子内の局所的な二次構造を決定します。次に、そのアンサンブルをkymeraにインポートします。二次構造は水素結合によって保持されており、分子の安定した領域を示します。

kymeraツールを用いて水素結合を決定します。テキストプロトコルに詳述されている通りに構造解析を継続してください。その後、すべての構造的知見をまとめ、それらがどのように相互に補強し合っているかを明らかにします。銅結合タンパク質モデルを研究するため、得られた線状ペプチド内のタンパク質の保存された結合配列の構造を溶液状態NMRにより決定し、ペプチドの6.7から8.5のアミド領域を解析しました。

PP Mは銅と反応して6.6から9.0 PP Mへと拡大しました。ベースラインには、わずかな銅の酸化によるラインブロードニングが認められます。ここでは、銅結合ペプチドのRoy Toxiおよびcozyスペクトルのフィンガープリント領域のオーバーレイを示しています。サンプルは経時的に安定しており、スペクトルは十分に分解され、rosy実験によって得られた81個のNOE相互作用が確認されました。

NO C実験において、この分子はNOE相互作用がほぼゼロであったため、反応後サンプルから導出したペプチルのアンサンブルを、金属に対する拘束条件を設けずに算出したところ、50構造中47構造において、主鎖および重原子のRMSD値がそれぞれ1.44および2.07 angstromsであった。これらのうち、主鎖および重原子のRMSD値がそれぞれ0.25および0.61 angstromsである13個の低エネルギーコンフォーマーを、さらなる解析のために選択した。局所RMSDプロットでは、3番目から7番目の残基間に安定領域が示された。プロリン残基を含む剛直なC末端領域に加え、この領域はすべてのコンフォーマーにおいて、4番目から7番目の残基間で屈曲した構造をとっていることがわかった。

この屈曲構造は、主鎖のドナーとアクセプターであるグリシン5および3、アラニン2、ならびにシステイン6とシステイン3の間の水素結合によって安定化されています。この屈曲は、システイン3およびセリン7付近の結合定数（カップリング定数）の減少からも明らかです。これらの構造をこの領域で重ね合わせ、システイン3、システイン6、およびメチオニン1を潜在的な結合残基として想定し、結合に関与し得る残基について解析を行いました。

最も短い硫黄原子間の距離はシステイン3とシステイン6のフォレート基間で、銅結合を導入して計算を繰り返し、解析に使用するアンサンブルを得ました。銅結合ペプチドの低エネルギーアンサンブルでは、末端アミンが結合した銅に近接していることが示されています。ここでは静電ポテンシャル分布の等値面を示しており、正のポテンシャルを青色で、負のポテンシャルを赤色で表示しています。

アルギニン残基はペプチドの主鎖から伸びて正の静電ポテンシャルのローブを形成し、一方で主鎖の炭素は直線状に配列して、それほど顕著ではない負の静電ポテンシャルを形成します。この手法を習得すれば、約1週間のNMR測定時間と、その後の数日間の後処理で構造決定が可能となり、構造解析に使用できるコンフォメーションのアンサンブルを得ることができます。この手順に従い、他のペプチド変異体や異なる条件下での解析を行うことで、銅イオンの結合および放出の程度に必要とされる条件に関するさらなる疑問を明らかにできます。