固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

このプロトコルの全体的な目標は、不溶性および非結晶性の超分子タンパク質集合体の構造を、マジックアングルスピニング固体NMR分光法により原子分解能で研究することです。本講義では、固体NMRによる生体分子タンパク質集合体の原子構造研究に不可欠な方法論的ステップを提示する。これらの集合体の原子構造を研究することは、本質的に不溶性で非結晶性であるため、非常に困難です。

固体NMRは、組み立てられた物体のサイズやその溶解度に制限されることなく、原子分解能で分子構造とダイナミクスを研究できる新しい技術です。ここでは、同位体標識サンプルの調製、固体NMRからの構造データの収集と分析など、販売状態NMRによって生体分子タンパク質集合体の原子構造を視覚化するための主要なステップを示します。固体NMRワークフローの最初のステップは、C13、N15標識タンパク質サブユニット、およびそれらのin vitroアセンブリの作製です。

15ミルのプレカルチャーに温めたLB培地に、形質転換大腸菌細胞のコロニー1つを接種します。摂氏37度でインキュベートし、200 RPMを一晩振とうします。メインカルチャーに接種するには、プレカルチャー全体を、必要な同位体標識された炭素と窒素の供給源を含む1リットルの予熱したN9培地に移します。

これらには、N15標識塩化アンモニウム、均一にC13標識グルコース、選択的にC13標識グルコース、または選択的にC13標識グリセロールを37度でインキュベートし、培養物が濁るとすぐに600ナノメートルで光学密度を測定することが含まれる。ODが0.8の値に達したら、0.75ミニモルIPTGでタンパク質発現を4時間誘導します。最適な誘導条件は、タンパク質ごとに異なることに注意してください。

6, 000 Gおよび4度で30分間遠心分離することにより、細胞を回収します。タンパク質サブユニットの精製後、それらはin vitroで組み立てられます。タンパク質を遠心フィルターユニット内の約1ミニモルに濃縮します。

これを行うには、サンプルをフィルターユニットに導入し、4, 000 Gで30分間遠心分離します。遠心分離ステップの合間に、フィルターユニット内の溶液をピペットで穏やかに混合して、フィルターメンブレンでのタンパク質沈着を回避します。目的の濃度に達するまで手順を繰り返します。

サンプルをファルコンチューブに移し、室温で1週間撹拌下してインキュベートします。通常、サブユニットのフィラメントへの重合は、溶液が濁ることを伴います。アジ化ナトリウムの容積あたりの重量を0.02%加えて、細菌汚染を防ぎます。

タンパク質集合体を採取するには、サンプルを20, 000 Gおよび4度で1時間遠心分離します。サンプルの乾燥を避けるために表面を覆うのに十分な液体だけを残して上清の大部分を吸引し、測定までサンプルを4度で保管します。固体NMRによる構造解析に必要な実験について紹介します。

C13核で検出された一次元交差偏光(CP)および不適切な実験は、それぞれアセンブリ内の硬質タンパク質セグメントと柔軟なタンパク質セグメントを検出するために使用されます。そして、構造的均質性と局所多型の程度を推定すること。ここでは、標準的な実験値を使用します。

一般的なパラメータ範囲は、プロトコルに示されています。ロタをNMR磁石に挿入し、プロトコルに記載されているようにマジックアングルの回転を開始します。希望の回転周波数を設定し、±10ヘルツ以内に安定させます。

16回のスキャンを使用して、単一のパルス、1次元の陽子スペクトルを記録します。1DプロトンカーボンCPを設定します。CP実験では、硬質コンフォメーションの残基から生じるシグナルが示されています。初期実験パラメータは、参照化合物の標準的な最適化手順から取得されます。

パルスキャリブレーションとデカップリングパラメータは、感度が十分に高い場合、サンプルで最適化できます。ここでは、16回のスキャンでCPを記録します。CP接触時間と電力レベルは、CP接触時間の最適化のためにここで示しているように、最大信号強度に基づいて選択されます。

この例の最大強度は 800 ミリ秒に達します。デカップリングパラメータも、参照化合物のキャリブレーションから最初に設定されたパラメータから再調整する必要があります。最後に、信号とのオーバーラップを避けるために、与えられたマジック角の回転周波数(ここでは18キロヘルツ)での回転側バンドの局在化を注意深く観察します。

1次元スペクトルフィンガープリントとして機能する参照1DプロトンカーボンCPスペクトルを記録します。ここでは、800ミリ秒のCP接触時間、100キロヘルツのデカップリング強度、3秒のリサイクル遅延、20ミリ秒の収集時間で128回のスキャンを蓄積します。CP実験を無関心に処理します。

サンプル内のC39を推定するための単離されたピークを選択し、構造秩序と均質性を示します。ここで、線幅は、半分の高さでの全幅として測定され、約60〜70ヘルツであり、アセンブリ内のタンパク質構造が整然としていることを示しています。タンパク質アセンブリの移動性の高い部分を調査するために、1次元のプロトンカーボンイン不適切な実験を設定します。

参照不適切な実験を記録して、可動性タンパク質セグメントの指紋として役立ちます。一般的なパラメータは128回のスキャンで、取得時間は25ミリ秒です。プロトンカーボンイン不適切な実験を処理します。

シグナルの数とその位置は、それぞれ残基移動度とアミノ酸組成の程度を示しています。ここでは、ツイストバッファーCH2 merit-yからのシグナルのみが観察され、タンパク質全体がアセンブリ構造において硬直した領域にあります。タンパク質構造のコンフォメーション解析は、アセンブリのすべての硬性残基に対する固体NMR共鳴割り当てに基づいています。

これを可能にしたのは、化学シフトが局所的な化学環境に対する高感度プローブであり、タンパク質の二次構造を予測するために使用できるためです。その後、完全な3D構造決定は、最大9オングストロームの分子内原子および分子間原子の近接をコードする距離拘束などの構造データの収集に基づいています。ここでは、基本的な2次元実験がどのように記録されるかを示し、逐次割り当ての例を示します。

次に、選択的にC13標識サンプルに記録された実験から距離拘束を収集する方法について簡単なデモンストレーションを行います。短い混合時間を設定する 2 次元炭素 PDSD 実験 残留物内炭素炭素相関を検出します。1次元CP実験から最初の陽子炭素交差分極ステップの値をコピーします。

混合は、均一にC13標識されたサンプルのために50ミリ秒に設定できます。ここでは、間接ディメンションと直接ディメンションでそれぞれ15ミリ秒と20ミリ秒の取得時間を選択しました。PDSD スペクトルを処理するために、サインベルシフトが 3.5 の QSINE ウィンドウ関数を使用します。

残留物固有の割り当てを有効にするには、短い混合時間PDSDの設定を使用して、100〜200ミリ秒の混合時間で中間混合時間PDSDを記録します。窒素検出実験を含む追加のスペクトルは、完全な共鳴の割り当てにしばしば必要であり、プロトコルで詳細に説明されていることに注意してください。CCPNMR AnalysisなどのNMR解析プログラムを選択します。

2Dスペクトルをソフトウェアにロードし、一次タンパク質配列を持つ分子オブジェクトを作成します。まず、短い混合時間PDSDスペクトルで見えるアミノ酸タイプの同定から始めます。スピン系の炭素原子を連結することで、残基の種類に応じた割り当てが可能になります。

ここでは、テニウム残基のスピン系を割り当てます。C-α原子核、C-β原子核、C-γ原子核間の分極移動は、PDSDスペクトルの物理的なクロスピークにつながります。この手順で、できるだけ多くの残留物を特定してみてください。

短時間および中間の混合時間PDSDスペクトルを重ね合わせます。PDSDの中間混合時間に見える補足ピークは、通常、シーケンシャル残基間の接触から生じます。スピン系の共振ピークをマークし、中間混合時間PDSDと他のスピン系の共振周波数との相関関係を見つけます。

、糸状タンパク質集合体におけるテニウム33からイソリュータン32への逐次的割り当てを示す。テニウムスピン系の共鳴周波数は、32のアイソリュートの炭素周波数で見ることができ、その逆も同様です。窒素検出スペクトルによる割り当て、および割り当てからタンパク質の二次構造を取得する手順は、プロトコルに記載されています。

徹底的な共振割り当ての後、長距離拘束の特定に進むことができます。長距離拘束とは、単量体サブユニットの三次折り畳みとアセンブリ内のサブユニットの配置の両方を定義する、離れた残基間の分子内または分子間の炭素炭素近接です。ここでは、選択的にC13標識されたサンプルが特に重要です。

中間混合時間PDSDと長い混合時間カーボンカーボンPDSDを選択的にC13標識サンプル上に400ミリ秒から1秒の混合時間で記録します。可能であれば、両方のPDSDを選択的に標識した同じサンプルに記録しておく必要があります。補足的なピークは、より遠いC13原子間の相関から生じます。

共振の割り当て時には、選択的ラベリングスキームを考慮に入れてください。この場合、1-3-グリセロールです。ここでは、長距離接触ピークと、両方の次元への明確な割り当ての例を強調しました。

テニウム33 C-ベータとタンパク質45 C-アルファ。長距離距離の識別が完了した後、拘束は曖昧さなしまたは曖昧さ、および分子内または分子間に分類されます。構造モデリングのために準備する拘束リストは、プロトコルに記載されています。

さまざまなプログラムを使用した構造モデリングのチュートリアルは、オンラインで見つけることができます。固体NMRデータは、単独で、または補完的なデータと組み合わせて、超分子集合体の原子レベルの構造決定を可能にします。固体NMRの利点は、一方では、二次構造情報と分子内界面からの原子距離制約の両方を提供できることであり、これらをモデリングプロセスに統合することができます。

しかし、その一方で、固体NMR分光法のユニークな特徴は、無傷の超分子集合体の分子間界面における原子距離の制約を収集できることにあります。しかし、分子内拘束標識と分子分子間拘束標識の検出と区別は面倒なプロセスであり、通常は選択的にC13標識サンプルを調製する必要があります。しかし、選択的標識法、分光器ハードウェア設計、固体NMR法の新たな開発により、この技術は、物体サイズ、長距離秩序、または結晶化度の制限なしに原子レベルの分子情報を提供するという理論的な可能性をますます発揮しています。

この方法により、生体分子集合体の原子構造を研究することができます。NMR条件を最適化し、高分解能のデータを得るためには、サンプルを慎重に準備することが非常に重要です。このプロトコールにより、タンパク質集合体の情報である原子分解能を得ることができます。

また、この手法は、構造生物学の他の手法と組み合わせて、3次元モデルを得ることができます。