Name: 固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 学ぶ固体核磁気共鳴分光法による高分子タンパク質アセンブリの原子スケール構造解析。不溶性・非晶質サンプルの高分解能構造決定手法を解説し、剛直・可動領域の可視化と分子間距離制約の取得方法を紹介します。

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この作品は、ANR (13-PDOC-0017-01 学と ANR-14-CE09-0020-01 アダムローリー) によって資金を供給、「未来への投資」プログラム アイデックス ボルドー/CNRS (PEP 2016 年学) 参照 ANR-10-アイデックス-03-02 学にこそ注ぐラ凝った Médicale (FRM - アダムローリーに AJE20140630090)、FP7 プログラム (FP7 の人々-2013-セエグ アダムローリーに) および欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラム (アダムローリー、契約なしの 639020 に付与開始 ERC) の下で欧州研究会議 (ERC) とプロジェクト」WEAKINTERACT."

著者が明らかに何もありません。

固体 NMR (SSNMR) は、原子レベルで高分子タンパク質複合体を特徴付けるための選択の方法です。SSNMR ベースの構造決定の中心的な問題の 1 つは通常 (セカンダリを含む低解像度モデルに至る、様々 な高精度の 3次元構造モデルを確立することができる調査システムのスペクトルの質構造要素と小さな 3 D 情報) 疑似原子の 3 D 構造。多次元 SSNMR 実験から抽出された構造情報の質と量はアセンブリの高分解能 nmr による構造を計算するキー。
記述されていたプロトコルは、 13C-13C、 15N-13C 構造拘束高信号にノイズにいくつかの 2 D (および時々 3 D) スペクトルの記録を必要とする検出に依存します。中程度の MAS 周波数 (&#60; 25 kHz)、サンプルがサンプル水和に依存してまで ~ 50 mg の蛋白量を可能にする 3.2 4 mm 径のローターに導入されました。ローター内サンプルの量は SSNMR スペクトルにおける信号対雑音比、長距離距離制約の検出とその明確な割り当てのための決定的な要因に直接比例します。
スペクトル分解能は、シーケンシャル共鳴割り当ておよび拘束コレクション中に重要なパラメーターです。最適な結果を得るためには、サンプルの準備パラメーターは精製サブユニットとアセンブリの条件 (pH、バッファー、振動、温度等) を中心に、最適化する必要があります。サンプルを最適化するためのいくつかの異なる条件のアセンブリを観察されている、ラベルのサンプルを準備して 1 D 1h-13C CP スペクトル (ステップ 2.1 で説明) それぞれ作製した試料を記録するをお勧めします。スペクトルはスペクトル分解能と最適条件を決定することができますに基づいて別の準備の間の分散を比較するのに役立ちます。
SSNMR データの品質は、偏光の転送手順については特に、NMR アクイジション ・ パラメーターの選択によって強く決まります。高感度、スペクトル分解能、高分子タンパク質複合体などの複雑なターゲットに直面するときに必要なは、高磁場の強さ ( 1H 周波数 ≥600 MHz) の使用が欠かせません。
多くの場合、制限要因は、分光器の可用性です。したがって、準備するサンプルの賢い選択分光器セッションを付けます。いずれにせよ、均一に13C、 15N 標識サンプル シーケンシャルと内残留共鳴割り当てを実行する前提条件であります。固体 nmr 測定法によって割り当てられたタンパク質は、「71」を参照してください。選択的13C 標識サンプルが必要です適度な MAS 周波数で高分子アセンブリの構造決定長距離13c-13C と13C ・15N 検出連絡先のサンプルに基づいて 1, 3-13C -、2-13C エステルおよび/または 1-13C -、2 -、13C グルコース ラベリングよく使用される前述のよう。2 つのラベル付けスキーム間の選択は、スペクトルの信号対雑音比と解像度に基づいています。内・分子間の長距離接触を区別するには、混合ラベルおよび希薄化後の試料は効率的で明らかにしました。
一言で言えば、原子の SSNMR 構造研究のための重要なステップは、: (i) の優れたサンプル量と品質を取得するアセンブリの最適化する必要性サブユニットの準備、(ii) 分析計フィールド強さと集録パラメーターする必要があります慎重に選ばれました。(iii) 選択的ラベリング戦略は、3 D 構造決定に必要な必要なデータの量は、データの品質と相補的なデータの可用性によって異なります。
Homomultimeric ナノオブジェクト膜タンパク質に至る超分子システムの広い範囲への適用性、にもかかわらず SSNMR 多い同位体ラベル材料の mg 量の必要性によって制限されます。超高速 MAS (≥100 kHz) SSNMR 1H 検出 NMR への道を開く技術動向とサブ mg 72,,7374最小サンプル量の限界をプッシュ。それにもかかわらず、構造を解明13C 標識サンプルが不可欠、体外組み立てサンプルまたは、セルの最小媒体で生き残る生物で表されるシステムに SSNMR のアプリケーションを制限します。SSNMR は新たな方法です (詳細レビューは、 75,,767778,を参照)。
SSNMR アプリケーションが高解像度の 3 D 構造を得るための重要な要因は、スペクトル分解能: アセンブリの構造不均質性組み込みスペクトル解像度とスペクトル解析を制限できます。残渣特定13C ラベル可能性がありますいくつかのケースで代替手段を提供 (最近の例を参照してください79,80) 構造のモデルを得るために戦略的な残留に関する特定の距離情報を取得します。
3次元定量 SSNMR はまだアプローチおよび 600-1000 MHz (1H 周波数) で週に数日システムによって、洗練された楽器に頻繁に長くデータ収集時間のいくつかのデータセットのコレクションを必要とします。分光器。したがって、分光器時間へのアクセス SSNMR オーナーシッの制限要因になることができます。
Homomultimeric 蛋白質のアセンブリの3,57,64,70, SSNMR 構造規制の高番号を識別するために十分な品質の SSNMR データにつながる場合まだ顕微鏡次元にないアクセスを与えます。したがって、homomultimeric アセンブリのde novo SSNMR 構造決定、EM または長さあたりの質量 (MPL) データ理想的にはデータを補完 SSNMR 対称性パラメーターを取得します。SSNMR データだけでは原子と分子間のインタ フェースを提供します。
SSNMR は EM または MPL の測定などの構造技術の高い補完性が、データは変異または切り捨てられたサブユニットの溶液 NMR や x 線結晶構造解析による原子構造と完全に結合できます。研究数の増加は、異なる構造データの連動が高分子アセンブリ (代表的な例については、図 6を参照) の原子の 3 D モデルを決定するため許可されている文献で見つけることができます。
構造生物学の分野、研究する有望な手法として現れる SSNMR不溶解性および非晶質アセンブリ、原子レベル、すなわち構造データを提供する原子スケールで。この点で、SSNMR はウイルスの封筒、細菌のフィラメント、アミロイド、RNA などのネイティブ環境および蛋白質のアセンブリ内膜タンパク質を含む分子の x 線結晶解析および溶液 NMR にペンダントとRNA 蛋白質の複合体 (たとえば、81を参照してください)。その汎用性の高いアプリケーションの in vitro細胞において、二次、第三紀と第四紀の構造変化の追跡などパートナー分子原子スケール (たとえば82) とインタラクション サーフェスを識別してマッピング分子動力学組み立てられた複合体のコンテキストでは、複雑な生体分子のアセンブリの将来の構造研究で SSNMR の重要な可能性を示します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>M9 媒体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>0.5 グラム/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 グラム/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6.7 グラム/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 Μ M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>した FeCl3</td>
			<td>1 Μ M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 Μ M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM ビタミン ミックス 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C グルコース</td>
			<td>2 グラム/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15NH4Cl</td>
			<td>1 グラム/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1:組換え蛋白質の最小限の式中の組成の生産大腸菌 BL21 セル。

マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (SSNMR) の進歩は、原子分解高分子タンパク質複合体の構造解析のための効率的なツールを提供しています。これらの蛋白質のアセンブリは、多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たすユビキタス システムです。その分子構造と相互作用とダイナミクスの示されているように SSNMR 研究によってアクセス可能ウイルス (カプシド1) 細菌感染メカニズム (分泌システム2,3、4ピリ pili)、膜タンパク質複合体5,6,7,8と機能性アミロイド9,10,11。この型分子集合体のタンパク質が変性、アミロイドの状態で組み立てる、異常細胞の挙動や細胞死12,13の原因と神経変性疾患のように病態を引き起こすことができるも。タンパク質複合体は頻繁に対称線維、フィラメント、毛穴、チューブ、ナノ粒子など様々 な形状の大きな分子オブジェクトに蛋白質の亜単位の倍数コピー重合によって造られます。第四紀のアーキテクチャは、空間的で、一時的なアセンブリを編成し、高度な生物学的機能を可能にする蛋白質の亜単位間の弱い相互作用によって定義されます。彼らの非結晶性が従来の x 線結晶構造解析や nmr の使用を制限する非常によくとこれらのアセンブリの原子スケールでの構造の調査は高解像度技術のための挑戦の本質的な不溶性近づきます。マジック角回転 (MAS) SSNMR は不溶性高分子アセンブリの原子分解能データを取得する新興技法など複雑な生体システムの増加する数の 3 D 原子モデルを解決するその効率を証明されています細菌のフィラメント、アミロイドのアセンブリおよびウイルス粒子14,15,16,17,18,19,20、 21,22。強磁場、方法論開発、前処理技術の進歩が顕著で、生物学的に関連した、さまざまな環境で、高分子不溶性タンパク質を調査する手法に MAS SSNMR を確立します。組み立て状態や細胞膜、技術の高いクライオ電子顕微鏡法を補完するものを作るします。多くの場合、対称性の非常に高いこのようなタンパク質複合体の特徴です。Homomolecular アセンブリ内のすべてのタンパク質サブユニットが同じローカル構造であることとして、MAS SSNMR はこの機能を悪用し、したがって事実上同じ SSNMR 署名、分析の複雑さを大幅に削減します。
中程度の MAS の高分子タンパク質複合体の構造の研究のための効率的なプロトコル (&#60; 25 kHz) SSNMR このビデオで提示し、別の手順 (図 1) に分割することができます。糸状のタンパク質のアセンブリ (図 1のステップを強調表示を参照してください)、蛋白質サブユニットの浄化を除いて各蛋白質の異なる例示 SSNMR 構造研究のワークフローの重要な段階を目指しますアセンブリが極めて重要な構造の研究とどのような専門的なチュートリアルは SSNMR 分光法で構造計算の技術・方法論の詳細に入ることがなく、利用可能なオンライン。現在のプロトコル MAS 条件下で固体 NMR 実験に焦点を当てますの使用対応して生物的環境23,24,25,26,27、配向膜などタンパク質の立体構造と膜のようなメディアの MAS 技術なし動的蛋白質間相互作用の調査を可能にします。タンパク質発現アセンブリ手順と重要な SSNMR スペクトル解析と解釈の記録を紹介します。SSNMR 法による高分子アセンブリの原子分解能構造解析を実行するリーダーを有効にする構造解析パイプラインへの洞察を提供するためを目指しています。
プロトコルには、3 つのセクションが含まれます。
1. 固体 NMR サンプル生産
固体 NMR 解析の前提条件、[表現される高分子アセンブリの必要性のタンパク質成分、同位体標識、精製され、組み立てられた生体外で(使用例は図 2) ネイティブのような複雑な状態に.確実に高感度 NMR、 13C、 15N 標識同位体濃縮は最小限細菌式培地13C や15N など、一様に13を使用して必要ですC 標識グルコース/グリセリンと15NH4Cl それぞれ。プロトコルの後の段階で選択的に13C 標識サンプル生成選択的13C 標識ソースなど (1, 3-13C)-、(2-13C)-グリセロール (または (1-13C)-、(2-13C)-ブドウ糖) NMR 解析を容易にするために使用されます。50 15n-と 50 13C 標識または 50% の等モル混合物に対応する混合ラベル サンプル (1, 3-13C)-50% (2-13C)-グルコース分子の検出を説明する導入相互作用。アセンブリ ステップの間に厳密な条件と同様、蛋白質の純度の高度は、最後のサンプルの均質構造秩序を保証するために重要な要因です。
2 一次元 (1 D) 固体 nmr 法に基づく予備の構造評価
SSNMR による構造解析のための重要な実験を紹介します。一次元 (1 D) 交差偏波 (CP) と INEPT/RINEPT28実験、 13C 核の検出を使用アセンブリでそれぞれ、剛構造と柔構造のタンパク質セグメントを検出し、構造のある程度を推定するには均一性とローカル ポリモーフィズム (の例が、図 3を参照としている場合)。
<st></st>栄 > 3。立体配座解析と 3次元構造の決定
1 と 2 のサブセクションにかかわる化学シフトはローカル環境に非常に敏感なプローブとピピ/psi を予測するために蛋白質のアセンブリのすべての剛体残留 SSNMR 共鳴割り当てに基づく立体構造の解析二面角し、それによって二次構造を決定します。図 4は、蛋白質のアセンブリ.の硬質コアでシーケンシャル共鳴割り当ての例を示します3 D 構造の決定は構造のデータのコレクションなどに基づいてエンコード距離拘束高速交通 (&#60; 7-9 Å)、内と分子間情報の両方を含みます。3 と 4 では、長距離の遠い拘束コレクションと解釈を説明します。長距離接触が生じる残渣から私 j、すると分子内13c-13C 近接電波として定義されます | i j |≥4、それによりタンパク質における立体折り単量体のサブユニットの分子間13c-13C の近接電波としての定義、アセンブリ内の蛋白質の亜単位の分子間のインターフェイスを定義します。内・分子間のインターフェイスを図 5に示します。SSNMR 拘束検出13c-13C、 15N-13C シフトリ実験は通常流行り廃り距離エンコード &#60; 1 nm。第四款は、分子間の距離の制約の検出を説明します。対称的なタンパク質複合体、同質ラベル サンプル (すなわち一様にまたは選択的に標識 100%) の使用のサブユニットの分子間相互作用の特定の限られたのとして両方内- と間分子連絡先につながる検出信号。分子間の近接電波の明確な検出は、集計前に組み合わせる 2 つの異なるラベルのサンプルの等モル混合物を含む混合のラベル サンプルを使用して実現されます。第 5 款構造のモデリングを簡単に紹介します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
図 1:固体 nmr 法による原子分解能構造解析のワークフロー 。13C、 15N 同位体標識タンパク質の生産、精製サブユニット、サブユニット集合、集合体の形成、SSNMR 実験、SSNMR 実験解析、距離拘束の抽出の制御および構造のモデリングが表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR分光計(> 11.7テスラ)</td><td>ブルカー</td><td>三</td><td></td></tr><tr><td>重共鳴MAS SSNMRプローブヘッド&nbsp;</td><td>ブル</td><td>カー-SSNMR</td><td></td></tr><tr><td>ローター4mm</td><td>ブル</td><td>カーK1910</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機5804 R&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5805000629</td><td></td></tr><tr><td>GeneQuant 1300 分光計</td><td>ダッチャー</td><td>28-9182-13</td><td></td></tr><tr><td>IGS60 インキュベーター ヘラサーム 75 L</td><td>ダッチャー</td><td>228001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4450 ベンチトップ オービタルシェーカー</td><td>ダッチャー</td><td>78376</td><td></td></tr><tr><td>チューブリボルバー 攪拌機</td><td>ダッチャー</td><td>79547</td><td></td></tr><tr><td>ソノパルス HD 3100</td><td>バンデリン</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>マイクロパルサーエレクトロポレーター</td><td>Biorad</td><td>165-2100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアンテトラセルシステム</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure system</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーマイクロマン M25 ピペット</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F148502</td><td></td></tr><tr><td>名名<</td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amiconRウルトラ15</td><td>シグマ</td><td>Z740199-8EA</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーとピストン</td><td>ギルソン&nbsp;</td><td></td><td></td>F148112</tr><tr><td>ヘラ</td><td>フィッシャー</td><td>13263799</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース13C6</td><td>シグマ</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>アンモニウム-15N-塩化</td>シ<td>グマ</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>1,3 13C<サブ>2</サブ> グリセロール</td><td></td><td>シグマ 492639</td><td></td></tr><tr><td>2 13C グリセロール</td> シ<td>グマ</td><td>489484</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>Σ</td><td>K1876</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>Σ</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>シグマ</td><td>S7907</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>カリウム一塩基性</td><td>シグマ</td><td>P5655</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td>シ<td>グマ</td><td>71380</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウム</td><td>シグマ</td><td>C1016</td><td></td></tr>硫酸<tr><td>マグネシウム</td>シ<td>グマ</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>塩化鉄</td><td>シグマ</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>塩化亜鉛</td><td>シグマ</td><td>793523</td><td></td></tr><tr><td>MEMビタミン液(100回)</td><td>Sigma</td><td>M68954</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>フィッシャー</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>トリズマベース&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>T1503</td><td></td></tr>トリ<tr><td>シン</td><td>シグマ</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>シグ</td><td>マ436143</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>4,4-ジメチル-4-シラペンタン-1-スルホン酸&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>178837</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unicorn 6.3</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Akta systems</td></tr><tr><td>ccpNMR</td><td>CCPN&nbsp;</td><td></td><td>分光器システム</td></tr></tbody></table>

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

超分子タンパク質複合体は、宿主-病原体相互作用、神経変性疾患の伝播にウイルス感染に至る生物学的プロセスの基本的な役割を果たします。このようなアセンブリは、複数の蛋白質の亜単位が様々 な細胞機能を実行したり、有害な結果を引き起こす大きい高分子オブジェクトを形成する非共有結合方法で編成で成っています。原子力洞察力アセンブリ機構、高分子アセンブリの機能が頻繁に彼らの固有の不溶性以来乏しいと非結晶性しばしば劇的にほとんどの技術から得られたデータの品質が低下構造生物学、x 線結晶構造解析や核磁気共鳴 (NMR) ソリューションなどで使用されます。我々 は原子分解能での高分子アセンブリの構造を調査するための強力な方法としてマジック角回転固体 NMR 分光法 (SSNMR) を紹介します。SSNMR は原子サイズと溶解性の制限なし組み立てられた複雑な詳細を明らかにできます。ここで提示されたプロトコルは、 13C の生産に不可欠な手順をについて説明します/15N 同位体標識高分子蛋白質アセンブリ SSNMR スペクトルとその分析と解釈の標準の獲得に。例として、糸状タンパク質アセンブリの SSNMR 構造解析のパイプラインを示します。

典型的な SSNMR ワークフローには、図 1に示すいくつかの手順が含まれています。通常蛋白質の亜単位はエシェリヒア属大腸菌の異種発現の in vitroによる生産・浄化・静的な条件でも揺れが時々 を組み立ています。蛋白質の亜単位の表現そして浄化は、SDS ゲル クロマトグラフィー (図 2 a) が続いています。電子顕微鏡 (EM) 解析による高分子アセンブリの形成を確認しことができます (糸状のアセンブリの例は図 2 bを参照)。
SSNMR ローターに蛋白質のアセンブリの導入後分光計にローターを挿入、MAS 周波数および温度を規制、スペクトルが記録されます。1 D SSNMR による最初の洞察が得られます。図 3は、構造的に均質な蛋白質のサンプル、 1h-13C CP スペクトル、13C 共鳴で蛋白質の亜単位の硬質コアの存在を明らかに13C のチャネル上で検出された典型的な SSNMR FID を示しています、アセンブリ、およびモバイルの残基を表す 2D 1h-13C 不適切なスペクトル。アセンブリ構造の硬質コアの原子洞察は、多次元 SSNMR 実験する必要がありますに記録される均一に、選択的に標識 SSNMR 共鳴を最初に割り当てるし、(の図 4 を参照してください長距離近接電波を検出する試料).
すべてのスペクトルは、割り当てる SSNMR 共鳴し内と分子間距離拘束条件 (図 5) を抽出する適切なソフトウェアで解析処理します。SSNMR 距離拘束が単独で使用されるかまたは相補的な技術からのデータと組み合わせて、これは、モデリング プログラムに統合できます。
SSNMR 技術によって解決高分子アセンブリの代表的な原子構造は、図 6は、細菌の付属とアミロイド線維から糸状のアセンブリのいくつかを示します。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
図 6:固体 NMR 手法によって決定された糸状高分子構造: 細菌のフィラメントおよびアミロイド線維。A)尿路エシェリヒア属大腸菌、PDB コード 2N7H 4の 1 型線毛B) ASC フィラメント、PDB コード 2N1F 63;C) III 型分泌システム針、PDB コード 2MME、2LPZ、2MEX 2,3,64;D) AB42 β アミロイド線維、PDB コード 2NAO、5KK3、2MXU 65,66,67大阪変異 PDB コード 2MVX 57, アイオワ州変異 PDB コード 2MPZ 58;E) α-シヌクレイン線維、PDB コード 2N0A 68;F) ヘットのプリオン ドメイン、PDB コード 2RNM、2KJ3 69,70。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

本プロトコルの全体的な目的は、マジック角回転（MAS）固体NMR分光法を用いて、不溶性かつ非結晶性の超分子タンパク質複合体の構造を原子レベルの分解能で解析することです。ここでは、固体NMRを用いてバイオ分子タンパク質複合体の原子構造を研究するための不可欠な手法的なステップを提示します。これらの複合体は本質的に不溶性で非結晶性であるため、その原子構造を解析することは極めて困難です。固体NMRは、組み立てられた物体のサイズや溶解度に制限されることなく、原子レベルの分解能で分子構造やダイナミクスを研究できる新興技術です。ここでは、同位体標識サンプルの調製、固体NMRによる構造データの収集および解析を含む、固体NMRを用いてバイオ分子タンパク質複合体の原子構造を可視化するための主要な手順を説明します。固体NMRワークフローの最初のステップは、C13 N15標識タンパク質サブユニットの作製と、それらのin vitroでの組み立てです。あらかじめ温めておいた15 mLのLB培地の前培養液に、形質転換したE.coli細胞のコロニーを1つ接種します。37 °C、200 RPMの振盪条件下で一晩培養します。本培養に接種するため、前培養液の全量を、必要な同位体標識炭素源および窒素源を含む1 Lのあらかじめ温めておいたN9培地へと移します。これらには、$^{15}$N標識塩化アンモニウム、一様$^{13}$C標識グルコース、選択的$^{13}$C標識グルコース、または選択的$^{13}$C標識グリセロールが含まれます。37 °Cでインキュベートし、培養液が濁り次第、600 nmにおける吸光度（OD$_{600}$）を測定します。OD値が0.8に達したら、0.75 mMのIPTGを添加してタンパク質発現を4時間誘導します。なお、最適な誘導条件はタンパク質によって異なる場合があることに注意してください。6,000 G、4°Cで30分間遠心分離し、細胞を回収します。タンパク質サブユニットを精製した後、in vitroでアセンブリを行います。遠心フィルターユニットを用いて、タンパク質を約1 mMまで濃縮します。そのためには、サンプルをフィルターユニットに入れ、4,000 Gで30分間遠心分離します。遠心分離の工程の間は、フィルターメンブレンへのタンパク質の蓄積を防ぐため、ピペットでフィルターユニット内の溶液を穏やかに混合してください。目的の濃度に達するまで、この手順を繰り返します。サンプルをファルコンチューブに移し、室温で1週間、撹拌しながらインキュベートします。通常、サブユニットが重合してフィラメントが形成されると、溶液が混濁します。細菌汚染を防ぐため、0.02% w/v のアジ化ナトリウムを添加してください。タンパク質複合体を回収するため、サンプルを20,000 G、4°Cで1時間遠心分離します。サンプルの乾燥を防ぐため、表面を覆う程度の液体のみを残して上澄みの大部分を吸引し、測定までサンプルを4°Cで保存します。ここでは、固体NMRによる構造解析に不可欠な実験について説明します。C13核で検出される一次元的なクロスポーラリゼーション（CP）およびINEPT実験を用いて、アセンブリ内の剛直なタンパク質セグメントと柔軟なタンパク質セグメントをそれぞれ検出します。また、構造の均質性と局所的なポリモーフィズムの程度を推定します。ここでは、標準的な実験値を使用します。一般的なパラメータ範囲はプロトコルに記載されています。rotaをNMRマグネットに挿入し、プロトコルに従ってマジック角回転を開始します。任意の回転周波数を設定し、±10 Hz以内に安定したことを確認してください。16回のスキャンを用いて、単一パルスの一次元プロトンスペクトルを測定します。1DプロトンカーボンCP実験を設定してください。CP実験では、剛直なコンフォメーションにある残基に由来する信号が検出されます。初期の実験パラメータは、標準物質を用いた標準的な最適化手順から取得します。感度が十分に高い場合は、サンプルを用いてパルス校正およびデカップリングパラメータを最適化できます。ここでは、16回のスキャンでCPを記録します。CPの接触時間と電力レベルは、最大信号強度に基づいて選択します。ここではCP接触時間の最適化について示します。この例における最大強度は800ミリ秒で到達しています。また、デカップリングパラメータについても、参照化合物のキャリブレーションで当初設定したものから再調整する必要があります。最後に、信号との重複を避けるため、ここでの18キロヘルツのように、指定されたマジック角回転周波数におけるスピングサイドバンドの位置を注意深く観察してください。1次元のスペクトル指紋として機能する参照用の1DプロトンカーボンCPスペクトルを測定します。ここでは、CP接触時間800 millisecond、デカップリング強度100 kilohertz、リサイクル遅延3 seconds、および収集時間20 millisecondsの条件で、128回のスキャンを累積します。CP実験のデータ処理は、アパシゼーションを行わずに行います。試料中のC39を推定するために、孤立したピークを選択します。これは構造の秩序性と均質性を示す指標となります。ここでは、半値全幅として測定される線幅が約60～70 hertzであり、アセンブリ内のタンパク質構造が高度に秩序化していることを示しています。次に、タンパク質アセンブリの可動性の高い部位を調べるため、一次元プロトン炭素INEPT実験を設定します。可動性タンパク質セグメントのフィンガープリントとして利用するため、リファレンスINEPT実験を記録します。標準的なパラメータは、スキャン数128回、収集時間25 millisecondsです。プロトン・カーボンINEPT実験を処理します。シグナルの数およびその位置は、それぞれ残基の可動性の程度とアミノ酸組成を示しています。ここでは、アセンブリ構造においてタンパク質全体が剛直な領域にあるため、ツイストバッファーのCH2メチル基からのシグナルのみが観察されます。タンパク質構造のコンフォメーション解析は、アセンブリのすべての剛直な残基に対する固体NMR共鳴割り当てに基づいています。これは、ケミカルシフトが局所的な化学環境に対して非常に感度の高いプローブであり、タンパク質の二次構造を予測するために利用できるためです。完全な3D構造決定は、その後、最大9 Åまでの分子内および分子間の原子近接性をコード化した距離拘束などの構造データの収集に基づいて行われます。ここでは、基本的な二次元実験の記録方法を示し、シーケンシャルアサインメントの例を挙げます。次に、選択的にC13標識された試料を用いて記録された実験から距離拘束を収集する方法について、短いデモンストレーションを行います。残基内カーボン-カーボン相関を検出するために、短い混合時間を用いた二次元カーボン-カーボンPDSD実験を設定します。最初のプロトン-カーボンクロスポーラリゼーションステップの値は、一次元CP実験からコピーしてください。均一にC13標識されたサンプルの場合、ミキシング時間は50ミリ秒に設定できます。ここでは、間接次元と直接次元の収集時間をそれぞれ15ミリ秒および20ミリ秒に選択しました。PDSDスペクトルを処理するために、sine-bellシフト3.5のQSINEウィンドウ関数を使用します。残基特異的なアサインメントを可能にするため、短時間混合時間 PDSD の設定を用い、混合時間を 100 から 200 milliseconds に設定した中間混合時間 PDSD を記録します。完全な共鳴アサインメントには、窒素検出実験を含む追加のスペクトルが必要になることが多く、詳細はプロトコルに記載されています。CCPNMR Analysis などの NMR 解析プログラムを選択してください。2Dスペクトルをソフトウェアに読み込み、一次タンパク質配列を用いて分子オブジェクトを作成します。まず、短い混合時間のPDSDスペクトルで確認できるアミノ酸の種類を同定することから始めます。スピンシステムの炭素原子を連結させることで、残基種特異的なアサインメントが可能になります。ここでは、トレオニン残基のスピン系を割り当てます。Cα、Cβ、およびCγ核の間で分極移動が起こることで、PDSDスペクトルに物理的なクロスピークが現れます。この手順を用いて、できるだけ多くの残基を同定してください。短Mixing timeと中間Mixing timeの両方のPDSDスペクトルを重ね合わせます。中間Mixing timeのPDSDに見られるサプリメンタリーピークは、通常、連続する残基間の接触に由来します。あるスピン系の共鳴ピークをマークし、中間Mixing timeのPDSDにおいて、他のスピン系の共鳴周波数との相関を確認します。我々は、フィラメント状タンパク質複合体におけるthenium 33からisolutane 32への逐次的なアサインメントを示します。theniumスピン系の共鳴周波数は32のisolutesの炭素周波数に現れ、その逆も同様です。窒素検出スペクトルを用いたアサインメントの手順、およびアサインメントからタンパク質の二次構造を決定する方法については、プロトコルに記載されています。徹底的なレゾナンス割り当ての後、長距離拘束の同定に進むことができます。長距離拘束とは、離れた残基間の分子内または分子間の炭素-炭素近接性であり、単量体サブユニットの三次構造とアセンブリ内でのサブユニットの配置の両方を規定します。ここでは、選択的にC13標識された試料が特に重要となります。選択的にC13標識されたサンプルを用い、400 millisecondsから1秒の混合時間で記録した長時間混合時間の炭素-炭素PDSDに、中間的な混合時間のPDSDを重ね合わせます。可能であれば、両方のPDSDは同一の選択的標識サンプルで記録されている必要があります。補足的なピークは、より離れた位置にあるC13原子間の相関によって生じます。共鳴割り当てを行う際は、選択的ラベル化スキーム（本ケースでは1,3-グリセロール）を考慮してください。ここでは、両次元において一義的な割り当てが可能な長距離コンタクトピークの例を強調して示しています。Thenium 33 C-betaとprotein 45 C-alphaを用います。長距離距離同定を完了した後、拘束条件を、一意的に決定できる（unambiguous）か曖昧（ambiguous）か、および分子内（intra molecular）か分子間（inter molecular）かに分類します。構造モデリングのために準備すべき拘束条件のリストは、プロトコルに記載されています。さまざまなプログラムを用いた構造モデリングのチュートリアルは、オンラインで閲覧可能です。固体NMRデータは、単独で、あるいは相補的なデータと併せて用いることで、超分子集合体の原子レベルでの構造決定を可能にします。固体NMRの利点は、一方で、二次構造情報と分子内インターフェースからの原子間距離拘束の両方を提供できることであり、これらはモデリングプロセスに統合することができます。一方で、固体NMR分光法のユニークな特徴は、完全な超分子複合体の分子間界面において原子間距離拘束を収集できる能力にあります。しかし、分子内および分子間の拘束割り当てを検出して区別する作業は非常に煩雑なプロセスとなり、通常は選択的にC13標識されたサンプルの調製が必要となります。それでも、選択的標識戦略、分光計のハードウェア設計、および固体NMR手法の新たな発展により、この手法は、物体のサイズ、長距離秩序、または結晶性の制限を受けることなく原子レベルの分子情報を提供するという理論的なポテンシャルをますます発揮しつつあります。この手法を用いることで、生体分子複合体の原子構造を解析することが可能になります。高分解能のデータを取得し、NMR条件を最適化するためには、試料を慎重に調製することが非常に重要です。本プロトコールにより、タンパク質複合体の情報となる原子分解能を得ることができます。また、この手法を構造生物学における他の手法と組み合わせることで、三次元モデルを得ることが可能です。

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