Name: マウスにおけるビデオ解析システムを用いた文脈と手掛り恐怖条件付け試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 19 min 32 s
Description: 学ぶマウスの文脈・手掛け恐怖条件付け試験の標準化プロトコル。映像解析システムを用いて凍結行動を自動計測し、学習・記憶機構の神経科学研究における信頼性の高いデータ収集を実現する。

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ここに示したデータの中には、精神米国国立衛生研究所の博士ジャクリーンN.クローリーの実験室で得られたし、私たちは私たちが論文のデータを表示することを可能にするために彼女に感謝したいと思います。我々はまた、行動分析のためのImageFZプログラムの開発に彼の助け和夫中西に感謝します。この研究は、文部科学省、科学、スポーツ、日本文化から（包括脳科学ネットワーク）新学術領域に科学研究費補助金（B）（21300121）、科学研究費補助金によってサポートされていました、神経情報基盤センター（NIJC）、および科学技術振興機構（JST）のCRESTからの補助金からの助成金。

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<li>Takeuchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P301S+mutant+human+tau+transgenic+mice+manifest+early+symptoms+of+human+tauopathies+with+dementia+and+altered+sensorimotor+gating%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
<li>Koshimizu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenomatous+polyposis+coli+heterozygous+knockout+mice+display+hypoactivity+and+age-dependent+working+memory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits.</a> Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).</li>
<li>Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+E3+ligase+SCRAPPER+in+contextual+fear+conditioning%3A+extensive+behavioral+phenotyping+of+Scrapper+heterozygote+and+overexpressing+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
<li>Shoji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+behavioral+analysis+of+ENU-induced+Disc1-Q31L+and+-L100P+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice.</a> BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).</li>
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<li>Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+and+intact+hippocampus-dependent+learning+in+mice+lacking+the+M1+muscarinic+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor.</a> J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).</li>
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<li>Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fear+conditioning+enhances+different+temporal+components+of+tone-evoked+spike+trains+in+auditory+cortex+and+lateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala.</a> Neuron. 19, 613-624 (1997).</li>
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<li>Valentinuzzi, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+circadian+phase+on+context+and+cued+fear+conditioning+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Behav%22%5BJournal%5D)">Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice.</a> Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).</li>
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<li>Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+scoring+of+fear-related+behavior+using+EthoVision+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software.</a> J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).</li>
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<li>Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+brain-behavior+phenotypying+of+genetically-engineered+mice+on+research+of+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders.</a> Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).</li>
</ol>

我々は、この出版物に関連した興味のある既知の競合がないことを確認し、その結果に影響を与えた可能性があり、この作業にはかなりの財政的支援がなかった。

文脈手がかりと恐怖条件付け試験は、学習および記憶を評価するための最も広く使用されているパラダイムの一つである。このテストでは、関連付けは、コンテキストおよび/または条件刺激（聴覚信号）と嫌悪刺激（電気フットショック）との間で行われたパブロフの条件付けの一形態である。コンテキストまたはキューのどちらかに直面したときにコンテキスト/聴覚信号およびフットショックの単一のペアリングした後、マウスは長期的な凍結を示す。この試験では、凍結挙動が恐怖記憶の指標として用いられる。薬理学的病変の研究は、記憶形成、統合、及び検索は、例えば扁桃体、海馬および前頭前皮質3,33-35などのいくつかの脳領域によって調節されることを明らかにした。また、分子遺伝学研究は、特定の遺伝子および遺伝子改変マウス36を使用して、これらの脳領域における学習および記憶に関与する分子の役割を実証した。したがって、このテストはSIMPLあるEと恐怖の学習と記憶の根底にある神経生物学的基礎を探索するのに便利。この映画の記事では、我々は理解し、簡単にテストを実行するための詳細な情報を実験者を提供するために、我々のプロトコルを導入しました。 すくみ行動は、人間の実験者による直接観察により定量した。よく訓練された実験者が観察渡って信頼性の高い、安定した結果を生み出すことが期待される。しかし、この方法は、それが困難な直接の独立実験者と異なる研究室からの結果を比較すること、そのような観測方法の違い、観察者バイアス、および単純な定量化の間違いのような潜在的な問題を伴う。自動化されたフォトビーム·ベースのコンピュータ·測定システムはまた、26,30-32に使用されている。しかしながら、このシステムはまた、凍結挙動を測定する潜在的な問題を提示する。なぜならセンサ装置の、このシステムはtypicaなり、小さな頭の動きを検出することができない場合がありますLLY人間観察を通して「アクティブ」として採点する。また、凍結中震えは動物がフリーズ、フォトビーム間欠中断が震えるの結果として観察されている場合ので、不凍液として考えられるかもしれません。代替方法として、自動化された画像およびビデオ解析システムが17-20,37,38が開発されている。 Anagnostaras ら 37は、良好な有効性を有し、ウェル17,20,37-38の凍結スコア画像分析ソフトウェアプログラムと、いくつかのシステムが記載されている。しかしながら、これらのシステムおよび解析プログラムのほとんどは商業的供給業者から入手しなければならず、典型的に高価である。我々は、凍結挙動の分析のためのImageFZソフトウェアプログラムを開発し、このプログラムはフリーソフトウェアプログラムとして分配される。 ImageFZは、ピクセルの体（粒子）として、マウスが検出され、「凍結」や量に応じて、「非凍結」と微妙なマウスの動きを判別する連続する画像の各対の粒子間の非オーバーラップ領域の面積。代表的な結果に示されるように、ImageFZプログラムを用いての測定は、と一致して又は他​​の方法を用いて得られるよりも正確である。このように、ImageFZプログラムが自動的に人間の観察者が定義した基準を使用して凍結するように判断する動作を測定します。また、ImageFZプログラムは、距離が凍結挙動の衝撃感度および分析の評価を容易にする、その間、およびフットショック露光後、前（cm）の走行を算出する。 方法論的な違いは、研究室間に存在する。これらの違いは、研究室間のデータを比較することが困難で、別の実験室での結果を複製することがあります。より安定した比較可能なデータを得るためには、できるだけ多くの試験プロトコルを標準化する必要がある。 ImageFZと解析システムに寄与することができる試験手順の自動化をもたらす研究室全体で使用されるプロトコルの標準化。 凍結挙動を分析する際に、いくつかの行動反応を考慮しなければなりません。動物は恐ろしい状況に直面するとき、最初に、彼らは39を凍結するのではなく、逃げることがあります。逃げるには、恐怖反応の一つであり、その発生が恐怖記憶を過小評価につながる。第二に、凍結は、一般的な活動レベルに依存することが、実験マウスおよび対照マウスにおける活性レベルを検討する必要がある。 M1ムスカリン性アセチルコリン受容体を欠くマウスは野生型マウスと比較して凍結レベルの低下を示したが、例えば、種々の行動試験は、結果が代わりに記憶障害18のそれらの機能亢進表現型に起因し得ることを示した。 ImageFZは被験者が移動した距離（CM）を算出する。データは、違いは被験者間の一般的な活動レベルに存在するかどうかを調べるために用意されています。のグループの差が存在する場合走行距離、問題に対する一つの可能​​なアプローチは、距離を考慮することであるベースラインの活動などの訓練の最初の2分の間に旅して、抑圧比（テスト中抑圧比は=（活性）/（中にベースライン+活動中のアクティビティを使用する恐怖17,40の二次インデックスとテスト））。最後に、電気フットショックに対する反応性の変化を誘発する疼痛感受性の差は、もしあれば、凍結挙動の変動をもたらし得る。 ImageFZも距離がフットショック感受性の指標として使用することができる、（6秒）の暴露後に2秒2秒のフットショックの露光前に2秒から詳細に（CM）を旅し計算します。 ビデオ分析システムは、ブラックアグーチアルビノの凍結挙動を測定し、茶色のマウスを希釈するために開発されてきた。 ImageFZ（ 図1B参照 ）白いマウスを調べるために黒い床トレイと黒のグリッドを使用しています。ブラックグリッドは仕様で作られている<html>味方コーティングされた黒色塗料を、金属を加工し、典型的には、黒色マウスに使用される非被覆の金属グリッドと同様の導電性を有している。 ImageFZは、プログラム·パラメータの調整を経てラットおよび他のげっ歯類での凍結挙動を解析します。 ImageFZの現在のバージョンでは、被験者の挙動を分析するために凍結上壁からビデオカメラを用いて記録される。 ImageFZはまた、画像が室側から捕捉されるセットアップに用いることができる。また、ImageFZは4機器の最大値を制御します。この機能は、時間を節約し、各被験者の実行時間と動作上のテスト順の違いによる潜在的な影響を低減する、研究者は、同時に4匹のマウスを調べることができます。このように、ImageFZは試験手順と凍結挙動の分析を簡素化しており、このプログラムは、より少ない労力で、行動実験のための任意の訓練なしでテストを容易にします。 宮川ラボにおいてe_content &quot;&gt;、我々は、学習及び記憶上の所定の遺伝子の影響を解明するために、ビデオ解析システムを用いて、文脈と頭出し恐怖条件付け試験における遺伝子改変マウスおよび野生型対照マウスの110以上の株を評価している41-42我々は5,000人以上のマウスの生データの大規模なセットを取得している公開された研究論文4-16のために使用された生データを公開データベース（URLとして「マウス表現型データベース」に含まれています：HTTP： / / www.mouse-phenotype.org/）本映画の記事では、我々の実験手順の詳細についての詳細な情報を提供し、テストの状況の理解を促進する。

文脈的恐怖条件付け試験をきっかけに、げっ歯類1-3の連想恐怖学習と記憶を評価するために用いた行動パラダイムである。この試験は、広く、トランスジェニックおよびノックアウトマウス1,4-16における恐怖学習および記憶の神経生物学的メカニズムを理解するために使用されている。呼吸を除いて完全に不動のように定義されている動作を、凍結、恐ろしい状況に共通する反応である。この行動のパラダイムでは、動物は、電気フットショックと聴覚信号のペアリングにさらされた後、彼らは連想恐怖学習と記憶の指標として測定される凍結挙動を表示することによって、恐怖生産的刺激に応答します。このテストはあまり精巧機器、研究者が少ない身体運動、その他の学習と記憶タスクよりマウスについてのはるかに少ないトレーニング時間を必要とし、それは一般的に2日間、マウスあたり約5〜10分/日が必要です。試験手順は、Siではあるがmpleとすると、実行するには少し時間が必要で、研究者は慎重に観察し、マウスの動作を測定する必要があるため、いくつかの自動化された測定システムは、行動分析17〜20を実施するために開発されている。我々はImageFZソフトウェアプログラムで開発された我々のビデオ分析システムは、私たちが容易に凍結挙動を分析し、信頼性の高い結果を生成することを可能にする。この記事では、我々のテスト手順に関する詳細な情報を提供し、ImageFZソフトウェアプログラムを使用する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>ImageFZプログラム</td><td>開発元:宮川</td><td></td>剛 <td>このプログラムは、O'Hara & Co., Tokyo, Japanから入手でき、http://www.mouse-phenotype.org/ から無料でダウンロードできます。このソフトウェアは、32ビットのWindows XP / Vista / 7で動作します。&nbsp;</td></tr><tr><td>コンディショニング</td><td>チャンバーO'原 &(株)、日本</td><td>CL-3002L</td><td>マウス用。</td></tr><tr><td>キュー付きテストチャンバー</td><td>O'原 &(株)、日本</td><td>CLT-3002L</td><td>マウス用。</td></tr><tr><td>インターフェース</td><td>原 &株式会社、日本</td><td>CL-1040</td><td>インターフェースには、ImageFZプログラムで制御できるホワイトノイズ/トーンジェネレーターが含まれています。</td></tr><tr><td>スクランブルショックジェネレーター</td><td>O'原 &株式会社、日本</td><td>SGA-2040</td>ショック<td>ジェネレーターはImageFZプログラムで制御できます。</td></tr><tr><td>ショックグリッドテスター(電流計)</td><td>O'原 &(株)日本</td><td>SG-T</td><td></td></tr><tr><td>USBビデオキャプチャデバイス</td><td>XLR8</td><td>USB2IVOSX</td><td></td></tr><tr><td>クアッドイメージスプリッター</td><td>(株)ワイヤレス塚本(株)</td><td>400AS</td><td></td></tr><tr><td>防音室</td><td>原 &株式会社</td><td>CL-4210</td><td></td></tr><tr><td>フリーズモニター</td><td>San Diego Instruments, Inc., CA, USA</td><td></td><td>16 x 16 photbeam array&nbsp;(2.5cm間隔)</td></tr></tbody></table>

マウスにおけるビデオ解析システムを用いた文脈と手掛り恐怖条件付け試験

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

文脈や手がかり恐怖条件付け試験は、環境手がかりと嫌悪の経験との間の関連性を学び、覚えてマウスの能​​力を評価する行動試験の一つです。この試験では、マウスは、コンディショニングチャンバ内に配置され、馴化刺激（聴覚信号）と嫌悪無条件刺激（電気フットショック）のくずを与えられている。遅延時間後、マウスを同じ調整チャンバと、聴覚信号の提示を有する異なる形状のチャンバに露出している。試験中にすくみ行動は、恐怖記憶の指標として測定される。自動的に動作を分析するために、我々はhttp://www.mouse-phenotype.org/から無料でダウンロードできますImageFZアプリケーションソフトウェアプログラムを使用してビデオ解析システムを開発した。ここでは、我々のプロトコルの詳細を示すために、我々は文脈のための私たちの手順を示し、ImageFZのシステム経験を使用してC57BL/6Jマウスで恐怖条件付け試験を頭出しEM。加えて、我々は我々のプロトコルとImageFZシステムや人間の観察者によってスコアものとフォトビームベースのコンピュータ測定システムで測定された凍結時間を比較することにより、ビデオ分析システムの性能を検証しました。我々の代表的な結果に示されるように、ImageFZによって得られたデータはImageFZシステムを用いて行動解析は非常に信頼性があることを示す、人間の観察者によって分析されたものと同様であった。現在の映画の記事は、テスト手順についての詳細な情報を提供し、実験的な状況への理解を推進していきます。

恐怖条件付け試験で、人間の実験者は、労働集約型の直接観察26から29を通して凍結挙動を定量化するために使用されるが、最近ではフォトビームベースのコンピュータ計測（ 例えばフリーズモニター」システム）と画像解析システムが自動的に使用されてきたすくみ行動26,30-32を測定します。 ImageFZは、後述するように、人間の観察によって得られるものに匹敵する結果を生成し、自動画像解析システムである。ここでは、様々なパラメータの下でImageFZ分析の結果と人間の観察の結果を比較した。 &#39;レート（フレーム/秒）」と「（ピクセル）を基準に凍結。&#39;この実験では、5雄のC57BL/6Jマウス（SD（G±平均体重）、31.4±3.55は、SD（ピクセル）、351.6±62.2±ボディサイズを意味する）は、生後15-27週で使用した。人間の観察は、イベント記録プログラム（マッキントッシュOS9ソフトウェアプログラム）を用いて作製した;続けるキー押下イベントマウスが動かないの試合を表示2秒以上Dは「凍結」と考えられていた。凍結の割合を各試験において60秒ごとに計算し、相関分析のために使用した。 2オブザーバーによってスコア凍結の割合（空調用者間の信頼性、R = 0.879、コンテキスト·テスト、R = 0.957のため、頭出しのテストのために、R = 0.866、すべてのケースのために、R = 0.888）は、ヒトを生成するために平均化したスコア。凍結各フレームレート（ すなわち、1、2、および4のfps）でImageFZを通して測定百分率およびヒト観測で得られたものとの間の相関関係を調べた。 図4に示すように、ImageFZ（1,2、および4のfps）によって算出凍結百分率は非常2の観察者の測定から得られる平均値と相関していた。注目すべきは、より高いフレームレートで画像をキャプチャすると、常に最良の相関を生成しません。 1 fpsでの画像解析には、電子で、人間の観察者から得られた結果と同様の結果を生成したACHテスト。人間の観察により測定し、「凍結基準（ピクセル）」の各条件を用いて凍結ImageFZパーセンテージ（ すなわち 20、30、及び40画素）との相関を調べた。凍結百分率は20、30 &#39;の凍結基準（ピクセル）&#39;でImageFZを用いて計算し、40ピクセルは、全ての場合において、高度に人間の観察（ 図5）を介して得られたものと相関していた。 図5Dに示すように、凍結基準が低い値に設定されている場合、人間の観察者によって「凍結」されると考えマウスの微妙な動きは、「未凍結&#39;ImageFZを用いて考えられるであろう。基準が高い値に設定されている場合、逆に、マウスの動きは、人間の観察者により「不凍」としてスコア、ImageFZ（ 図5C、5F、および5I）を用い&#39;凍結&#39;とみなされる。このように、最も信頼性の高い結果を得るために、ImageFZプログラムの各パラメータは私達に較正されるべきである各テスト環境で人間の観察を通して獲得したデータをING。 加えて、我々はImageFZ（ 図6参照 ）を用いて得られたものと、フォトビーム·ベースのコンピュータ·測定システム（フリーズモニターシステム）を用いて、人間の観察者によって生成された結果を比較した。人間の観察、処置群とImageFZスコアリングの結果を知らされた。フリーズ監視システムのパラメータ設定のために、我々は以前に検証済みシステム30から冷凍の割合の3尺度を使用していました。簡単に説明すると、10秒間隔の数とは、動物が各5秒間隔の開始との間に（それぞれ1秒の10秒と2秒の10秒）間隔および待ち時間の最初の新しいビームを交差させる以上の1または2秒を必要とし、この区間（Latency3）内の第3の新たなビームの中断を測定した。マウスは、凍結された時の間隔のパーセンテージまたは時間rの合計量の割合第三のフォトビームを計算した破るequired。 各システムで測定された凍結のパーセンテージは、図6に示されている。基は、t検定、続いて二方向反復測定ANOVA（ 表1を参照）を用いて比較した。 ImageFZ（ 図6B）を用いて測定凍結百分率は、フォトビーム·ベースのシステム（ 図6C-E）を使用して得られたデータよりもヒトの観察（ 図6A）を介して獲得したものと、より類似していた。凍結パーセンテージの間の相関を測定し、一方、各試験においてImageFZプログラムを用いて測定された冷凍パーセンテージは非常に人間の観察（手がかり試験であり、r = 0.934;、コンテキスト試験であり、r = 0.970コンディショニングあり、r = 0.947）を介して獲得したものと相関していたフォトビームベースのコンピュータ測定システム（1秒の10秒、2秒の10秒、またはLatency3）を使用し、人間の観察者は、コンディショニング、R = 0.503、0.593、および0.761（低かった。コンテキストTImageFZおよびヒトの観察（ 図7Aおよび7B）を用いて測定し、凍結パーセンテージの間の相関に比べエストあり、r = 0.772、0.819、および0.912）。また、 図7は、人間の観測で得られた各マウスにImageFZを使用して凍結割合の違いは、最小の違いだったことが明らかになった。これらの結果は、凍結の量を測定する際ImageFZを用いて測定冷凍パーセンテージは非常に正確であり、人間の観察とそのImageFZにより得られたものと同様であったことを示した。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1.jpg" /> 図1。文脈的恐怖条件付け試験を頭出しするための装置。（A）、エアコン、コンテキストのテストのためのアクリルの正方形チャンバー、（ <strオング&gt; B）白いマウス（下）のための黒いプラスチック製の床に、黒アグーチ、あるいは希薄な茶色のマウス（上）と帯電性黒色金属グリッドの白いプラスチックの床の上に金属グリッドは、グリッドの拡大画像が右側に表示されますパネル（C）ホワイトノイズ/音源とショックジェネレータ、（D）防音室、（E）の頭出し試験のための平らな床を有するアクリル三角室。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2.jpg" /> 図2。プロトコルの概略図。文脈の（A）の概要と恐怖条件付け試験を手がかり、（B）の調節、（C）はContextテスト、および（D）は 、テストを頭出し。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3.jpg" /> 図3。 ImageFZソフトウェアプログラムによる画像解析。連続する画像の各ペアについて、マウスを移動する面積（画素）の量はImageFZによって計算される。この領域が特定の閾値（ 例えば 30画素）未満であると、動作が「凍結」していると判断される。面積の大きさに等しいか、しきい値を超えた場合、動作は「凍結のないこと」であると考えられている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。人間の観察により測定されたものでImageFZを使用して、異なるフレームレートで画像から算出された凍結パーセンテージの比較。恐怖条件付け試験は、雄のC57BL/6Jマウス（n = 5）を用いて行った。テストの間に、二人の観察者は、凍結挙動を記録した。同時に、ライブ画像はImageFZプログラムを用いて4 fpsで捕捉した。 4 fpsでキャプチャしたファイルは、1 FPSや2 fpsで撮影された画像に対応するフレームを抽出した後に小型化された。 「レート（フレーム/秒）」のパラメータ値は、1,2、または4 fpsに設定し、各60秒ビン内の凍結百分率はImageFZオフライン分析を用いて画像ファイルから計算した。各ドットは、それぞれ60秒ビンの凍結割合を表します。人間の観察とImageFZ分析から得られたデータとの間のピアソンの相関係数を算出した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" width="500" /> 図5。 ImageFZおよびヒト観測で測定されたものを使用して、異なる凍結基準値で画像から算出した凍結百分率は、恐怖条件付け試験を雄C57BL/6Jマウス（n = 5）を用いて行った。比較した 。テストの間に、二人の観察者は、凍結挙動を記録し、ライブ画像がImageFZプログラムを使用して撮影した。各60秒のビンにおける冷凍パーセンテージは、20、30、または40ピクセルに「凍結基準（ピクセル）」のパラメータ値の設定、ImageFZオフライン分析を通して画像（1フレーム/秒）から計算した。各ドットは、それぞれ60秒ビンの凍結割合を表します。ピアソンの相関係数人間観察とImageFZ分析から得られたデータとの間efficients各試験で計算した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6.jpg" /> 図6。凍結のパーセンテージは、雄のC57BL/6Jマウスの無条件馴化群（n = 5、各基）で自動化されたシステム及びヒト観察を用いて測定した 。 （A）ヒトの観察、（B）ImageFZ、（C）監視システム1（1秒と10秒）を凍結、（D）は、モニタ装置2（2秒と10秒）、および（E）凍結監視システム3（Latency3）をフリーズ。グループ比較はt検定（続く双方向反復測定分散分析を用いて行った異様なnditioned基対馴化基、*、P &lt;0.05、†はp &lt;0.01）。 ImageFZを使用して得られたデータは、ヒト観察を通して獲得したものと類似していた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図7" fo:content-width="4.3in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" width="420" /> 図7。相関凍結百分率自動化されたシステム及びヒト観察により得点との間の自動化されたシステム及びヒト観察を使用して測定冷凍パーセント、（AB）散布図およびピアソンの相関係数の差の度数分布が示されている。 ImageFZを使用して計算凍結パーセンテージは、高度に人間の観察を通して得られたものと相関していた。 10％DIF未満（CF）。出現データは、人間の観察を通して分析されたものと比較したImageFZを使用して分析した場合に自動化されたシステム対人間の観察から得られた凍結割合間ferenceが最も高かった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td>分散分析</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>条件</td><td>時間</td><td>条件×時間</td></tr><tr><td> 1日目（コンディショニング） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人間</td><td> F（1,8）= 28.53、P = 0.0007 </td><td> F（7,56）= 20.79、P &lt;0.0001 </td><td> F（7,56）= 16.58、p &lt;0.0001 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F（1,8）= 13.97、P = 0.0057 </td><td> F（7,56）= 21.40、P &lt;0.0001 </td><td> F（7,56）= 11.69、p &lt;0.0001 </td></tr><tr><td>フリーズモニター（1sec10sec） </td><td> F（1,8）= 5.16、P = 0.0528 </td><td> F（7,56）= 2.39、P = 0.0329 </td><td> F（7,56）= 0.72、P = 0.6572 </td></tr><tr><td>フリーズモニター（2sec10sec） </td><td> F（1,8）= 4.07、P = 0.0782 </td><td> F（7,56）= 3.44、P = 0.0039 </td><td> F（7,56）= 1.52、P = 0.1803 </td></tr><tr><td>フリーズモニター（Latency3） </td><td> F（1,8）= 4.44、P = 0.0682 </td><td> F（7,56）= 9.94、p &lt;0.0001 </td><td> F（7,56）= 4.33、P = 0.0007 </td></tr><tr><td> 2日目（コンテキスト） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人間</td><td> F（1,8）= 42.94、P = 0.0002 </td><td> F（4,32）= 1.91、P = 0.1336 </td><td> F（4,32）= 1.48、P = 0.2302 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F（1,8）= 49.61、P = 0.0001 </td><td> F（4,32）= 2.06、P = 0.1087 </td><td> F（4,32）= 0.83、P = 0.5174 </td></tr><tr><td>フリーズモニター（1sec10sec） </td><td> F（1,8）= 20.28、P = 0.002 </td><td> F（4,32）= 1.63、P = 0.1918 </td><td> F（4,32）= 0.55、P = 0.6997 </td></tr><tr><td>フリーズモニター（2sec10sec） </td><td>F（1,8）= 40.20、P = 0.0002 </td><td> F（4,32）= 2.66、P = 0.0504 </td><td> F（4,32）= 1.20、P = 0.3306 </td></tr><tr><td>フリーズモニター（Latency3） </td><td> F（1,8）= 35.30、P = 0.0003 </td><td> F（4,32）= 2.49、P = 0.0626 </td><td> F（4,32）= 1.09、P = 0.3793 </td></tr></tbody></table> 表1。統計の比較。

この記事では、コンテキストのためのプロトコルを提示したマウスで恐怖学習と記憶を評価するために、ビデオ分析システムを使用して、恐怖条件付け試験に頭出し。

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

文脈依存型および急性恐怖条件付けテストは、ローレンスの学習能力を評価するために広く使用されている行動テストです。攻撃的な体験と環境の手がかりとの関連を覚えておいてください。ただし、このテストでは、職場間にいくつかの方法論的な違いがあり、データの比較や結果の複製が困難になる可能性があります。より安定したデータを得るためには、テストプロトコルを可能な限り標準化することが重要です。ここでは、フィールドテストのプロトコルを示します。恐怖機能テストは、記憶を評価するためのシンプルで感度が高く、信頼性の高いテストです。この検査は、神経や分子のメカニズム、学習や記憶の根底にあるものを理解するためによく使用され、ストレス後障害や統合失調症などの精神疾患のモデルとなる可能性のあるマウスの認知機能を評価するためにも使用されます。このテストでは、人間の観察者化によって学習や記憶の指標として測定される対面行動、使用行動を自動的に分析する自動化システムもありました。画像FGと画像Aベースのソフトウェアプログラムを用いた画像解析システムを開発しています。このようなソフトウェアプログラムを配布しており、このアドレスから無料でダウンロードできます。ここでは、当社の試験プロトコルと自動分析システムについてご紹介します。まず、ソフトウェアプログラムのイメージとして、アプリの操作者をどのように安全に保つかを示します。次に、コンディショニングコンテキストテストやシステムを使用するデバイスのQテストなど、テストの詳細なプロトコルを示します。最後に、N image FDシステムが信頼性の高い結果を生み出すことができることを示す現在の結果を示します。それでは始めましょう。恐怖条件付けテストを速く始めます。マウスは、グレードの床のあるチャンバーに入れられます。OIDは監査人として提示されます。監査人は 30 秒間キューに入れられます。その後、電気コードショックが提供されます。この 1 つの監査キューとフットショックの組み合わせは、監査キューと電気コードショックとの関連付けを強化するために 3 回与えられます。テスト中、フリーズ動作は、関連する学習と不公平な記憶の指標として測定されます。次に、24時間後、マウスを同じコンディショニングチャンバーに入れ、フリー行動についてスコアを付けます。文脈的に制御された恐怖を測定するために、マウスは聴覚キューなしで異なる形状のGに転送され、その後、聴覚キューが提示されます。このテストでは、凍結行動を急性恐怖記憶の指標として使用します。テスト中、マウスの動作はコンピューターに接続されたカメラを通じて記録されます。動作は、フリーズまたは非フリーズとして判断されます。画像ソフトウェアプログラムにより、プログラムは凍結時間と距離のトラフィックの割合を計算できます。この例では、テスト中に画像解析を実演します。ライブ画像は、1 秒あたり 1 回の長さでキャプチャされます。のイメージは、各ペアの各ライブイメージからバイナリイメージを作成します。炎が連続して発生すると、マウスが移動した面積はプログラムの画像によって計算されます。その領域が特定の閾値を下回ると、その行動はフリーズと判断され、これは一般的に、呼吸以外の動きが全くなく、打ち負かすのが難しいと定義されます。定義された時間しきい値よりも短いフリーズ動作は、フリーズとは判断されません。しきい値は、画像 Z で測定された凍結時間と人間の観測値との間に最適に適合するように、事前に設定する必要があります。面積がしきい値または X 3 Z に等しい場合、その動作は非凍結と見なされます。ここでは、このビデオ分析システムを使用したマウスでの試験プロトコルを示します。このプロトコルでは、オペレーターは、金属グリッドを備えたグリッド正方形のチャンバーで建設的であり、透明なリード画像で覆われていません。FDは、キャプチャされた各ビデオ画像の暗い被写体と白い背景を区別できます。しかし、このプロセスにより、黒、善良、または直接の黒マウスの行動を分析するために、チャンバーを白い床に置く必要がある被験者の凍結行動を分析できます。アルミニウムマウスの凍結挙動は、ブラックメタルグリッドを使用して画像Dによっても分析できますブラックルールの下で、発光ダイオードライトが装置の上の帆に取り付けられています。グリッドルールは、100の屋根でLEDライトによって照らされます。ホワイトノイズトーンジェネレーターに接続されたスピーカーは、フタの上の帆に取り付けられています。55 ホワイト ノイズは、聴覚キューとして表示されます。グリッドは、電気的な食品ショックを提供するためにショックジェネレーターに配線されています。衝撃風試験は、試験開始前に30万ペアに設定されています。グリッド上の電流強度は、マウスのfeと尿の蓄積によって衝撃試験が減少する可能性があるため、金属でチェックする必要があります。テストチャンバーは、外部ノイズを最小限に抑えるために防音織機に配置されています。テスト中、アペレートは、コーニングテストとコンテキストテストが実行される音とは異なる音に配置されます。これは、コーニングチャンバーとは異なる特性を持つチャンバーで構成されています。通常のコンテキストを提供すると、マウスがノーベルコンテキストをコンティングチャンバーとは無関係であると認識するように、感覚コードを可能な限り変更する必要があります。このプロトコルでは、装置は、フラットなアクリルールと透明なリードを備えたアクリ三角形のチャンバーです。スピーカーは、リード線の上の帆に取り付けられており、または3つのキューでプレゼンテーションを行います。このキューは、ホーイング時にマウスに提供されたものと同じキューです。床の照明レベルは、見た目を勉強するように設定されています。各チャンバーは、帆が取り付けられたチャージキャブ、マウスの行動を監視するためのデバイスカメラを備えた立方体です。各テストが始まる前に、アクリルの壁と床を舌で拭き、超高グロス水で拭き取り、グリッドを70%エタノールで洗浄します。嗅覚カットに基づくバイアスを防ぐために、グリッドは、グリッドが最後の2〜4匹のマウスのために電気伝導率を推測しないことを負傷させるために、超誇大広告の総水の代わりにイーサンで拭かれます、行動上のケージ輸送の可能な増加を減らし、マウスを実験環境に適応させるために、温度制御された保持室のハウスパッケージ。マウスを入れたケージは、各テストが始まる少なくとも30分前に防音待合室に移しました。すべての実験は、異なる時間にテストすることによって生じる可能性のある動作の変動を最小限に抑えるために、同じ期間中に実行する必要があります。各グループのマウスは、実験時間の潜在的な影響を減らすために、カウンターバランスでテストする必要があります。被験者の行動性能に関するテスト順序の下で、画像Dは、マウスから同時にテストする最大4つの装置を制御することができ、研究者はマウスの行動に対する実験手順の潜在的な影響の時間とデジタルを推論する。続行セッションを開始する前に、A FDアプリケーションソフトウェアを実行します。プラグメニューFD関連とFDオンラインを選択し、次のようにステップでパラメータ値を設定します。ステップ1では、プロジェクトの日付を保存するフォルダのプロジェクトIDを指定します。ステップ2、セッション名タイプ。セッションボックス内の任意の単語は、実験日と、ホワイトノイズとフードショックの開始時間と持続時間が参照ボックスに書き込まれているファイルへの参照テキストです。ファイルへの敬意テキストは、あらかじめ画像内の敬意フォルダ、フォルダに用意しておく必要があります。ステップ3のパラメータ設定。ムービーに示されている期間、時間、凍結条件などのパラメータ値を入力します。ステップ 4、subject id。subject ID を入力します。ステップ5、カメラの設定は、キャプチャした画像の明るさとコントラストを対比します。ステップ6、しきい値設定。最初に連続する画像からの距離移動を測定するには、画像を黒い粒子と白い背景に分割するように設定されているプログラムのしきい値のメイン値を調整します。移動距離は、連続する画像内の粒子との重心の XY 座標を持つ各セット間から計算されます。連続した画像からの動作については、背景の下で画像を黒い粒子にセグメント化するように設定されているプログラムのx余分な値を仮定し、その後、連続した画像の取り込みウィンドウのペアの非重なり合う領域が示されている粒子間の非重なり領域の量を計算します。変更明示は、マウスが動作を示すときに、領域の値の量がINGの叫び声の値を下回る必要があることを意味します。これらの値は、画像疲労によるデータが人間自身によるその分隊と一致するように調整する必要があります。ステップ7は、フィールドをキャッチするように設定し、フィールドを指定し、ツールボックスの長方形ボタンをクリックしてその床の周りを長方形にした後にキャプチャするチャンバーを指定します。ライブイメージウィンドウ上のチャンバー。次にチャンバー小説を選択し、設定ボタンをクリックして、最後に完了ボタンをクリックします。パラメータ設定が定義された後、準備テストは、画像分析システムとどのようなノイズショックジェネレータがその問題で動作するかを決定するために、日付の最初のテストの前に練習用マウスを使用して行うべきであり、櫛ケージは、待機中の暗闇に隣接して音のテストの暗闇に練習用マウスを含み、各マウスをチャンバーに配置した直後にコンディショニングチャンバーに配置する必要があります。 Zの画像の開始下部をクリックします。マウスは120秒間チャンバーを完全に探索できます。以後。聴覚キューとしてのホワイトノイズが30秒間提示され、音の最後の2秒間で、マウスに食べ物のショックが与えられます。この手順は、キューとフードショックとの関連を強化するために、セッションで3回繰り返されます。マスクは、最後のペアリングから90秒間チャンバーに放置されます。チャンバーのコンテキストと受動的な経験との間の関連性をさらに確立すること。480秒がエロップした後、マウスはホームケージに戻され、ケージは保持室の棚に戻されます。各テストの後、チャンバーとグリッドを慎重に清掃します。次に、次の分析ボタンをクリックして、テストマウスでセッションを繰り返します。懸念される移動から約24時間後、ケージは防音の待合織機室にマウスに続きます。ホールディングは、各テストが始まる少なくとも30分前に迫ります。の長い画像と、コンディショニングと同じ方法でソフトウェアのパラメータ値を設定します。ただし、継続時間を最大 300 秒に設定し、コンテキスト テスト用にファイルする 35 のテキストを選択します。ファイルへの 35 テキストが空白です。マウスをコンディショニングチャンバーに置き、開始下部をクリックします。マウスは、刺激の提示なしに300秒間チャンバーを完全に探索することができます。300秒後、マウスを自宅のケージに入れ、チャンバーを清掃します。次に、次の解析の下部をクリックし、Dの長い画像でテストマウスの手順を繰り返し、このテストのファイルに対して継続するが参照テキストと同じ方法でパラメータ値を設定し、最大360秒の持続時間を設定します。これは、このテスト用にファイルする参照テキストです。各マウスを三角形のチャンバーに入れ、画像Zのスタートボタンをクリックします。ホワイトノイズも足のショックもありません。このチャンバーには、新しいコンテキストを提供し、継続チャンバーに関連するさまざまなプロパティがあります。このチャンバーでは、通常、動き回る必要があり、動作を示さないでください。最初の3分間の終わりに、Conchoで提示されるホワイトノイズがマウスに3分間提供されます。オーディターのプレゼンテーション中に、オーディターキューマウスは、360秒後に書かれた行動を示したり、噴出している、マウスを自宅のケージに戻して、ケージをホールディングルームの棚に戻します。テスト後、チャンバーを慎重に清掃します。次に、次の分析下部をクリックし、テストマウスを使用して手順を繰り返します。このビデオは、システムの画像によって分析された凍結の経過が、人間の観察者によって測定された思考とより密接に関連しているように見えることを示しています。この観察結果は、各テストで画像物理によって測定されたリースの割合が、人間の観察者によって高い相関性または思考スコアであったことを示す詳細によって確認されました。さらに、この図は、人間の観測によって測定された凍結率と、その画像内のシステムの画像との間の差が最も小さかったことを示しています。これらの結果から、システムの画像で測定した凍結率は、人間の観察で測定したものと同程度であり、画像Zによる理由量の測定精度が高いことが示されました。大丈夫です。いかがでしたか?ご覧の通り、標準的な行動分析は簡単に行うことができます。システムのイメージを使う上でのコツや重要なポイントがいくつかあるので、それについてikaさんに聞いてみよう。大丈夫です。まず、システムのイメージのテスト手順についてどのように感じましたか?私たちのテスト手順は非常にシンプルで、システムのイメージは、理由、行動を正確かつ迅速に測定するための便利なツールだと思います。誰でも簡単にソフトウェアプログラムを使用することができます その結果、このシステムは短時間で何ヶ月も彼らの記憶を評価するために使用することができます、それは私たちの時間を節約し、後で。なるほど。では、テストを行う際に注意すべきことはありますか?はい、オペレーターが述べているのは、動作を正確に測定するために最も鮮明な画像を取得することが重要であるため、カメラの長さと書き込み物を調整する必要があります。また、プログラム研究では、その行動が理性として認定されるかどうかを判断するために、性的価値や理性基準を慎重に設定する必要があります。結果が即時に現れたことが重要であり、現在の結果に示されているように、人間の観察によってそれらを考えながらプログラムを行います。大丈夫です。ご覧のとおり、これは記事であり、テスト手順とソフトウェアプログラムの使用に関する詳細情報を提供します。これが記事になることを願っています。試験への理解を促進し、プロトコルの標準化に貢献します。

contextual-cued-fear-conditioning-test-using-video-analyzing-system

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

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マウスにおける恐怖条件付けをトレース

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マウスの飛翔行動を誘導するための修正された恐怖条件付け

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脅威の確率タスクを使用すると、不確実かつ特定の脅威の間に不安と恐怖を評価するために

この記事は、社会的報酬のためのオペラント条件付けを使用して、マウスの社会的動機を定量的に測定するための新しいプロトコルについて説明しています。このプロトコルは、自閉症やその他の社会的行動障害のマウスモデルにおける社会的動機の測定に役立ちます。...

オペラント条件付けを使用したマウスにおける社会的モチベーションを定量化します

マウスの超音波発声(USV)は、年齢、性別、状態、遺伝的背景によって異なります。この2つの選択式試験では、異なる場所で同時に放送する2つの超音波エミッターを使用して、USVの異なる特性に対するマウスの認識と選好反応を評価できます。...

二つの選択肢の再生テストを使用して、マウスにおける超音波発声の設定を決定します

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ヘッド固定マウスのヒゲ合図瞬目古典的条件

学ぶマウスの文脈・手掛け恐怖条件付け試験の標準化プロトコル。映像解析システムを用いて凍結行動を自動計測し、学習・記憶機構の神経科学研究における信頼性の高いデータ収集を実現する。

マウスにおけるビデオ解析システムを用いた文脈と手掛り恐怖条件付け試験

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