表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア

この手順の目的は、表面開始アセンブリを用いて、単一または複数の細胞外マトリックス protein から自立したナノファイバー、ナノ構造、および 2D マトリックスを構築することである。まず、PDMS プレポリマーを地形的にパターン化されたマスターモールドに流し込み、硬化させることで、ポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプを準備する。次に、硬化させた PDMS スタンプを切り出し、目的の細胞外マトリックス protein を含む溶液でコーティングする。

次に、スタンプを洗浄・乾燥させ、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（pNIPAM）でコーティングされたガラスカバースリップにマイクロコンタクトプリントします。最後のステップとして、40 °Cの温かい脱イオン水でカバースリップを水和させ、溶液を徐々に冷却します。温度が約32 °C以下になると、熱感応性のpNIPAM層が溶解し、アセンブルされたタンパク質ナノファイバーまたはナノ構造が放出されます。

最終的に、組み立てられたナノファイバーおよびナノ構造は、位相差顕微鏡または蛍光顕微鏡で確認した通り、溶液中で自立した状態で存在し、組織工学用スキャフォールドなどのさらなるアプリケーションに利用できます。相分離法やエレクトロスピン法といった既存の手法に対する本手法の主な利点は、細胞がin vivoで通常ECMファイバーを構築する方法を真に模倣した手法を用いて、ECMタンパク質ナノファイバーを設計できることです。表面開始アセンブリ技術には、タンパク質組成、ファイバー形態、およびスキャフォールド構造を制御できる能力など、多くの独自の利点があります。

さらに、他の手法では困難であったフィブロネクチンやIV型コラーゲンなどの細胞外マトリックス蛋白質から、ECM蛋白質ナノファイバーを構築することが可能です。この手法を用いることで、接着や分化といった多様な細胞挙動を制御するための、具体的かつ明確に定義された物理的・化学的な手がかりを持つ構造体を開発でき、組織工学分野における重要な課題の解決に寄与します。この技術に初めて取り組む場合は、ステムの品質およびマイクロコンタクトプリントパターンの再現性を継続的に確認することを忘れないでください。

これは、ECMナノファイバーおよびナノ構造を適切に構築するために不可欠です。この手順を開始するには、エラストマーベースと硬化剤を10:1の重量比で混合して、ポリジメチルシロキサン（PDMS）プレポリマーを準備します。通常、マスターモールドを1 cmの厚さで覆うのに十分なPDMSを確保するため、ベース80 gと硬化剤8 gを使用します。遠心ミキサーを用い、2000 RPMで2分間の混合および脱気（DGAs）を行い、その後さらに2000 RPMで2分間の脱気を行います。十分な量を注いでください。

マスターモールドの上にPDMS前駆体を流し込み、1 cmの厚さの層を形成します。その後、65 °Cで4時間加熱してPDMSを硬化させます。硬化した後、メスを用いてパターンを含む領域を切り出し、PDMSスタンプを作成します。これにより、PDMSスタンプの機能面と背面を区別します。

スタンプの裏面の角の一つを切り欠きます。まず、直径25 mmのガラスカバーガラスを洗浄します。カバーガラスを95% ethanolで1時間超音波洗浄し、その後65 °Cのオーブンで乾燥させます。次に、poly and isopropyl acrylamide（piam）溶液を調製します。piamを1-butanolに10%の濃度で溶解させます。洗浄済みのガラスカバーガラスをスピンコーターの真空チャックの中央に配置し、200 µLのpiam溶液をガラス表面にピペットで滴下して、表面全体を覆います。

カバースリップを6,000 RPMで1分間スピンコートします。PDMSスタンプを50%エタノール中で30分間ソニケーションして洗浄し、その後、窒素気流で乾燥させます。細胞を用いて細胞外マトリックス（ECM）ナノ構造を利用するアプリケーションにおいて無菌状態を維持するため、以降のすべての手順はバイオセーフティキャビネット内で行ってください。マイクロコンタクトプリンティングの工程が、本手順において最も困難な部分です。

使用前に、PDMSスタンプに目に見える欠陥がないか検査することが重要です。また、調製から2週間以上経過したタンパク質溶液は使用しないでください。PIAMコーティングしたカバースリップを密閉したペトリ皿に入れ、UV照射で滅菌します。

バイオセーフティキャビネット内でUV照射を45分間行えば十分です。各PDMSスタンプのパターン面に、タンパク質溶液200 µLをコーティングします。ここでは、滅菌蒸留水で調製した濃度50 µg/mLのフィブロネクチン（FN）を使用します。

室温で1時間インキュベートした後、PDMSスタンプを蒸留水で洗浄して過剰なタンパク質を除去し、窒素気流下で十分に乾燥させます。パイプの早期溶解を防ぐため、水分を完全に除去することが重要です。カバーガラス上のPAMコーティングおよび不適切なタンパク質転移を防ぎます。

必要に応じて、PDMSスタンプのパターン面をpipe PAMコーティングしたカバーガラスに接触させ、マイクロコンタクトプリントを行います。ピンセットを用いてスタンプの背面を軽く叩き、気泡を取り除き、5分後に均一に接触していることを確認します。カバーガラスからPDMSスタンプを剥がします。

この段階で、研究内容に応じて、追加のECMタンパク質をパターニングし、より複雑な多成分構造を作成することができます。ECMパターンのプリントが完了したら、パターニングしたパイプPAMコーティングカバースリップを35 mmのペトリ皿に配置し、位相差顕微鏡を用いてパターンの再現性を確認します。

パターンの形状によっては、パターンの特徴を分解能高く観察するためにCCDカメラが必要な場合があります。また、ECMタンパク質が蛍光標識されていれば、蛍光顕微鏡を用いてパターンを検査することも可能です。パターンの忠実度を確認した後、ペトリ皿に40 °Cの蒸留水を3 mL加え、水によって徐々にパイプを溶解させます。

PAM層およびECMタンパク質パターンの放出は、位相差顕微鏡を用いて観察できます。通常、ECMタンパク質のナノ構造が放出されたことを確認するために、水をPAMの下限臨界溶液温度（32 °C）を十分に下回る室温まで冷却します。光学的な手法が利用できないアプリケーションの場合、溶液温度を測定することで放出をモニタリングすることが可能です。

パイプのPAM層が放出された後、ナノファイバーやその他のナノ構造体は水中に浮遊した状態になります。さらなる応用のために、これらのナノファブリックやナノ構造体を操作する必要がありますが、具体的な手法は実験目的によって異なります。ここでは、表面開始集積（SIA）によって、ファイバーの寸法を精密に制御したECMタンパク質ナノファイバーを構築できることを示す代表的な結果を提示します。

長さ 50 µm、幅 20 µm のフィブロネクチン長方形のアレイを、piam コーティングされたカバースリップ上にパターニングした。40 °C の DI water を加え、その後 piam の下限臨界溶液温度以下まで冷却したことで、piam の溶解とフィブロインナノファイバーの放出が誘発された。ファイバーは固有のプレストレスを受けていたため、放出後に収縮した。

PIAM表面上にパターン形成した際のフィブロネクチンナノファイバーの寸法の解析の結果、放出前は単分散であり、平均長は50.19 ± 0.49 µm、平均幅は19.98 ± 0.17 µmであった。放出後、ナノファイバーは著しく収縮したが、引き続き単分散であり、平均長は14.15 ± 0.92 µm、平均幅は2.65 ± 0.32 µmであった。原子間力顕微鏡により、SIA放出プロセスに伴うファイバーの寸法変化をより高解像度で観察することができた。

特筆すべき点として、放出前の繊維は約5 nmの均一な厚さを有していたのに対し、放出後の繊維は厚さが数百 nmのオーダーとなり、一方で長さと幅は減少していました。SIA法を用いることで、サイズ、形状、組成を調整可能な、多様なECMタンパク質ナノ構造を構築することが可能です。例えば、初期状態で幅20 µm、長さ1 cmのフィブロネクチンナノ繊維をパイプ上にパターニングしました。

冷却後、PAMコーティングされたカバーガラスとパイプを取り出します。PAMを溶解させると、ナノファイバーが放出され、幅約3 µmの細長い糸状の構造が形成されました。さらに、パターンはマイクロコンタクトプリンティングに使用したPDMSスタンプの表面トポグラフィーによって定義されるため、概念実証として複雑なECMタンパク質のナノ構造を設計することが可能です。

多腕のフィブロインスターを作製した。熱放出により腕の部分は収縮したが、腕が結合しているスターの中央領域は収縮しなかった。SIAはラミニンやLNなどの他のECMタンパク質でも機能し、複数のECMタンパク質を同一の構造に組み込むことができる。

この例では、2Dナノファブリックに組み込まれた、赤色で示される幅20 µmのフィブロネクチンの直交相互接続ラインと、緑色で示される幅50 µmのラミニンの直交相互接続ラインをパターニングしました。その後、リリースを行うと、両方のタイプのナノファイバーが収縮しましたが、全体的な相互接続性と正方格子構造は維持されました。これらの結果は、SIAを用いて、多様な組成と構造を持つECM材料を設計できることを示しています。最後に、ECMナノファイバーのSIAに失敗したいくつかの例を示します。

一つの原因は、ECMタンパク質のpiam表面への転写不良により、不完全なパターンが不適切にリリースされることです。マイクロコンタクトプリントにおいて、孔や不規則なエッジ、その他の欠陥が存在すると、リリース時に断裂や断片化が起こりやすい、不完全なナノファイバーやナノ構造が形成されます。また、pipe PAMの急速な溶解も、リリース後のパターンの忠実度の低下を招く原因となります。

例えば、下限臨界溶液温度よりも低い20 °Cの水を使用すると、PIAMが急速に膨潤および溶解します。これにより、32秒目の画像に示すようにナノファイバーが跳ね返って切断され、52秒目の画像に示すようなランダムで無秩序な構成が形成される可能性があります。

本手順を開始する前に、PDMSステムに欠陥がないかを確認し、すべての表面に埃が付着していないことを確認してください。そうしないと、適切なタンパク質転写が妨げられ、A CM構造の組み立て不良につながります。本手順に従って作製した放出ナノファイバーまたはナノ構造は、タンパク質ファイバーの機械的特性の解析や、組織工学用のスキャフォールドなど、さまざまな用途に使用できます。

このビデオを視聴することで、組成、形状、および構造を調整可能な細胞外マトリックス（ECM）タンパク質のナノファイバーおよびナノ構造を構築する方法について、十分に理解できるはずです。具体的には、ピトン（python）でコーティングされたガラスカバースリップ上にECMタンパク質のパターンをマイクロコンタクトプリントし、その後、熱的に表面の溶解を誘起してECM構造を構築する方法を習得します。