表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア

この手順の全体的な目標は、表面開始アセンブリを使用して、単一または複数の細胞外マトリックスタンパク質から自立型ナノファイバー、ナノ構造、および2Dマトリックスを設計することです。これは、まず、PDMSプレポリマーをトポグラフィーパターンのマスターモールドに流し込み、硬化させることにより、ポリジメチルソーンまたはPDMSスタンプを調製することによって達成されます。第2ステップは、硬化したPDMSスタンプを切り取り、目的の細胞外マトリックスタンパク質を含む溶液でコーティングすることです。

次に、スタンプを洗浄、乾燥させ、ポリNイソプロピルアクリルアミドまたはパイプPAMコーティングガラスカバースリップにマイクロコンタクト印刷します。最後のステップは、カバースリップを摂氏40度の温かい脱イオン水で水和させ、溶液の還元を徐々に冷却することです。摂氏約32度未満の温度は、熱感受性パイプPAM層の溶解を引き起こし、組み立てられたタンパク質ナノファイバーまたはナノ構造の放出を引き起こします。

最終的に、組み立てられたナノファイバーおよびナノ構造は、位相差顕微鏡および/または蛍光顕微鏡法によって確認されたように、溶液中で自立しており、組織工学の足場などのさらなる用途に使用することができます。この技術が面分離やエレクトロスピニングなどの既存の方法よりも優れている点は、細胞が生体内でECMファイバーを構築するのを通常模倣した技術を用いて、ECMタンパク質ナノファイバーを操作できることです。表面開始アセンブリ技術には、タンパク質組成、繊維形態、足場構造を制御する能力など、多くの独自の利点があります。

また、繊維ninラミネートやコラーゲン4型などの細胞外マトリックスタンパク質からECMタンパク質ナノファイバーを作製することも可能ですが、これは他の手法では困難であることが分かっています。この方法は、研究者が接着や分化などのさまざまな細胞挙動を指示するための具体的で明確に定義された物理的および化学的手がかりを持つコンストラクトを開発できるようにすることで、組織工学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法を初めて使用する場合は、ステムの品質だけでなく、マイクロコンタクト印刷パターンの忠実度も継続的に検査することを忘れないでください。

これは、ECMナノファイバーとナノ構造の適切な組み立てを得るために不可欠です。この手順を開始するには、エラストマーベースと硬化剤を10対1重量比で組み合わせることにより、ポリジメチルソーンまたはPDMSプレポリマーを準備し、通常は80グラムのベースと8グラムの硬化剤を使用して、マスターモールドを1センチメートルの厚さの層ミックスでカバーするのに十分なPDMSを確保し、次のミックスに設定された求心性ミキサーを使用してPDMSをDGAします。2000 RPM で 2 分間、DGA は 2000 RPM で 2 分間。十分にかわいそうに。

PDMSは、マスターモールドの上にプレポリマーをかけてここに厚さ1cmの層を形成し、PDMSを摂氏65度で4時間焼成します。硬化したら、メスを使用してパターンを含む領域を切り取り、PDMSスタンプを形成します。フィーチャー面とPDMSスタンプの裏面を区別するため。

スタンプの裏側の角の1つから切り取ります。この手順は、直径25ミリメートルのガラスカバースリップを洗浄することから始め、カバースリップを95%エタノールで1時間超音波処理し、次に摂氏65度のオーブンで乾燥させます。次に、ポリおよびイソプロピルアクリルアミドまたはピアム溶液を調製し、10%の濃度で1つのブタノールにピアムを溶解し、スピンコアの真空チャックにきれいなガラスカバースリップを中央に配置し、パイプパム溶液の200マイクロリットルをガラス表面にピペットで表面全体を覆います。

カバースリップを 6 、 000 RPM で 1 分間スピンコーティングします。50%エタノールで30分間超音波処理することによりPDMSスタンプを洗浄し、その後窒素乾燥の流れの下で乾燥させ、その後のすべてのステップをバイオセーフティキャビネットで実行して、細胞外マトリックスまたはECMナノ構造が細胞と共に使用されるアプリケーションの無菌性を維持する必要があります。マイクロコンタクト印刷ステップは、この手順の最も難しい側面です。

使用する前に、PDMSスタンプに目に見える欠陥がないか検査することが重要です。また、2週間以上経過したタンパク質溶液は使用しないでください。PIAMコーティングされたカバーは、閉じたペトリ皿の中に収まり、UV露光を使用して滅菌します。

バイオセーフティキャビネット内のUVライトの下で45分で十分です。各PDMSスタンプのパターン表面に200マイクロリットルのタンパク質溶液をコーティングします。フィブロネクチンまたはFNは、ここでは滅菌蒸留水に1ミリリットルあたり50マイクログラムの濃度で使用されます。

室温で1時間インキュベートし、1時間後にPDMSスタンプと蒸留水を洗浄して余分なタンパク質を除去し、窒素の流れの下で完全に乾燥させます。パイプの早期溶解を避けるために、水を完全に除去することが重要です。カバースリップのパムコーティングと不適切なタンパク質の移動。

必要に応じて、PDMSスタンプの特徴面をパイプPAMコーティングカバースリップに接触させてマイクロコンタクト印刷を行います。鉗子を使用してスタンプの裏側を軽くたたいて気泡を取り除き、5分後に均一に接触できるようにします。カバースリップからPDMSスタンプをはがします。

この段階では。研究によっては、追加のECMタンパク質をパターン化して、より複雑で多成分構造を作り出すことができます。ECMパターンが印刷されたら、パターン化されたパイプPAMコーティングされたカバースリップを35ミリメートルのペトリ皿に入れ、位相差顕微鏡を使用してパターンの忠実度を検査します。

パターンによっては、パターンの特徴を解決するためにCCDカメラが必要になる場合があります。蛍光顕微鏡は、ECMタンパク質が蛍光標識されている場合、パターンの検査にも使用できます。パターンの忠実度を確認した後、摂氏40度の蒸留水を3ミリリットルペトリ皿に加え、パイプの溶解を徐々に冷却します。

PAM層とECMタンパク質パターンの放出は、位相差顕微鏡を使用して監視できます。通常、ECMタンパク質ナノ構造が放出されたことを確認するために、水はパイプのより低い臨界溶液温度であるpam(摂氏32度)よりはるかに低い室温まで冷却されます。アプリケーションで光学技術の使用が許可されていない場合は、溶液の温度を測定することで放出を監視できます。

ナノファイバーやその他のナノ構造は、パイプPAM層の放出後、水中に浮遊します。さらなる応用のためには、ナノファブリックやその他のナノ構造を操作する必要がありますが、正確なアプローチは実験目的によって異なります。ここでは、表面開始アセンブリ(SIA)が、繊維の寸法を正確に制御してECMタンパク質ナノファイバーをエンジニアリングできることを実証するために、代表的な結果を示します。

長さ50マイクロメートル、幅20マイクロメートルのフィブロネクチン長方形の配列を、摂氏40度のDI水を加えたpiamコーティングされたカバースリップにパターン化され、その後、下部臨界溶液の下で冷却されました。piamの温度は、piamの溶解と放出時のフィブロインナノファイバーの放出を引き起こしました。繊維が収縮したのは、固有のプレストレス下にあったためです。

piamの表面にパターン化したところ、放出前のフィブロネクチンナノファイバーの寸法をAliceが分析したところ、平均長さ50.19±0.49マイクロメートル、平均幅19.98±0.17マイクロメートルのモノ分散体であることが明らかになりました。放出時にナノファイバーはかなり収縮しましたが、平均長さは14.15±0.92マイクロメートル、平均幅は2.65±0.32マイクロメートルのモノ分散のままでした。原子間力顕微鏡は、SIA放出プロセスに関連する繊維の寸法変化について、より高い解像度の視点を提供しました。

特に、放出前の繊維の太さは約5ナノメートルと均一であったのに対し、放出後の繊維の太さは数百ナノメートル程度で、長さと幅は減少していました。SIAプロセスを使用すると、サイズ、形状、組成を調整可能なさまざまなECMタンパク質ナノ構造を設計することができます。例えば、最初は幅20マイクロメートル、長さ1センチメートルのフィブロネクチンナノファイバーをパイプ上にパターニングしました。

PAMコーティングされたカバーは、冷却とパイプ時にスリップします。パム溶解により、ナノ繊維が放出され、幅が約3マイクロメートル縮小された長糸が形成された。さらに、マイクロコンタクト印刷に用いるPDMSスタンプの表面トポグラフィーによってパターンが定義されるため、複雑なECMタンパク質ナノ構造を概念実証として設計することが可能です。

マルチアームフィブロインスターが作成されました。熱放出は腕の収縮をもたらしましたが、腕が結合した星の中央領域は収縮しませんでした。SIAは、ラミネートやLNなどの他のECMタンパク質とも連携し、複数のECMタンパク質を同じ構造に組み込むことができます。

この例では、直交的に相互接続され、赤で示されている20マイクロメートル幅のフィブロネクチン線と緑色で示されている50マイクロメートル幅のラミニン線がA2Dナノファブリックに統合され、パターニングされ、放出時に放出されると、両方のタイプのナノファイバーが収縮しましたが、全体的な相互接続性と正方形の格子構造は維持されました。これらの結果は、SIAがさまざまな組成と構造を持つECM材料を設計するために使用できることを示しています。最後に、ECMナノファイバーのSIAの失敗例をいくつか紹介します。

原因の1つは、ECMタンパク質のpiam表面への転写が不十分であることによる不完全なパターンの不適切な放出です。マイクロコンタクトプリンティングでは、穴や不規則なエッジ、その他の欠陥が存在すると、ナノファイバーやナノ構造が不完全になり、剥離時に破損や断片化を起こしやすくなります。パイプPAMの急速な溶解も、放出後のパターン忠実度の低下を引き起こす可能性があります。

たとえば、摂氏 20 度の水を使用しますが、これはすでに臨界値の低い溶液よりも低い温度です。ピアムの温度は、ピアムを急速に膨らませて溶解させます。これにより、32番目の画像に示すようにナノファイバーがスナップバックして壊れ、52番目の画像に示すようにランダムな未整理の構成を形成する可能性があります。

この手順を開始する前に、PDMSの状態に欠陥がないかを確認し、すべての表面にほこりがないことを確認します。そうしないと、適切なタンパク質の移動が妨げられ、A CM構造の組み立てが不十分になります。したがって、この手順に従うと、放出ナノファイバーまたはナノ構造は、タンパク質ファイバーの機械的特性の分析など、さまざまなことを行うために使用したり、組織工学の足場として使用したりすることができます。

このビデオを見れば、ECMタンパク質のナノファイバーとナノ構造を調整可能な組成、形状、構造で設計する方法を十分に理解できるはずです。具体的には、ECMタンパク質の印刷パターンをパイソンコーティングされたガラスカバースリップにマイクロコンタクトし、表面の溶解を熱的に引き起こしてECM構造を組み立てる方法を理解する必要があります。