細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

本手順の全体的な目的は、シンプルで低コストながら汎用性の高いステッチ技術を用いることで、小さなナノパターンモールドから広範囲のナノパターン基板を作製することです。この手法は、焦点接着タンパク質の発現など、細胞および分子レベルでの細胞表現型や機能に対する基板ナノトポグラフィーによる変調の研究に役立ちます。本技術の主な利点は、簡便であり、コスト効率に優れていることです。

まず、テキストプロトコルに記載されている通り、シラン化シリコンモールドをPDMSプリポリマーで準備します。シラン化シリコンモールドを60 millimeterのペトリ皿に入れます。ペトリ皿の中のシリコンモールドにPDMSプリポリマーを注ぎます。

ペトリ皿をプラスチック製デシケーターに入れ、気泡がすべて消えるまで約10分間脱気します。ペトリ皿をホットプレートに移し、PDMS前駆体を70 °Cで4時間硬化させます。ピンセットを用いて、シリコン型からPDMS成形物を慎重に剥がします。

光学顕微鏡下で、ナノグレーティングなどの異方性PDMSナノパターンの配向を確認し、PDMSモールドの裏面にマーカーペンで印を付けます。ドラフトチャンバー内でシリコン基板をエタノールで洗浄し、その後、圧縮空気で乾燥させます。各PDMSモールドのパターンのない領域をカッターで切り取ります。

PDMSモールドは、パターンのない領域を最小限に抑え、コンプレッサーによる加圧時にナノパターンの変形を防ぐため、周囲のモールドに触れない範囲で可能な限り密接に配置する必要があります。ナノパターン面を下にして、トリミング済みのPDMSモールドをシリコン基板のミラー側に配置し、その後、他のモールドを周囲のモールドに触れないように密接に配置します。未硬化のPDMSが複数のモールド間の隙間から流れ出し、ナノパターンを損傷させる可能性があるため、基底部でPDMSを確実に硬化させることが極めて重要です。

しかしながら、完全に硬化したPDMSでは複数のモールドを接合することができません。PDMS接着層を準備するために、脱気済みのPDMSプリポリマー1 gを清潔なガラススライド上にキャストし、厚さ0.5 mmの層を形成させます。このPDMS層をホットプレートを用いて100 °Cで3〜5分間加熱します。

針を用いて層に触れ、層が部分的に硬化しており、完全に硬化していないことを確認します。PDMS層をアライメント済みのPDMSモールドの裏面に配置し、このアセンブリを素早く反転させてホットプレートに移します。PDMS接着層とPDMSモールドの裏面が良好に接触するように、アセンブリの上に金属ブロックを置いて圧縮力を加えます。

PDMS接着層を100 °Cで1時間硬化させます。ホットプレートの電源を切り、メタルブロックを取り除いて、シリコン基板からシングルステッチPDMSモールドを剥離します。ステッチPDMSモールドをPSプレートにナノインプリントするために、3インチシリコンウェハー上に配置したアルミニウムスペーサーにPSプレートを設置します。

ホットプレートを用いて、PSプレートを250 °Cで30分間加熱します。次に、ナノパターン面を下にして、ステッチされたPDMSモールドを溶融したPSプレート上に配置します。続いて、ステッチされたPDMSモールドのガラススライド上にアルミニウムプレートを置きます。

アルミニウムプレート上にメタルブロックを用いて圧縮圧力を加え、3分間待機します。メタルブロックをアルミニウムプレートから取り外して再度配置し、圧縮圧力を25 kilopascalsに上げます。その後、圧力を50 kilopascalsに上げてこの手順を繰り返します。

ホットプレートの温度を240～250 °Cに維持し、50 kPaの一定圧力下で15分間保持します。ホットプレートの電源を切り、装置全体を冷却します。温度が50 °C以下になったらメタルブロックを取り除き、PSプレートからステッチされたPDMSモールドを慎重に剥がします。

PS薄膜上にPDMSモールドをナノインプリントするには、ホットプレート上に設置したPS薄膜に対し、ナノトポグラフィー面を下にしてステッチ済みのPDMSモールドを配置します。PDMSモールドのガラススライド上にメタルブロックを用い、PDMSモールドに12 kilopascalsの圧縮圧を加えます。ホットプレートの温度を180 degrees Celsiusまで上げ、15分間保持します。

ホットプレートの電源を切り、装置全体を冷却します。温度が50°C以下に下がったらメタルブロックを取り外し、PSフィルムからステッチされたPDMSモールドを慎重に剥がします。中空のスチール製アーチパンチを用いて、ナノパターン形成済みPDMS基板を、特定のマルチウェルプレートの構成に適合するディスク状に切り出します。

次に、ピンセットを用いてPDMSディスクをマルチウェルプレートのウェルに配置します。70% ethanolを用いて30分間、PDMS基質を滅菌します。その後、ethanolを吸引し、続いて30分間のUV照射を行います。

PDMS基材を1X滅菌リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄します。次に、PDMS基材を細胞外マトリックスタンパク質でコートし、室温で30分間静置します。その後、滅菌PBSを用いてPDMS基材を5分間ずつ3回すすぎます。

ヒトA549肺がん細胞を10%胎児牛血清含有Dulbecco's Modified Eagle Mediumに懸濁させ、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測する。PDMS基板上に、播種密度2,000 cells/cm²で細胞を播種する。5%二酸化炭素を含む加湿雰囲気下、37 °Cで1日間培養し、その後、観察を行う。

PSプレートおよび薄膜上に作製されたナノパターンをここに示します。矢印は、ステッチ処理されたPDMSモールドの隙間に生じたポリマーの盛り上がりを示しています。これらのSEM画像は、ステッチ技術を適用することで、電子ビームリソグラフィーで描いたナノパターンからPDMS作製基板が忠実に転写されることを実証しています。

ナノグレーティングおよびナノピラー上で培養したA549細胞の代表的なSEM画像がここに示されています。ナノグレーティング上では細胞が配向した形態を示していますが、ナノピラー上では細胞がランダムに広がっています。このビデオを視聴することで、複数の小さな定義済みナノパターンモールドを繋ぎ合わせることにより、大面積のナノパターン基板を作製する方法について深く理解できるはずです。

トルエンおよびパラホルムアルデヒドの使用は非常に危険であるため、手順の実施中は常に適切な個人用保護具を着用してください。