細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

この手順の全体的な目標は、シンプルで手頃な価格でありながら汎用性の高いステッチ技術を使用して、小さなナノパターン化された金型から広い領域のナノパターン化された基板を製造することです。この方法は、細胞の表現型と機能(焦点接着タンパク質の発現など)の基質ナノトポグラフィー調節の研究に役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで費用対効果が高いことです。

まず、テキストプロトコルに記載されているように、PDMSプレポリマーでシラン化シリコンモールドを調製します。シラン処理されたシリコンモールドを60mmのシャーレに入れます。PDMSプレポリマーをペトリ皿のシリコンモールドに流し込みます。

ペトリ皿をプラスチック製のデシケーターに入れ、すべての泡が消えるまで約10分間脱気します。ペトリ皿をホットプレートに移し、PDMSプレポリマーを摂氏70度で4時間硬化させます。ピンセットを使用して、シリコンモールドからPDMSモールドを慎重に剥がします。

ナノグレーティングなどの異方性PDMSナノパターンの配向を光学顕微鏡で決定し、マーカーペンでPDMSモールドの裏側にマークを付けます。シリコン基板をヒュームフード内でエタノールで洗浄し、圧縮空気で乾燥させます。各PDMSモールドのパターン化されていない領域をブレードで切り取ります。

PDMSモールドは、パターニングされていない領域を最小限に抑え、コンプレッサー力が加えられたときにナノパターンの変形に触れないように、周囲のモールドに触れないように、できるだけ近づけて位置合わせする必要があります。ナノパターンを下にしてトリミングしたPDMSモールドをシリコン基板のミラー面に置き、他のモールドを周囲のモールドに触れないように近づけます。未硬化のPDMSは複数の金型間の隙間を流れてナノパターンを損傷する可能性があるため、基底層でPDMSを硬化させることが重要です。

ただし、完全に硬化したPDMSは、複数の金型を結合することはできません。PDMS接着剤層を調製するには、脱気したPDMSプレポリマー1グラムをきれいなスライドガラス上にキャストして、厚さ0.5mmの層を形成します。PDMS層を100°Cのホットプレートで3〜5分間焼きます。

針を使用してレイヤーに触れ、レイヤーが完全に硬化していないが部分的に硬化していることを確認します。位置合わせされたPDMS金型の裏側にPDMSレイヤーを配置し、このアセンブリをすばやく反転させて、ホットプレートに移します。アセンブリの上部にある金属ブロックを使用して圧縮力を加え、PDMS接着剤層とPDMS金型の裏面との間に良好な接触を確保します。

PDMS接着剤層を100°Cで1時間硬化させます。ホットプレートをオフにし、金属ブロックを取り外し、シリコン基板からシングルスティッチドPDMSモールドをはがします。ステッチしたPDMSモールドをPSプレートにナノインプリントするには、PSプレートを3インチのシリコンウェーハにセットしたアルミニウムスペーサーに配置します。

ホットプレート上のPSプレートを摂氏250度で30分間加熱します。次に、ナノパターンを下にしてステッチしたPDMS型を、溶融したPSプレートに置きます。次に、ステッチしたPDMS型のスライドガラスにアルミプレートを置きます。

アルミ板に金属ブロックを使って圧縮圧をかけ、3分間待ちます。金属ブロックをアルミニウムプレートから持ち上げて交換し、圧縮圧力を25キロパスカルに上げます。次に、圧力を50キロパスカルに上げてこの手順を繰り返します。

ホットプレートの温度を摂氏240度から250度に維持し、50キロパスカルの一定の圧力で15分間待ちます。ホットプレートをオフにし、セットアップ全体を冷却します。温度が50°Cを下回ったら金属ブロックを取り外し、PSプレートからステッチされたPDMSモールドを慎重に剥がします。

PS薄膜上にPDMSモールドをナノインプリントするには、ホットプレート上にセットしたPS薄膜上に、ナノトポグラフィーを施したステッチしたPDMSモールドを下向きにして配置します。PDMS金型のスライドガラス上の金属ブロックを使用して、PDMS金型に12キロパスカルの圧縮圧力を加えます。ホットプレートの温度を摂氏180度に上げ、15分間維持します。

ホットプレートをオフにし、セットアップ全体を冷却します。温度が50°Cを下回ったら金属ブロックをはがし、PSフィルムからステッチしたPDMS型を慎重に剥がします。中空スチールアーチパンチを使用して、ナノパターン化されたPDMS基板をディスクに切断し、特定のマルチウェルプレートの形状に適合させます。

次に、ピンセットを使用してPDMSディスクをマルチウェルプレートのウェルにセットします。70%エタノールを使用してPDMS基質を30分間滅菌します。その後、エタノールを吸引し、これに続いて30分間UV露光します。

PDMS基質を1X滅菌リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄します。次に、PDMS基質を細胞外マトリックスタンパク質で室温で30分間コーティングします。PDMS基質を滅菌PBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。

ヒトA549肺がん細胞をDulbeccoのModified Eagle Mediumに10%ウシ胎児血清で懸濁し、血球計算盤を用いて細胞をカウントします。PDMS基板上に1平方センチメートルあたり2, 000細胞の播種密度で細胞をプレートします。細胞を37°Cで5%の二酸化炭素を含む加湿雰囲気で1日培養し、その後観察します。

PSプレート上に生成されたナノパターンと薄膜を示します。矢印は、ステッチされたPDMS金型の隙間でポリマーが隆起していることを示しています。これらのSEM画像は、スティッチ技術を適用することにより、電子ビームリソグラフィーで書き込まれたナノパターンからPDMSワーキング基板が忠実に転写されることを示しています。

ナノグレーティングおよびナノピラーで成長したA549細胞の代表的なSEM画像を以下に示します。細胞はナノグレーティング上で整列した細胞形態を示し、細胞はナノピラー上でランダムに広がります。このビデオを見れば、複数の小さな定義済みナノパターン型を縫い合わせて、広い領域のナノパターン基板を生成する方法についてよく理解できるはずです。

トルエンやパラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください、そして手順を実行する間は常に適切な個人用保護具を着用してください。