Name: テスト視機能のための簡単な行動アッセイアフリカツメガエル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶXenopus laevisオタマジャクシの視覚機能評価法。白黒水槽を用いた簡便な行動アッセイで、視覚誘導行動を測定し、神経科学と発生生物学の研究に応用できます。

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EY015748、EY017964（MEZ）、およびEY019517（ASV）：この作品は、国立衛生研究所からの補助金によって賄われていた。この作品はまた、眼科部門及びセントラルニューヨークのライオンズに失明無制限グラントを防止するための研究によってサポートされていました。我々はまた、動物の彼の優れたケアのためのこのビデオに出演するにはステップのために、私たちの動物技術者、マシュー·メリーニに感謝したいと思います。

動物ケア アフリカツメガエルは、本研究で用いたオタマジャクシがアップステート医科大学動物実験委員会および実験動物の管理と使用に関する指針によって承認された手順に従って上昇し、治療、成長させたツメガエル 。 1前の行動セットアップ：オタマジャクシ<ol><li>市販のソースから受精アフリカツメガエル胚を入手するか、以前に記載したように、6 in vitroで 、卵母細胞を受精。 </li><li> 20のKCl;; 20のCaCl 2、50mMのHEPES 0.1X MMR [10×Marcの修正リンゲル（MMR）は、溶液の在庫（10 mMのMgCl 2を含む60ミリメートルペトリ皿に18˚Cで神経板期胚への胞胚を置く。 1 MのNaCl、50μg/ mlのゲンタマイシン抗生物質]）、pH7.5に調整し、オートクレーブにかけ、室温で保存した。毎日0.1X MMRを変更し、デッド胚を削除します。 </li><li>胚はNieuwkoopとフェーバー段階に到達したら〜27から30 7、目を切り替える抗生物質なしの0.1X MMRへのE胚腸細菌の増殖を可能とする。 </li><li>彼らは供給ステージ（ステージ45）に到達するまで、オタマジャクシを育て、0.1X MMRで満たさ100ミリメートルペトリ皿に移動します。介入の日に0.1X MMRを変える、一週間、一日おきに、彼らにイラクサ粉末上清フィード。 </li><li> 100ミリメートルペトリ皿中の1週間後、カエルの水で満たされた半ガロンのタンクに動物を移動し、[0.5グラム/ Lの瞬間、海と2 mMリン酸ナトリウム二塩基性（のNa 2 HPO 4：141.96 MW）のpH 6.8]。ステップ2.4​​のように、彼らを養うが、水が濁っている場合には、水を週に2〜3回だけを変更してください。ライトは6時にオンにして、12時間のlight/12明暗サイクルで動物を維持する。 </li><li>試験前に、少なくとも12時間、O / N、実験台のアンダーパッドのような白い表面の試験対象と半ガロンタンクを配置します。 </li><li>ステージ45から50の試験オタマジャクシは以下の手順3で説明。 </li></ol> 2前行動セットアップ：技術設備T <ol><li>行動分析のための実験室の面積を取っておく。これは、標準的な蛍光灯の静かな、低トラフィックエリアである必要があります。 </li><li>動物のためのテストタンクを準備します。 ネストされた、半ガロン試験槽は2つの部分から構成されています。水やオタマジャクシを開催する内槽;および視覚刺激と外槽。 <ol><li>内槽の場合は、シャーピー、一番下から5cmと外側の角に小さなマークを作る。これは水ライン（ 図1A、緑の点線）である。 </li><li>また、内槽のために、シルガードエラストマーのような不活性化合物と（コーナーと中央）タンク内のdivetsを埋める。注：これらは記入されていない場合は、オタマジャクシは、これらの分野に残るでしょう</li><li>外槽の場合は、1黒い絶縁テープでタンクと白のティッシュペーパー図1Bとの残りの半分の外のちょうど半分をカバーしています。 </li></ol></li><li>上のタンクを配置ターンテーブルを接種する。 </li><li>セットアップウェブカメラ/三脚には、テスト用のタンクの上になるように。 図1Cに示すように、検査部位の視覚化を可能にするようにカメラを調整する。 </li><li> 5をインストールしたQuickTime PlayerソフトウェアでコンピュータにWebカメラを接続してください。カメラの電源を入れます。 QuickTime Playerのでは、ファイルの下に、「新しい動画撮影を。」を選択行動分析のセットアップがすぐにコンピュータ上で表示されます。 </li><li>オタマジャクシ動作に影響を与える可能性があり、外部の合図を低減、ならびに、水の表面での反射光を低減するためにセットアップ全体にわたって軽量綿布ドレープ。 </li><li> 35〜50のCD / m 2で布措置に基づく輝度いることを確認してください。 </li></ol> 3。行動アッセイ<ol><li>カエルの水でステップ1.2.1で行われた5cmのウォーターマーク、内側テスト給油して下さい。 </li><li>小さなネットを使用して、ゆっくりと内部テストタンクに動物を移動します。 </li><li>オープンQコンピュータと、ガイドとして外槽の使用についてuickTimeソフトウェアは、カメラのテストエリアを視覚化し、記録することができることを確認してください。 </li><li>カメラで紙や記録の一部に、動物の名前、日付と時刻を書き込みます。 </li><li>右図2に、タンクの黒い面と外槽に試験水槽を配置します。 </li><li>タンクを配置した直後に動画撮影を開始し、2分間のタイマーをセットします。 </li><li>タイマービープ音は、内部試験水槽を削除すると、外槽を180°回転させ、外槽の内側にインナー試験水槽を配置します。タイマーを開始する。注：黒側は、現在、他の側に配置する必要があります。 </li><li> 10の試験の合計ステップ3.7、8回繰り返します。各試行をオフにチェックし、ガイドとして、図2を使用してください。 </li><li> 2別の日に行動分析を繰り返します。 </li></ol> 4。網膜軸索切断<ol><li>彼らが応答しなくなるまで0.02％トリカイン動物を配置＃3ピンセットで尾のピンチに。 </li><li> 0.1X MMR中の1％アガロースを融解し、次いで60ミリメートルのペトリ皿に入れる。いったん冷却し、アガロース中に小さな長方形のディボットを作り、動物が部分的に液体に沈められるように、少し0.02％トリカインでディボットにオタマジャクシを追加します。 </li><li>ピアース25 G針で目の背部の後ろに45度の角度で肌、反対側の鉗子に対して動物をブレースながら。 </li><li>視神経の隣にある静脈をチョキチョキしないように注意しながら、慎重に、＃5ピンセットで穴に達する視神経を切り取ると邪魔にそれを反転。重度の出血が原因で誤って動脈を切り取るに存在する場合には、すぐに安楽死させるために、2％トリカイン動物を配置します。注意：トリカイン液2％がヒトにしびれを引き起こす可能性があります。このソリューションは、手袋をして取り扱ってください。 </li><li>動物を回復するために、手術後、0.7X MMRで100ミリメートルペトリ皿と20分間50μg/ mlのゲンタマイシン動物を配置します。 NEXT、カエルの水で回収タンクにオタマジャクシを移す。てみよう動物の残りのO / N </li><li>翌朝、（3.1から3.9ステップ）上記のような視覚機能をテストします。 </li></ol> 5。結果の分析<ol><li>試験が終了した後、オタマジャクシは、タンクの黒い面に留まる時間を測定する。 <ol><li>手動で時刻を表示し、頻繁に一時停止を可能にするソフトウェアを使用して動画を表示する。映像の表示時間を見てください。内槽が正常に外槽の内側に入れ子にし、カメラのビューで二乗されたときである2分間の裁判の開始を書き留めます。 </li><li>動物が上の泳いでいる水槽のどちら側を定義するためにオタマジャクシの目の位置を使用してください。両眼が黒/白のラインを越えた場合にのみ、他にタンクの片側からクロスオーバー定義します。 </li></ol></li><li>動物は、黒側に費やすことを（秒単位）の各区間の始まりと終わりを書き留めます。一時停止して再正確さを保証するためにビデオを巻き。各試行内の秒の合計。 </li><li>付属の行動のためのワークシートに入力これらの番号を。に費や​​した合計秒 - ワークシートには、動物が（120 [秒で合計時間で合計120秒のトライアル·アンド·ディバイドから、タンクの黒い面に費やす時間を差し引くことにより、白側に費やした時間の割合を計算します黒側）/ 120秒]。全10試行以上のワークシートの平均は、この比率。 </li><li>日の間試験は（P≤0.05）が有意であるかどうかを判断するためにスチューデントのt検定、対の、両側分布を使用してください。 </li></ol>

<ol><li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li>
<li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li>
<li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7 (8), (2009).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
<li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+%28ACT%29+assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li>
<li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li>
<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは簡単に最小​​限の訓練を受けた研究室の担当者が週の下で実行することができる簡単な視覚誘導行動分析を報告する。他のアッセイは、動物の行動に特化した設備や専門知識を必要としますが、このアッセイは、視覚的な機能を決定するために簡単なテストを可能にする。別の行動分析、ビジュアル回避アッセイは、蓋がアフリカツメガエル 10内視知覚に貢献する方法を決定するために開発されました。このアッセイは、安定した背景に対して移動に応じた施策の空間的調整とコントラスト感度、したがって、ここで報告されたシンプルなアッセイより専門的なビジョンに基づく行動を測定することができます。自動化された行動システムはタンク8の一方の側に費やす時間の量を測定することが報告されている。暗いまたは明るい環境9で過ごす時間ゼブラフィッシュの量を測定するために使用されている市販のソフトウェア（ 例えば ANY-迷路ソフトウェア）もある。 Assay我々は高価な機器やソフトウェアのこれらの種類を購入する必要はありません、ここで報告しているが、代わりに視覚機能を測定するために、日常の...

アフリカツメガエルは、眼の形成を研究するためのモデル生物として用いられてきた。目はビジュアル開発と機能に影響を与える遺伝子または経路をテストするための一週間も経たないうちに満期まで成長し、急速に開発しています。視覚機能をテストするには、視運動と微細運動応答は、それぞれ1,2、ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルのオタマジャクシで使用されている。 アフリカツメガエルのオタマジャクシの目はゼブラフィッシュよりも比較的小さいので、このアッセイは、 アフリカツメガエルの微妙なテールフリップと眼球運動の挙動を検出するために、特殊な装置を使用し、訓練された人材を必要とします。 アフリカツメガエルにおけるより堅牢な動作がここに記述されている3、白背景、とのタンクで泳ぐための好みです。半分黒/ハーフ白タンクにオタマジャクシを配置するときに、事前に変成オタマジャクシはすぐにタンクの白側に泳ぐ。我々は以前、多能性細胞由来かどうかを判断するためにこのアッセイを使用目は4機能的であった。ここでは、変態前のアフリカツメガエルのオタマジャクシの視覚機能をテストするために使用され得るこのアッセイの詳細なバージョンを、報告する。 それだけで、ほとんどのアフリカツメガエルの研究室で発見搭載したデジタルビデオカメラ、デジタルカメラのソフトウェアや標準的な装置を必要とするので、このアッセイは、微細運動応答アッセイよりも簡単である。また、記録された応答は、集計結果に特別なトレーニングを必要としません。当社の代表的な結果は、二重の網膜軸索切断を受けたオタマジャクシの同じグループは、タンクの周りにランダムに泳ぐことを示している。また、片方の眼は、視覚的応答を試験することができる方法を示す、代表的なオタマジャクシから行動アッセイの結果が含まれている。アッセイの間に取得された数値が挿入され、分析することができるようにワークシートが含まれている。このワークシートは、試験したオタマジャクシは、視覚的応答を有するか否かを決定するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>カバーeNasco</td><td>SB19271M</td><td>付き1/2ガロンフレックスタンク</td>サイズ<td>:5-3 / 8 "x 7" x 3-3 / 4 "</td></tr><tr><td>黒の電気テープ</td><td></td><td></td><td></td></tr>白い<tr><td>ティッシュペーパー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大型接種ターンテーブル</td><td>VWR</td><td>50809-022</td><td>サイズ:直径114.3 x&nbsp;H 76.2 mm (4 1/2&nbsp; x&nbsp; 3")</td></tr><tr><td>Durasorb underpad</td><td>VWR</td><td>82004-836</td><td>サイズ: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24")</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1945-34155-CS</td><td></td></tr><tr><td>標準三脚</td><td></td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>iSightカメラまたはウェブカメラ</td><td>Apple</td><td>M8817LL/A</td><td>大きなオタマジャクシには良いが、小さなものは見づらい</td></tr><tr><td>ポータブルコンピュータ</td><td>Apple/PC</td><td>各種</td><td>13インチMacBook、2GHzのIntel Core 2 Duo、MacOSX Lion 10.7.5</td></tr><tr><td>MiniDV、ハンディカムカムカメラ</td><td>、SONY</td><td>DCR-HC42</td><td>を使用しました6芯および4芯のα FireWire 400&nbsp;</td></tr><tr><td>ハンディカムステーション</td><td>SONY</td><td>DCRA-C121</td>これは、カメラQuickTimeプレーヤーソフトウェアQuicktimeバージョン10.1 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G針(5/8 "長さ)</td><td>VWR</td><td>BD305115</td><td></td></tr><tr><td>デュモン#5鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てに</td><td></td>firewireを接続するために使用することができます<td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-528Z</td><td>RT</td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコーンエラストマー</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>ストック溶液 = 100 g/L RTで保存</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0876</td><td>ストック溶液 = 0.4 M RTで保存</td></tr><tr><td>in vitro受精胚</td><td>eNasco</td><td>LM00490MX</td><td>100胚/ユニット</td></tr></tbody></table>

テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

カエルのオタマジャクシにおける視覚機能の測定は、 アフリカツメガエル 、生きた動物で失明のためのスクリーニングが可能となる。視運動性応答は試験した全ての脊椎動物で観察されている視覚ベース、反射的な動作です。従ってテールフリップ応答が微妙応答を記録するための訓練を受けた技術者を必要とする別の尺度として使用したオタマジャクシの目が小さい。私たちは、オタマジャクシは黒と白の両サイドにタンク内に置かれたとき、タンクの白い側に泳ぐことを好むという事実に基づいて、代替行動アッセイを開発した。ここで紹介するアッセイは、容易に測定された応答を作成し、安価な、簡単な代替手段です。セットアップは、ほとんどのアフリカツメガエルの研究室で容易に利用可能、三脚、ウェブカメラと、ネストされたテスト用のタンクで構成されています。この記事では、前と視神経を切断した後、オタマジャクシの挙動を示すのムービーが含まれています。片目の機能をテストするために、我々はまた、REPREを含むそれぞれの目には連続した日に、網膜軸索切断を受けているオタマジャクシのsentative結果。今後の研究では、一度に多くのオタマジャクシのビジョンをテストするためにこのアッセイの自動化されたバージョンを開発することもできます。

以前の報告は、我々はオタマジャクシのどちらかの目の視覚機能をテストするために、このアッセイを変更した、変態前のアフリカツメガエルのオタマジャクシは、白/黒のタンクの白側に泳ぐと、このアッセイと呼ばれることを好むことを背景色嗜好のアッセイ3を示している週間足らず。このようにして、彼らの目は、組織学的検査のために収集することができる。 私たちは、応答が視覚的手がかりに起因しているかをここに表示されます。 動画1は、左右のパネル内のオタマジャクシは、同じ動物である。左の両方の視神経を切断した後、手術前、右、動物に動物である。私たちは、何も黒い面から動物を撃退するか、白側にそれらを誘致するために追加されていないことを示すために水を旋回。映画では、動物の組ごとに視神経の状態を示している底部コーナーでオタマジャクシの概略図を提供する。 動画1、ノーマル、U内N-操作オタマジャクシブラインドオタマジャクシがタンクの周りにあてもなく泳ぎながら試験水槽に30秒未満で背景色に反応する。ムービーの...

アフリカツメガエルのオタマジャクシは黒/白のタンクの白側水泳を好むツメガエル 。この現象は、それらの視覚によって案内される。この動作に基づいて、我々はオタマジャクシの視覚機能をテストするための簡単​​な分析を提示する。

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

本手順の目的は、テストタンクの半分を黒色で覆い、そこにオタマジャクシが滞在する時間を記録することで、視覚機能を評価することです。まず、オタマジャクシをステージ45から50まで成長させます。次に、行動解析用に、半分を黒、もう半分を白にしたタンクとカメラを設置します。次に、オタマジャクシを入れた2つ目のタンクを外側のタンクの中に配置します。それぞれのオタマジャクシについて、周囲の環境の背景を変化させた際の視覚誘導行動を記録します。最後のステップは、オタマジャクシの網膜摘出を行い、その後、行動アッセイを繰り返すことです。最終的に、この簡便で安価なアッセイから得られたデータを用いて、光視覚の試験において、オタマジャクシが水槽の片側に泳ぐことを好む傾向があることを示します。視覚運動反応やテールフリップ・アッセイなどの他の手法と比較して本手法を用いる主な利点は、ほとんどのラボで容易に入手可能な設備を使用した、安価で簡便な方法であることです。オタマジャクシを準備するには、まず受精したxenopus胚を用意し、50 µg/mLに希釈したMark's modified Ringer's solution（MMR）を60 mmのペトリ皿に入れます。ジェンタマイシン抗生物質を、胞胚期から神経板期の胚に添加します。18 °Cのペトリ皿内でステージ2から15まで育成します。胚が約27〜30のニューカップ（new cup）段階に達したら、腸内細菌を増殖させるために、抗生物質を含まない0.1 XMMRに交換します。オタマジャクシがステージ45付近の摂食期に達したら、0.1 XMMRが入った100 millimeterのペトリ皿に移します。翌日、イラクサ粉末の上清を投与します。100 millimeterのペトリ皿で1週間後、ハーフガロンのタンクにフロッグウォーターを満たします。動物をタンクに移し、イラクサパウダー上澄み液の給餌スケジュールを継続しますが、換水は週に2〜3回のみとしてください。動物をハーフガロンタンクで飼育する場合、午前6時に点灯する12時間明期・12時間暗期のサイクルで維持します。試験の前に、被験個体が入ったハーフガロンタンクを白い平面上に置き、試験開始前の少なくとも12時間、一晩保持してください。行動解析は、標準的な蛍光灯照明の下、静かで人通りの少ない場所で実施する必要があります。内側になるタンクの外側の角に、入れ子状に配置した2つのハーフガロン試験用タンクを用意します。シャーピーを使用して、底から5 cm上の位置に水線をマークしてください。また、内側のタンクの内部に凹みがあるかを確認します。オタマジャクシが留まるのを防ぐため、これらを不活性化合物で満たします。次に、2つ目の外槽に注目してください。次のステップでは、黒色の絶縁テープと白いティッシュペーパーを用意します。ここに示すように、タンクの半分をテープで、もう半分をティッシュペーパーで外側から覆います。タンクの準備ができたら、接種用ターンテーブルを設置し、入れ子状にしたタンクをその上に置きます。三脚とウェブカメラを配置し、カメラでタンク内部を上方から撮影できるようにします。ビデオキャプチャおよび再生ソフトウェアがインストールされたコンピュータにウェブカメラを接続します。カメラの電源を入れ、新しく動画を録画する準備をします。次に、軽量の綿布をカメラとタンクに掛けます。オタマジャクシへの外部刺激を軽減するため、輝度計を使用して、布の下の輝度が35〜50 cd/m²の間にあることを確認します。内側の試験水槽を取り出して、行動解析を開始します。試験水槽に5 cmの目盛りまで蛙用飼育水を満たします。ネットを使用して、0.5ガロンの容器からコンピュータに接続された内側のテストタンクに動物を移動させます。記録保存のため、録画ソフトウェアが起動しており、テストエリアを録画していることを確認してください。動物の名前、日付、時刻を紙に記入します。これをカメラの下に配置して録画します。完了後、タイマーを2分に設定してください。次に、ターンテーブル上の外槽を、黒い面が右側に来るように向けます。次に、テストタンクをアウタータンクの中に入れます。録画エリアでドレープを閉じ、コンピュータ画面を使用してアウタータンクの向きを確認してください。ビデオが録画されていることを確認し、タイマーを開始します。タイマーが鳴ったら、ドレープをそのままの位置に保持し、内部テストタンクを取り出します。次に、黒い面が左側にくるように外部タンクを180度回転させます。テストタンクを外部タンクに戻し、2分間のタイマーを開始します。再度、インナータンクを取り出します。アウタータンクを180度回転させ、2分おきにインナータンクを交換する操作を合計10回繰り返します。完了後、ビデオ録画を停止します。オタマジャクシを0.5ガロンの水槽に戻します。レチノール切除術を行うための顕微鏡を準備します。60 mmのペトリ皿に0.1 XMMRで溶解した1%arosを満たし、凝固させます。オタマジャクシと同等のサイズの長方形のアガロース片を切り出します。準備ができたら、実験動物を回収し、0.02% Tricaに浸します。3番ピンセットで尾を挟んでも反応しなくなった時点で、次の工程に進んでください。その後、動物をディッシュに移します。ペトリディッシュを顕微鏡にセットしてください。ピンセットを用いて、動物の片側を固定する準備をします。反対側では、25ゲージの針を用いて眼の背面部の皮膚を45度の角度で刺し、5番鉗子を慎重に穴に挿入して、隣接する静脈を避けながら視神経を切断します。切断した神経を脇に避け、手術後に鉗子を回収します。0.7 XMMRおよび50 µg/mLを含む100 mmのシャーレに動物を戻し、回復させます。Gentamycinで20分間処理します。その後、オタマジャクシを frog water の入ったリカバリータンクに移動させます。タンクを白い表面の上に置き、試験の準備をします。動物を一晩休ませます。翌朝、行動解析を用いて視覚機能をテストします。この動画では、本実験の代表的なデータを示しています。左側は手術前の動物、右側は両眼の網膜軸索を切断した後の同一の動物を示しています。これは右下の模式図で示されています。水面を揺らしているのは、動物を黒い側から遠ざけたり、白い側に引き寄せたりする物質が何も添加されていないことを示すためです。術前のオタマジャクシは30秒以内に背景色に反応しますが、盲目のオタマジャクシは水槽内を目的なく泳ぎ回ります。このチャートは、3つの条件下における単一の個体が白色領域と黒色領域で過ごした時間の割合を示しています。まず、本アッセイを用いて、いかなる手術も行う前にある個体を観察しました。右視神経を切断した後、2日連続で行動観察を行いました。最終的に、両側の視神経を切断した後、さらに2日間のアッセイによる観察を行いました。少なくとも一方の視神経が温存されている場合、動物は水槽の白い側で過ごす日数が多くなりました。このビデオを視聴することで、ほとんどのカエル研究室にある簡単な試薬と設備を用いて、オタマジャクシの視力を検査する方法を十分に理解できるはずです。皆さんの実験の成功を願っています。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ランダムドットkinematogramsとコンピュータで生成された無脊椎動物のビデオ再生を採用したオペラント条件づけパラダイムを使用して、トカゲの視覚感度のテスト。...

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

我々は光をインクリメントおよびデクリメントに対応して幼虫のゼブラフィッシュのモータ出力を定量化するために視覚運動応答を開発した。我々はまた別のビジョンアッセイ、視覚性運動反射によってテストするときに完全に盲目であると思われた視運動性応答（NRC）変異体、何を含めていないゼブラフィッシュのビジョンの変異を調べた。...

光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

VisioTrackerは、眼球運動の記録に基づいて、幼虫や小さな成魚の視覚性能を定量的に分析するための自​​動化されたシステムです。それはそのような視覚系の発達と機能、薬理学、神経回路の研究や感覚統合などの分野で高スループットの研究を可能にし、視覚刺激のプロパティおよびリアルタイム分析を完全に制御しています。...

VisioTracker、眼球運動解析への革新的な自動化されたアプローチ

このビデオでは、ゼブラフィッシュのオプトキネティックレスポンスアッセイについて説明しています。このビデオでは、視覚運動刺激に基づいて反射的な眼球運動を測定し、ゼブラフィッシュの視力を決定します。...

Optokinetic Response Assay:ゼブラフィッシュの視力を測定する方法

このビデオでは、ゼブラフィッシュの幼生の回避とチグモタキシスアッセイについて説明しています。このビデオでは、視覚嫌悪刺激に反応したゼブラフィッシュの幼生の行動を調べています。...

ゼブラフィッシュの回避とチグモタキシスアッセイ:嫌悪的な視覚刺激に応答した幼虫の行動を調べるためのハイスループット法

ゼブラフィッシュは、多くの研究分野のための貴重なツールとなっている。ここでは、視覚的な応答を誘発し、大人のゼブラフィッシュにおける機能視力を計算する方法を示しています。...

ゼブラフィッシュにおける視力の定量的尺度としての視運動性応答

私たちは、マイクロマニピュレーションと網膜電図技術を利用したゼブラフィッシュの幼生の網膜電図(ERG)分析の方法を提示します。これは、ゼブラフィッシュの幼生の視覚機能をin...

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

アフリカツメガエルのオタマジャクシは、体内の神経系の機能を調査するためのユニークなプラットフォームを提供しています。リビングに嗅覚情報処理を評価する方法論について述べるアフリカツメガエル幼生通常飼育条件や外傷後。...

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

マウスの視界を調べるために、迫りくるテストを実施しました。マウスは、天井にモニターと大きな正方形のアリーナに配置されました。迫り来る視覚刺激は、マウスで一貫して凍結または飛行反応を誘発する。...

マウスの視覚を評価するために迫り来る視覚刺激の使用

このプロトコルは、DNA/DOTAP混合物を1日齢のXenopus...

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

糖尿病の結果としての目と脳の両方の神経変性は、げっ歯類に対して行われる行動検査を通じて観察することができる。Y迷路、空間認知の尺度、および視機能の尺度である光運動応答は、両方とも潜在的な診断と治療に関する洞察を提供する。...

糖尿病ラットにおけるY-迷路を介した視運動応答と認知機能の行動評価

学ぶXenopus laevisオタマジャクシの視覚機能評価法。白黒水槽を用いた簡便な行動アッセイで、視覚誘導行動を測定し、神経科学と発生生物学の研究に応用できます。

テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ

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テスト視機能のための簡単な行動アッセイ