テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイアフリカツメガエル

この手順の全体的な目標は、動物が黒で覆われた試験タンクの半分に費やした時間を記録することにより、オタマジャクシの視覚機能をテストすることです。これは、最初にオタマジャクシをステージ45から50に上げることによって達成されます。2番目のステップは、ビヘイビアアッセイ用のカメラとともに、半分黒、半分白のタンクを設置することです。

次に、オタマジャクシのついた2つ目のタンクを外側のタンクに入れます。オタマジャクシのレコードごとに、その環境の背景としての視覚誘導動作が変更されます。最後のステップは、オタマジャクシに対して網膜ex sodomyを実行し、次に行動アッセイを繰り返すことです。

最終的に、このシンプルで安価なアッセイからのデータを使用して、オタマジャクシがフォトトップビジョンのテストの下で、タンクの片側を他方よりも泳ぐことを好むことを示しています。この方法を使用する主な利点は、光学速度応答やテールフリップアッセイなどの他の手法よりも優れている点は、ほとんどのオーパスラボですぐに入手できる機器を使用する安価でシンプルな方法であることです。オタマジャクシを準備するには、まず、受精したキセノプス胚を取得し、マーク、修飾リンガー、またはMMRを10ミリメートルのペトリ皿に10倍に希釈し、1ミリリットルあたり50マイクログラムで

ゲンタマイシン系抗生物質は、胞胚を神経板期の胚に配置します。ペトリ皿で摂氏18度でステージ2から15。胚が約27〜30の支持期で新しいカップに達したら、抗生物質なしで0.1 XMMRに切り替えて、腸内細菌の成長を可能にします。

オタマジャクシがステージ45付近で摂食段階に達したら、0.1 XMMRで100ミリメートルのペトリ皿に移動します。翌日、イラクサ粉末の上清を与えます。100ミリメートルのペトリ皿で1週間後、半ガロンのタンクにカエルの水を入れます。

動物を水槽に移し、イラクサ粉末上清の給餌スケジュールを続けますが、水は週に2〜3回しか交換しないでください。動物がハーフガロンタンクに入っているときは、12時間のライト、12時間の暗いサイクルで維持し、午前6:00にライトが点灯しますテストの前に、被験者と一緒にハーフガロンタンクを白い表面に一晩置きますテストの少なくとも12時間前。ビヘイビアアッセイは、標準的な蛍光灯を備えた静かで交通量の少ないエリアで行う必要があります。

内側のタンクになるものの外側の角に2つの入れ子のハーフガロンテストタンクを準備します。シャーピーを使用して、底から5センチメートル上にウォーターラインをマークします。また、内側のタンクについては、その内部のくぼみを特定します。

これらに不活性化合物を入れて、オタマジャクシが長引くのを防ぎます。次に、2番目の外側のタンクに注意を向けます。次のステップでは、黒い電気テープと白いティッシュペーパーを入手します。

ここに示すように、テープを使用してタンクの半分の外側を覆い、ティッシュペーパーを使用してもう一方の半分の外側を覆います。タンクの準備ができたら、接種ターンテーブルを設置し、その上にネストされたタンクを置きます。カメラがタンクの内部を上から撮影できるように、三脚とウェブカメラを配置します。

接続します webビデオキャプチャおよび再生ソフトウェアを備えたコンピューターへのカム。カメラの電源を入れて、新しい動画撮影の準備をします。次に、カメラとタンクの上に軽量の綿の布を掛けます。

オタマジャクシへの外部からの手がかりを減らすには、輝度計を使用し、布の下の輝度が1平方メートルあたり35〜50キャンドルの間であることを確認してください。内部のテストタンクを取り出して、挙動アッセイを開始します。5センチメートルのマークまでカエルの水で満たします。

ネットを使用して、動物を半ガロンの容器からコンピューターの内部テストタンクに移します。録音ソフトウェアが開いていて、記録保持のためにテスト領域を記録していることを確認してください。動物の名前、日付、時刻を紙に書きます。

これをカメラの下に置いて録画します。これが完了したら、タイマーを2分間プリセットします。次に、外側のタンクをターンテーブルの向きにして、黒い側が右側になるようにします。

次に、テストタンクを外側のタンクに入れます。録音エリアで、ドレープを閉じ、コンピューターの画面を使用して外側のタンクの向きを確認します。ビデオが録画されていることを確認し、タイマーを開始します。

タイマーがビープ音を鳴らしたら、ドレープを所定の位置に保持し、内部のテストタンクを取り外します。次に、外側のタンクを180度回転させて、黒い側が左側になるようにします。テストタンクを外側タンクに戻し、2分間のタイマーを開始します。

再度、インナータンクを取り外します。外側のタンクを180度回転させ、内側のタンクを2分ごとに合計10回交換します。完了したら、ビデオ録画を停止します。

オタマジャクシを半ガロンのタンクに戻します。レチノールexソドミーを実行するための顕微鏡を準備します。60mmのシャーレに0.1XMMRで溶かした1%arosを入れ、固めます。

オタマジャクシのサイズのアロスの小さな長方形の部分を取り除きます。続行する準備ができたら、試験動物を取り出して0.02%Tricaに入れます。3番の鉗子で尾をつまむと反応しない場合は続けます。

次に、動物を皿に移します。ペトリ皿を顕微鏡に取り付けて進めます。片側に鉗子で動物を支える準備をします。

反対側では、25ゲージの針を使用して、目の背側の領域の後ろの皮膚を45度の角度で突き刺し、5番の鉗子で穴に慎重に手を伸ばし、隣の静脈を避けながら視神経を切り取ります。手術後、神経を邪魔にならないようにひっくり返し、鉗子を引っ込めます。動物を0.7 XMMRと50 μgram per milliliterの100mmシャーレに入れて回収します。

ゲンタマイシンを20分間。その後、オタマジャクシをカエルの水が入った回収タンクに移します。テストの準備として、タンクを白い面に置きます。

動物を一晩休ませます。翌朝、行動アッセイを使用して視覚機能をテストします。この動画は、実験の代表的なデータを示しています。

左は手術前の動物、右は両眼の網膜軸索を切断した後の動物です。これは、下部の隅にある回路図で示されています。水は、動物を黒い側から撃退したり、白い側に引き付けたりするために何も追加されていないことを示すために乱されました。

手術前のオタマジャクシは30秒未満で背景色に反応し、盲目のオタマジャクシは水槽の周りをあてもなく泳ぎます。このグラフは、3つの条件下で1匹の動物が白と黒の領域で費やした時間の割合を示しています。まず、アッセイを使用して手術を行う前に動物を観察しました。

右視神経を切断してから2日連続で、2日間の試験でその挙動が観察されました。最後に、両方の視神経が切断された後、アッセイでさらに2日間の観察が行われました。動物は、少なくとも1つの視神経が無傷であったときに、タンクの白い側でより多くの日を過ごしました。

このビデオを見れば、ほとんどのカエルの研究室にある簡単な試薬や機器を使ってオタマジャクシの視力を検査する方法をよく理解できるはずです。あなたの実験に頑張ってください。