テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ

本手順の目的は、テストタンクの半分を黒色で覆い、そこにオタマジャクシが滞在する時間を記録することで、視覚機能を評価することです。まず、オタマジャクシをステージ45から50まで成長させます。次に、行動解析用に、半分を黒、もう半分を白にしたタンクとカメラを設置します。

次に、オタマジャクシを入れた2つ目のタンクを外側のタンクの中に配置します。それぞれのオタマジャクシについて、周囲の環境の背景を変化させた際の視覚誘導行動を記録します。最後のステップは、オタマジャクシの網膜摘出を行い、その後、行動アッセイを繰り返すことです。

最終的に、この簡便で安価なアッセイから得られたデータを用いて、光視覚の試験において、オタマジャクシが水槽の片側に泳ぐことを好む傾向があることを示します。視覚運動反応やテールフリップ・アッセイなどの他の手法と比較して本手法を用いる主な利点は、ほとんどのラボで容易に入手可能な設備を使用した、安価で簡便な方法であることです。オタマジャクシを準備するには、まず受精したxenopus胚を用意し、50 µg/mLに希釈したMark's modified Ringer's solution（MMR）を60 mmのペトリ皿に入れます。

ジェンタマイシン抗生物質を、胞胚期から神経板期の胚に添加します。18 °Cのペトリ皿内でステージ2から15まで育成します。胚が約27〜30のニューカップ（new cup）段階に達したら、腸内細菌を増殖させるために、抗生物質を含まない0.1 XMMRに交換します。

オタマジャクシがステージ45付近の摂食期に達したら、0.1 XMMRが入った100 millimeterのペトリ皿に移します。翌日、イラクサ粉末の上清を投与します。100 millimeterのペトリ皿で1週間後、ハーフガロンのタンクにフロッグウォーターを満たします。

動物をタンクに移し、イラクサパウダー上澄み液の給餌スケジュールを継続しますが、換水は週に2〜3回のみとしてください。動物をハーフガロンタンクで飼育する場合、午前6時に点灯する12時間明期・12時間暗期のサイクルで維持します。試験の前に、被験個体が入ったハーフガロンタンクを白い平面上に置き、試験開始前の少なくとも12時間、一晩保持してください。行動解析は、標準的な蛍光灯照明の下、静かで人通りの少ない場所で実施する必要があります。

内側になるタンクの外側の角に、入れ子状に配置した2つのハーフガロン試験用タンクを用意します。シャーピーを使用して、底から5 cm上の位置に水線をマークしてください。また、内側のタンクの内部に凹みがあるかを確認します。

オタマジャクシが留まるのを防ぐため、これらを不活性化合物で満たします。次に、2つ目の外槽に注目してください。次のステップでは、黒色の絶縁テープと白いティッシュペーパーを用意します。

ここに示すように、タンクの半分をテープで、もう半分をティッシュペーパーで外側から覆います。タンクの準備ができたら、接種用ターンテーブルを設置し、入れ子状にしたタンクをその上に置きます。三脚とウェブカメラを配置し、カメラでタンク内部を上方から撮影できるようにします。

ビデオキャプチャおよび再生ソフトウェアがインストールされたコンピュータにウェブカメラを接続します。カメラの電源を入れ、新しく動画を録画する準備をします。次に、軽量の綿布をカメラとタンクに掛けます。

オタマジャクシへの外部刺激を軽減するため、輝度計を使用して、布の下の輝度が35〜50 cd/m²の間にあることを確認します。内側の試験水槽を取り出して、行動解析を開始します。試験水槽に5 cmの目盛りまで蛙用飼育水を満たします。

ネットを使用して、0.5ガロンの容器からコンピュータに接続された内側のテストタンクに動物を移動させます。記録保存のため、録画ソフトウェアが起動しており、テストエリアを録画していることを確認してください。動物の名前、日付、時刻を紙に記入します。

これをカメラの下に配置して録画します。完了後、タイマーを2分に設定してください。次に、ターンテーブル上の外槽を、黒い面が右側に来るように向けます。

次に、テストタンクをアウタータンクの中に入れます。録画エリアでドレープを閉じ、コンピュータ画面を使用してアウタータンクの向きを確認してください。ビデオが録画されていることを確認し、タイマーを開始します。

タイマーが鳴ったら、ドレープをそのままの位置に保持し、内部テストタンクを取り出します。次に、黒い面が左側にくるように外部タンクを180度回転させます。テストタンクを外部タンクに戻し、2分間のタイマーを開始します。

再度、インナータンクを取り出します。アウタータンクを180度回転させ、2分おきにインナータンクを交換する操作を合計10回繰り返します。完了後、ビデオ録画を停止します。

オタマジャクシを0.5ガロンの水槽に戻します。レチノール切除術を行うための顕微鏡を準備します。60 mmのペトリ皿に0.1 XMMRで溶解した1%arosを満たし、凝固させます。

オタマジャクシと同等のサイズの長方形のアガロース片を切り出します。準備ができたら、実験動物を回収し、0.02% Tricaに浸します。3番ピンセットで尾を挟んでも反応しなくなった時点で、次の工程に進んでください。

その後、動物をディッシュに移します。ペトリディッシュを顕微鏡にセットしてください。ピンセットを用いて、動物の片側を固定する準備をします。

反対側では、25ゲージの針を用いて眼の背面部の皮膚を45度の角度で刺し、5番鉗子を慎重に穴に挿入して、隣接する静脈を避けながら視神経を切断します。切断した神経を脇に避け、手術後に鉗子を回収します。0.7 XMMRおよび50 µg/mLを含む100 mmのシャーレに動物を戻し、回復させます。

Gentamycinで20分間処理します。その後、オタマジャクシを frog water の入ったリカバリータンクに移動させます。タンクを白い表面の上に置き、試験の準備をします。

動物を一晩休ませます。翌朝、行動解析を用いて視覚機能をテストします。この動画では、本実験の代表的なデータを示しています。

左側は手術前の動物、右側は両眼の網膜軸索を切断した後の同一の動物を示しています。これは右下の模式図で示されています。水面を揺らしているのは、動物を黒い側から遠ざけたり、白い側に引き寄せたりする物質が何も添加されていないことを示すためです。

術前のオタマジャクシは30秒以内に背景色に反応しますが、盲目のオタマジャクシは水槽内を目的なく泳ぎ回ります。このチャートは、3つの条件下における単一の個体が白色領域と黒色領域で過ごした時間の割合を示しています。まず、本アッセイを用いて、いかなる手術も行う前にある個体を観察しました。

右視神経を切断した後、2日連続で行動観察を行いました。最終的に、両側の視神経を切断した後、さらに2日間のアッセイによる観察を行いました。少なくとも一方の視神経が温存されている場合、動物は水槽の白い側で過ごす日数が多くなりました。

このビデオを視聴することで、ほとんどのカエル研究室にある簡単な試薬と設備を用いて、オタマジャクシの視力を検査する方法を十分に理解できるはずです。皆さんの実験の成功を願っています。