ゼブラフィッシュの回避とチグモタキシスアッセイ:嫌悪的な視覚刺激に応答した幼虫の行動を調べるためのハイスループット法

- まず、6レーンのアガロースプレートの各レーンに5匹の幼虫を配置します。卵の水を追加しますが、レーンをいっぱいにしすぎないでください。卵の水にはメチレンブルーが含まれており、カビの成長を防ぎます。幼虫のストレスを軽減するために、少なくとも10分間順応させます。

次に、ウェルプレートをラップトップ画面の上のイメージングチャンバーに配置します。カメラのピントをウェルプレートに合わせます。レーンを卵の水で完全に満たします。

次に、空白の背景に置かれた幼虫の行動をタイムラプス画像を撮影して記録します。ノートパソコンの画面に動く赤いバーを表示し、動く赤いバーに反応して幼虫のタイムラプス画像を撮影します。

赤い形は脅威、嫌悪刺激として認識され、幼虫にストレスを引き起こします。それに応じて、彼らはバーを避け、肯定的なチグモタキシスを示します。ポジティブなチグモタキシスとは、壁との接触を求め、レーンの端で泳ぐ刺激に対する魚の反応です。

このプロトコル例では、医薬品化合物または環境毒素で処理されたゼブラフィッシュの幼生の回避反応とチグモタクティック反応を分析します。

- 画像キャプチャを開始するには、幼虫をペトリ皿からアガロースレーンに慎重に移動して、幼虫のストレスを軽減します。各レーンには最大 20 匹の幼虫を配置できますが、通常、1 レーンあたり 5 匹の幼虫を使用して、遊泳速度を最も正確に追跡し、実験ごとに必要な幼虫の数を減らします。

実験に応じて、医薬品や毒物の有無にかかわらず、レーンを卵水で満たします。オーバーフローを防ぐために、イメージングキャビネットに配置されるまで、レーンを完全に埋めないでください。幼虫が順応するまで10分待ちます。順応期間が終わったら、4枚のプレートを手でラップトップの画面の上に直接置きます。

このとき、レーンの上部と同じ高さになるようにレーンに卵水または化学処理をトッピングして、画像内のレーンの端の影をなくすことができます。

コンピュータをタイムラプス撮影用にプログラムし、6秒ごとに写真を撮り、実験ごとに合計300枚の画像を撮影します。ビデオ速度でイメージングするには、カメラを低解像度に設定します。解像度が低いと、録画が1つのマルチウェルプレートに制限されますが、ビデオ録画は急速水泳イベントのイメージングに適しています。

幼虫の嫌悪刺激として使用します。このデモでは、PowerPoint は空白の白い背景から 15 分間始まり、その後 15 分間、プレートの上半分に赤いバーが移動します。アガロースレーン内の液体の蒸発を防ぐため、イメージングの最大時間を1時間未満に保ちます。