走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法

この手順の全体的な目的は、肝類洞内皮を分析することです。まず、肝臓を摘出し、固定液で灌流させることでこれを達成します。次に、電子顕微鏡観察の準備として、肝臓をブロック状に切断し、脱水処理を行います。

その後、肝臓サンプルにスパッタコーティングを施し、電子顕微鏡で観察します。最後に、電子顕微鏡写真を解析し、窓孔の直径と頻度、および空隙率を算出します。最終的に、電子顕微鏡を用いて、さまざまな条件下における肝類洞内皮の変化を示します。

本手法により、肝血管内皮の超微形態および形態学的構造に関する知見を得ることができます。同様の手法を用いて、腎臓や脳の解析を行うことも可能です。動物を使用するすべての手順は、地域の法律に従って実施されています。本研究は、シドニー地方保健区動物福祉委員会の承認を得ています。

許可されている手順はプロジェクトライセンスの文書に記載されており、常に動物の福祉を確保するガイドラインに従っています。本 procedure は非生存手術です。テキストプロトコルに従って固定液を調製した後、灌流緩衝液と固定液を 35 to 37 °C に温めてください。

ケタミンとキシラジンを腹腔内へ単回投与して動物を麻酔した後、後肢の逃避反射と尾部へのピンチ刺激により鎮静レベルを確認します。次に、鈍端剪刀を用いて動物の腹部にY字切開を加え、肝臓と門脈を露出させます。その後、門脈の肝臓近位側と遠位側の2か所に、非常に緩い結紮糸をそれぞれ結びます。

適切なサイズのIVカニューレを用いて門脈に挿管します。次に、縫合糸を締めてカニューレを固定します。続いて、37 °Cに加温した5～20 mLのPBSを用い、10 cm H2Oの圧力で灌流を開始します。

肝臓内に気泡が入らないように注意してください。気泡が入るとアーティファクトが生じ、また気圧が高くなりすぎて肝臓を損傷する可能性があります。腹腔静脈および胸腔静脈を 절断し、バッファーが肝臓から自由に流出するようにします。これにより、高い背圧による肝臓、類洞細胞、内皮細胞、またはLCCの損傷を防ぎます。肝臓から血液が完全に除去されたら、PBSを電子顕微鏡（EM）固定液に置き換え、肝臓が硬くなり、非常に白くなるまで灌流します。

約5分間待ちます。その後、メスを使用して、肝臓を1〜2立方ミリメートルのブロック状に切り出します。固定液を用いて後固定を行ってください。

組織を4 °Cで24～72時間固定します。次に、組織を0.1 MのナトリウムCate緩衝液に移し、走査型電子顕微鏡（SEM）で標本を観察するために、4 °Cで最大12ヶ月間保存します。テキストのプロトコルに従ってサンプルを脱水した後、解剖顕微鏡下で金属製SEMスタブの底面にラベルを貼り、スタブの上部に両面カーボンテープを貼付し、SEMに最適な類洞を持つ表面を特定するためにサンプルを観察します。

選択した表面を上にしてレースをスタブのカーボントープ表面に置き、スタブにしっかりと貼り付けます。テキストプロトコルに従ってスパッタコーティングとSEMを実施した後、ImageJで画像を開き、画像内のスケールバーを用いてスケールを設定します。ImageJのポリゴンツールを使用して、窓状構造のある領域とない領域の両方を含むLSECの平坦な領域全体をトレースします。この際、窓状構造を遮っている可能性のある細胞表面上の大きなデブリは除外してください。窓状構造の直径を測定するには、ラインツールを選択し、各窓状構造の最も長い直径に沿って線を引きたい。

Mキーを押して線を測定し、Dキーを押して画像上に線を恒久的に描画します。この線は窓孔径として定義され、Image Jの結果ボックスで利用可能になります。窓孔に加えて、LSEC細胞質における250 nanometers以上の大きな孔（ギャップ）をすべて測定してください。円形ではないギャップについては、その周囲をトレースし、Image Jを用いて面積を算出した後、結果ボックスのデータをExcelスプレッドシートに転記して面積を計算します。

さらなる解析のために、以下の数式を用いて窓孔（フェネストレーション）の計算を行います。平均窓孔径は、すべての窓孔径の平均値とします。窓孔面積はπr²で算出され、ここでrは個々の窓孔径から算出されます。

空隙率は、σπR²を分析した総面積（μm²）で除し、100を乗じた値で算出します。この計算からギャップの合計面積は除外してください。論文でデータを提示する際は、境界径を用いて窓孔（フェネストラ）を定義したことを明記した上で、窓孔径、窓孔頻度、および空隙率を記載してください。また、分析にギャップを含めたかどうかの記述に加え、窓孔径の頻度分布グラフ、肝ブロック数、および画像を提示してください。SEMによる低倍率像では、門脈域や中心静脈（central ES）を含む多くの大きな肝血管や類洞を観察するのに十分な広さの、肝標本の平坦な表面が確認できます（図参照）。

肝臓ブロックをマウントスタブに正しく配置することは、類洞の鮮明な画像を得るために不可欠であり、類洞のあらゆる詳細を覆ってしまうグリソン鞘が写り込むことは避けなければなりません。そのため、ここで示すように、高倍率を用いることでLSECの窓辺（フェネストレーション）の観察が可能になります。肝細胞板は血管のように見えることがありますが、BLIなどの特徴が方向の特定に役立ちます。

この図は、高い灌流圧が、SEM（走査型電子顕微鏡）下で容易に識別可能な内皮細胞の大きな隙間などのアーティファクトを引き起こす可能性があることを示しています。これはLSECのSIVプレートの合一によって生じると考えられています。核の直上の細胞膜を避け、LSECの表面下に膨らみとして観察される部分を避けることで、窓孔密度の算出と空隙率計算の精度を高めることができます。最終的に、LSECの窓孔径、密度、および頻度を定量化することで、窓孔の経験的な測定が可能となり、加齢、疾患、毒素、または治療によって誘発される変化を測定することができます。灌流手順の後、組織を透過電子顕微鏡などの他の手法で処理し、細胞の超微細構造やミトコンドリア構造を観察することが可能です。

また、組織学に利用することも可能です。