走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法

この手順の全体的な目標は、肝臓の正弦波内皮を分析することです。これは、最初に肝臓を分離し、固定剤で灌流することによって達成されます。次に、肝臓をブロックに切断し、電子顕微鏡検査の準備として脱水します。

次に、肝臓サンプルをスパッタコーティングし、電子顕微鏡で検査します。最後に、電子顕微鏡写真を分析して、開窓径と周波数、および空隙率の割合を計算します。最終的に、電子顕微鏡法を使用して、さまざまな条件下での肝臓の正弦波内皮の変化を示します。

この方法により、肝臓の内皮血管の超微細構造と形態に関する洞察が得られます。また、同じように腎臓や脳の検査にも使用できます 動物の使用を含むすべての手順は、現地の法律に従って行われます。この作業は、シドニー地方保健地区動物福祉委員会によって承認されています。

許可された手順は、プロジェクトライセンス文書に記載されており、常に動物の福祉を確保するためのガイドラインに従っています。これは非生存手術です。固定液を調製した後、テキストプロトコルに従って、灌流バッファーと固定液を摂氏35〜37度で温めます。

動物がケタミンとキシラジンの単回腹腔内注射で麻酔されたら、後肢の離脱と尾のつまみによって鎮静のレベルを評価します。.次に、鈍い端のはさみで、動物の腹部にY字切開を行い、肝臓と門脈を露出させます。次に、門脈の周りに2つの非常に緩い縫合糸を結び、一方は肝臓の近位に、もう一方は肝臓のより遠位に結びます。

適切なサイズのIVカニューレで門脈をカニューレします。次に、縫合糸を締めてカニューレを固定します。次に、摂氏37度に温めた5〜20ミリリットルのPBSを使用して、10センチメートルのH2Oの圧力で灌流を開始します。

人工物や空気圧が高すぎて肝臓に損傷を与える可能性のある気泡が肝臓に入るのを避け、腹部と胸部の大静脈CVAを切断して、バッファーが肝臓から自由に出るようにします。これにより、高い背圧、肝臓、正弦波細胞、内皮細胞、LCCの損傷を防ぐことができます。肝臓から血液がなくなったら、PBSを電子顕微鏡またはEMに交換し、固定剤を投与し、肝臓が硬化して非常に青白くなるまで灌流します。

約5分。次に、メスで肝臓を1〜2立方ミリメートルのブロックに切ります。EM固定剤を使用して投稿します。

ティッシュを摂氏4度で24〜72時間固定します。次に、組織を0.1モルのケイトナトリウム緩衝液に移し、摂氏4度で最大12か月間保存して、走査型電子顕微鏡またはSEM用の試料をマウントします。テキストプロトコルに従ってサンプルを脱水した後、金属SEMスタブのベースにラベルを付け、解剖顕微鏡でスタブの上部に両面カーボンテープを貼り付け、サンプルを視覚化して、SEMに最適な正弦波で表面を特定します。

レース、スタブのカーボンテープ表面に上向きに選択した表面をスタブにしっかりと貼り付けます。テキストプロトコルに従ってスパッタコーティングとSEMを行った後、画像Jで画像を開き、画像に埋め込まれたスケールバーを使用して、画像Jのポリゴンツールを使用してスケールを設定します。LSECの平坦な領域全体(穴あき領域と穴あき領域を含む)をトレースし、セル表面にある大きな破片を除外します。開窓径を測定するには、ラインツールを選択して、各開窓の最長径を通る線を配置します。

Mを押して線を測定し、Dを押して画像上に線を永続的に描画します。この線は開窓径として定義され、画像の結果ボックスで利用できるようになります J.Measure 250ナノメートルを超えるLSEC細胞質の大きな穴であるすべてのギャップと開窓。円形ではないギャップの面積を計算するには、ギャップの周囲をトレースし、画像 J を使用して、画像 J の結果ボックスから Excel スプレッドシートにデータを通過した面積を計算します。

さらに分析するには、開窓計算を実行するために次の式を使用します。平均開窓径は、すべての開窓径の平均と等しくなります。開窓面積はpi rの2乗に等しく、Rは個々の開窓直径から計算されます。

空隙率の割合は、分析された総面積に対するσpi Rの2乗に等しく、ミクロン×100は、この計算からギャップの合計面積を除外します。出版物でデータを提示するには、開窓の直径、境界直径が開窓、開窓の頻度、および多孔性を定義するために使用されたことを確認するステートメント、分析にギャップが含まれたかどうかを確認するステートメント、および開窓の直径と肝臓ブロックの数の頻度分布グラフ、および画像が含まれます。SEMによる低倍率では、肝臓検体の平らな表面が明らかになり、ここに示すように、門脈管や中央ESを含む多くの大きな肝臓血管や正弦波を観察するのに十分な大きさの露出領域があります。

取り付けスタブに正しい肝臓ブロックの配置を確保することは、正弦波の鮮明な画像を得るために不可欠であり、肝臓の正弦波のすべての詳細をカバーする輝くカプセルは避けるべきです。このため、ここに示すように、倍率が高いほどLSEC開窓を観察できます。肝細胞のプレートは血管のように見えることがありますが、BLIなどの特徴が配向を助けます。

この図は、高い増殖圧力が、SEMの下で容易に識別できるLSEC SIVプレートの合体によって引き起こされると考えられる内皮の大きなギャップなどのアーチファクトを引き起こす可能性があることを示しています。核の真上の細胞膜を避け、LSECの表面下の膨らみとして見ることができることは、開窓密度と多孔性の計算の精度に役立ちます。最後に、LSEC 開窓の直径密度と周波数の定量化により、開窓の経験的測定が可能になり、老化疾患、毒素、または治療法によって誘発される変化の測定が可能になります。灌流手順に続いて、組織は、細胞の超微細構造、ミトコンドリア構造を調べるための透過型電子顕微鏡などの他の技術のために処理することができます。

また、組織学にも使用できます。