Name: 走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶ走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞の開窓分析の標準化手法。灌流固定、脱水、スパッタリング後、ImageJで開窓径・頻度・開孔率を定量化し、肝機能と病理学研究に貢献します。

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注：動物の使用を含むすべての手順は現地の法律に従って行われます。私たちの仕事はシドニー現地保健地区動物福祉委員会によって承認されています。許可された手順は、プロジェクトのライセンスのドキュメントに記載されており、すべての回で、動物の福祉を確保するためのガイドラインに従っています。作業が行われている国の動物実験に関する法律の遵守を確認してください。 EM固定剤を調製するための1プロトコル<ol><li>固定液100mlを、磁気撹拌機で絶えず撹拌しながら、三角フラスコに蒸留水25ミリリットル、65ºCの熱パラホルムアルデヒド粉末2gを添加することによって、パラホルムアルデヒドを準備します。 注：グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびカコジル酸ナトリウム緩衝液は、すべての有害物質であり、常に換気フード内で処理する必要があります。 </li><li> 2分間65ºCの熱は、その後冷却します。必要に応じて、水酸化ナトリウム溶液を加えるdropwISE完全に透明な溶液に、撹拌しながら。 注：水酸化ナトリウムは危険です、取り扱いに注意して。 </li><li> EMグレードの株式のグルタルアルデヒドの10ミリリットル、50の0.2Mカコジル酸ナトリウム緩衝液mlのショ糖の2グラムを追加し、マグネチックスターラーで攪拌します。 1.0 M CaCl 2を2ミリリットルを追加します。 </li><li>蒸留水で100mlにソリューションを構成するに先立ってpHを7.4に調整します。最終的な固定液は、2.5％のグルタルアルデヒド、2％パラホルムアルデヒド、2ミリモルのCaCl 2、0.1 Mカコジル酸緩衝液中の2％スクロースを含有します。総浸透圧が440ミリオスモル/ Lであることを確認してください。準備の24時間以内に使用してください。 </li></ol>肝臓の2灌流固定<ol><li> 37ºC - 35ウォーム灌流緩衝液および固定液。放血バッファおよび固定液の正確な温度は、組織の整合性を確保するのに役立ちます。 </li><li>を50mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジンの単回腹腔内注射で動物を麻酔し。 </li><li>動物は、下になったら後肢の引っ込めと尾のピンチによって評価深麻酔は、Yの切開は、肝臓と門脈を露出させるために、動物の腹部の平滑末端のはさみで作られています。 注：その機器が容易にSEMで見られます微生物や一般破片と試料の汚染を回避するために、クリーンであることを確認してください。 </li><li>他のより遠位の肝臓に、肝臓に門脈の周りに1近位に2つの非常に緩い縫合糸を結びます。 </li><li> （マウス用のラットで18 G、22 G）適切なサイズIVカニューレとカニューレを確保する.Tighten縫合糸を門脈にカニューレを挿入。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水で灌流を開始37ºCに加温し、そしてH 2 Oの10cmの圧力で行われます。 PBSの5〜20mlを、通常肝臓に放血するために必要とされます。 注：気泡は、彼らが塞栓と圧力に二次的アーティファクトを誘導するようにカニューレに接続されたチューブを介して肝臓に入力できるようにしないでください。肝細胞の損傷、SI灌流圧が高すぎるnusoidsとLSECの開窓が発生します。 </li><li>バッファは肝臓から自由に出ることができるように、腹部と胸部大静脈を切断。これは、のLSECに高い背圧による損傷を防止します。 </li><li>肝臓は血液の自由になると、EM固定剤を含むPBSを交換し、肝臓が硬化して非常に薄いされるまで、約5分間灌流。 </li><li>灌流を中止し、1に固定された肝臓をカット-鋭いメスを用いて2mmの3ブロック。 </li><li> 4ºCで72時間 - 24 EM固定剤でポストフィックス組織。 注：一般的に、underfixationはoverfixation以上のアーティファクトを引き起こします。 </li><li> 4ºCで保存、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液に接尾期間以下の固定液に変更します。 注：この方法で保存された試験片は（12ヶ月まで）かなりの時間のために保存されます、しかし、タイムリーな二次固定と検査は最良の結果を得るために推奨されています。 </li></ol> 3.ニードルPerfusion 注：ニードル固定は、直接生検肝組織に固定液を注入することを含む灌流固定の変形です。目的は、それらを放血し、固定液に組織ブロックのすべてを露出させるために、血管を通ってフラッシュする固定剤のためのものです。ケアは、圧力傷害18,19を回避するために低い注入圧力を保つように注意しなければなりません。 <ol><li>動物または被験体から肝臓の小片を除去し、血液や破片を除去するために生理食塩水ですすいでください。 </li><li>ファインゲージの針（典型的にはインスリン注射器）を取り付けたシリンジに通常の生理食塩水を描画します。 </li><li>血液が組織の外にフラッシュされるまで、肝臓に非常にゆっくりと生理食塩水を注入します。複数回の注射が必要な場合があります。 </li><li>ファインゲージの針（典型的にはインスリン注射器）を取り付けた別のシリンジにEM固定剤を描画します。 </li><li>それはハードで色は黄褐色になるまで肝臓に非常にゆっくりと固定液を注入します。頻回注射sが必要とされ得ます。 </li><li>鋭いメスを用いて2mmの3ブロック- 1に固定された肝臓をカット。 72時間4℃ - 24のためのEM固定剤でインキ​​ュベートします。二次固定を開始する前に、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で3回洗浄します。 </li></ol>走査型電子顕微鏡4.準備<ol><li>洗浄サンプル、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中で3回。脂質を修正するには、ポストは2時間、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の2％四酸化オスミウムのサンプルを修正します。 注：グルタルアルデヒドと四酸化オスミウムの交差反応し、SEMのアーティファクトを生成するように完全な洗浄は非常に重要です。 </li><li>脱水を開始するために、エタノールの濃度を増加さでサンプルをすすぎます。 5分間、50％エタノールで洗い流し、その後、70％エタノールで5分間3回、 90％のエタノールで5分間、3回すすぎ、 100％エタノールで5分間2回リンス。そして最後に100％エタノール（分子篩）中で10分間2回リンス。 </li><li>サンプルからすべてのエタノールを除去<html>と換気フードにヘキサメチルジシラザン（HMDS）と交換し、10分間のままにします。組織サンプルからHMDSを削除し、蒸発させます。 注：したがって、最終脱水工程のために使用する前に室温に到達させるときに冷たいHMDSは非常に吸湿性です。 </li><li>必要に応じて、すぐにサンプルをマウントするか、SEMのためにマウントする準備ができるまでデシケーターに入れます。 </li></ol> 5.取り付け注：正しい試料取付は、SEMで分析のために利用可能な明確に線引き正弦波の数を最大化します。 <ol><li>金属SEMスタブのベースにラベルを付け、スタブの先頭に両面導電性カーボンテープを適用します。 </li><li>後続のSEMのための最良の正弦波で表面を識別するために、解剖顕微鏡を用いて試料を可視化。スタブのカーボンテープ表面に上向きにその表面を置きます。 </li><li>スティック片をしっかりとスタブに、標本は今スパッタコーティングの準備ができています。 </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6。塗装注：スパッタコーター敷地内に試料を導電性金属（金、プラチナ）の緻密な膜で試料を塗布し、電子ビームによる損傷から保護します。コー​​ティングが厚すぎると、目的の構造が隠されてもよいです。 <ol><li>回転および45秒間自動スパッタコーティングにモードを設定する自動微細スパッタコーターの真空チャンバ内に配置スタブ。しかし、金にも適しており、細かいディテールのためにプラチナコーティングを使用してください。 </li><li>被覆するために、正弦波の表面を注意していないながら、取り付けられ肝臓検体の外部表面にカーボン塗料の薄い層を適用します。 </li><li>標本はプラチナでコーティングされており、炭素塗料が乾燥した後、彼らは、SEMの観察の準備ができています。サンプルをデシケーター中で保存することができます。 </li></ol>前記走査型電子顕微鏡を使用して<ol><li>場所は、走査型電子顕微鏡に標本や真空に顕微鏡を返します。&lt;/ LI&gt; <li>低倍率で開始することによって試料の可視化のための標準的な顕微鏡の操作手順を使用して、徐々に倍率を増加させます。 </li><li>顕微鏡は、距離、スポットサイズと非点収差を操作するための適切に調整されていることを確認。 </li><li>固定の整合性をチェックします。 LSECは、隙間からほとんどが無料で、30測定開窓が含まれている場合 - これは、一般的に試料作製に成功したことを示す250 nmの直径を。 </li><li>正弦波は、ギャップの完全または開窓を欠いている場合には、試料調製は成功していないか、重大な病状があります。この場合には、非常に微細なかみそりの刃でサンプルをスライスし、切断面は、重ね塗りし、正常に固定された正弦波を分析しました。 </li><li>約15,000〜20,000倍の倍率で良好な定着と開窓が明確に（表示されている場合に典型的には、少なくとも10開窓を含むとデブリのない平らなLSECの表面を選択）。 </li><li>肝臓あたり少なくとも二つのブロックを使用して、ブロックの異なる領域から、肝臓あたり少なくとも10正弦波の画像を保存します。 15,000で10顕微鏡写真をサンプリング - 開窓の定量化は、肝臓全体の代表であるために、動物あたり20,000倍の倍率は、一般的に十分です。 </li></ol> 8.分析注：NIHから無償でダウンロードすることができますImageJソフトウェアは、開窓径と周波数（定量化するために利用される<a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ijを</a> ）。 <ol><li>画像を開くJと（ 画面は、1ショット ）画像に埋め込 ​​まれたスケールバーを使用してスケールを設定します。 </li><li> ImageJの中のポリゴンツールを使用して、有窓とdefenestrated領域を含むLSECの全体の平坦な領域の周りにトレース。これは誤って気孔率を膨らまれるように、単にふるいプレートをトレースしません。 obscuriかもしれない細胞表面にあるデブリのいずれかの大規模な作品を除外NGの開窓。 </li><li> 、開窓径を測定ラインツールを選択することにより、各開窓の最大直径を通る線をトレースして、ラインを測定するために「M」を押し、「D」永久に画像上に線を描画する（描きます）。この行は、開窓の直径として定義されます。線の長さは、現在のImageJ（ スクリーンショット2）の結果ボックスで利用できるようになります。 </li><li> 250 nmのオーバーLSEC細胞質内で大きく穴であるすべてのギャップを測定し、同様に開窓。ギャップはギャップがまた、疾患および毒性の結果として発生する可能性がありますが、多くの場合、貧しい灌流または固定を反映した工芸品です。ギャップのデータは、後の分析における開窓パラメータの計算から除外されます。 </li><li>円形でないギャップの面積は、ギャップの周りトレースとImageJの上での面積を計算することによって計算されるべきです。 </li><li> furtheためのExcelスプレッドシートにはImageJに結果ボックスからデータを貼り付けR解析。 </li></ol> 9.計算<ol><li> （ギャップは≥250 nmであるギャップを含まない）、すべての開窓径の平均開窓径=平均。 </li><li>開窓面積=πR2、R、半径は、ギャップを含まない、個々の穿孔の直径（R = D / 2）から計算されます。 </li><li>気孔率（％）=（Σ（πR2）/分析総面積-ギャップのΣ（面積=））（μmの2））×100。 </li><li>開窓周波数=ギャップの（面積）（μmの2） - Σ分析開窓/（総面積の合計数。 </li></ol>開窓データの10プレゼンテーション注：開窓データの定量化を含め、可能な限りの資料は、以下の情報を含める必要があります。 <ol><li>使用境界の直径は、典型的には、（開窓を定義するために何を確認するステートメントと開窓直径、NM 250）、開窓周波数（数個/μm2）と空隙率（％） - 50との間。 </li><li>ギャップが分析に含まれているかどうかを確認するステートメント、開窓直径肝臓、ブロック、イメージおよび穿孔の数の度数分布のグラフは、分析に含まれるべきです。 </li></ol>

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<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li>
<li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li>
<li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

正確かつ再現肝類洞内皮の状態を測定する能力は、これらの非常に特殊化した細胞の生物学を理解する上で重要なステップです。このような構造化照明顕微鏡32などの新しい技術、原子間力顕微鏡33とD-STORM（直接確率光学Reconstrucion顕微鏡）34は、 インビトロでこれらの細胞の形態に関する重要な情報を付与しますが、SEMはにその構造を視覚化し、測定するために主要な方法論のままその場で 。 最も重要と技術的に困難なステップは、初期固定である：肝臓がよく保存されている場合は後続のステップは、肝臓の正弦波の画像を容易に観察し、確かに、美しい生成されます。肝臓全体の灌流は良好な定着性を確保するための最も有効な方法であるが、同等の結果はすぐに修正されている針灌流サンプルが可能です低圧下で。脱水肝臓サンプルによる水の吸収が悪いSEM像のための別の一般的な理由ですが、これは簡単に乾燥剤とのデシケーター内のサンプルを適切に保管することによって回避することができます。 ...

肝類洞内皮細胞（のLSEC）は、高度の肝正弦波の壁を覆う内皮細胞を分化されます。のLSECを非diaphragmedある穿孔で穿孔され、経細胞は、直径50〜250 nmの細孔。のLSECの表面の最大20％が篩板1-3（ 図1）と呼ばれる数十〜数百のグループに通常は穿孔によって覆われています。開窓は非常に効率的限外濾過システムを作成し、血液と肝細胞との間にプラズマとnanosubstratesの転送を可能にします。開窓は動的構造である - それらのサイズおよび/または数の両方は、種々の生理学的状態、薬物、および疾患に応じて変更することができます。例えば、開窓は摂食状態4よりも絶食が大きいです。 2ジヨードアンフェタミンは開窓の数を増加させ、5,6および細胞あたり穿孔のサイズおよび数の減少は、加齢および多くの疾患状態7-13で起こります</sup&gt;。穿孔のサイズと数の正確な測定は、LSECの形態は、種々の疾患、毒性、および生理学的状態に影響される方法を理解するために重要です。肝機能に及ぼす影響。および開発するための治療的介入1を開窓を調節。 開窓の研究は困難です。開窓の直径は、両方の無傷の肝臓組織または培養のLSECに電子顕微鏡を用いて、先にのみ観察が可能であった、従来の光学顕微鏡の解像度の下にあります。走査型電子顕微鏡（SEM）は、最も頻繁に、SEMは、数千の内皮表面と測定の大部分の観察を可能にするために開窓サイズ、周波数及び気孔率（開窓によって穿孔さLSEC膜の割合）を研究するために使用されていますそうでない場合は数十開窓の何千もの。その有用性にもかかわらず、結果がために、SEMベースの研究から報告されますこのような開窓大きさ、数、周波数および多孔性などのLSECのパラメータは、文献（ 表1）に大きく異なります。 開窓とふるい板は、契約、ブレーク拡張または試料調製中に合体壊れやすい構造であり、このように慎重な処理は、それらの整合性を維持するために必要とされます。上昇灌流圧14;固定液およびバッファ15の誤った浸透圧;不十分な固定または固定時間。とポストの固定、脱水、乾燥の速度は超微細構造の保存（ 図2）と干渉アーティファクトを生成することができるSEMのための処理のすべての領域です。開窓の損失（「窓外放出 &#39;）と開窓収縮が減少し開窓径および細胞間隙率で、その結果、貧困層の固定の結果として発生する可能性があります。 SEM分析のための試料の保存性を向上させる方法は、先に15-17に記載されていると説明されますここでは、試料の保存性を改善する方法についての追加のヒントを。試料保存の主な目標は、LSECの表面を可視化することができるように、正弦波から血液を除去し、高圧または遅延固定のいずれかからLSECの損傷を回避するためです。門脈を介して固定液の全肝灌流は、肝臓固定するための好ましい方法です。詳細に説明したように他の場所で16,18灌流が低圧で行われなければならない（例えば、H 2 0 10 cm）のLSECに圧力関連灌流遺物や損傷を回避するためには、典型的には、細胞膜における内などの大きなギャップを明らかに。他の箇所19で詳細に説明したようしかし、合理的な固定は、多くの場合、ヒトおよび動物の肝生検の針灌流を使用して得ることができます。血液試料からフラッシュされるまで、この技術は、直接組織に固定液を注入することを含むと組織がしっかりと固定されています。電子顕微鏡用試料の固定はPERFする必要があります肝臓極めて迅速自己分解プロセスの結果として生じる微細構造の変化を防止するための血流の停止後、できるだけ速やかにormed。 我々は、アーチファクトの混入を最小限に抑え、かつ開窓の測定を標準化する画像解析の方法をも提供します。多孔性および開窓周波数について顕微鏡写真用正弦波の選択の変化、アーティファクトの画像解析、およびセル面積の測定は、公表された結果の主な相違につながっています。開窓とデータ表示のための最小要件の評価および測定のための標準化されたアプローチは、明らかに以前4,10,20-31文献で ​​扱われていません。

<table><tbody><tr><td>25% EMグレードのグルタルアルデヒド</td><td>ProSciTech</td><td>C001</td><td>必要になるまでストックを-20°Cで保管し、再凍結を避けてください</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>158127</td><td>常にパラホルムアルデヒドの新鮮な</td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム粉末</td><td>を準備します シグマ・アルドリッチ</td><td>C0250</td><td>0.2 Mストック、pH 7.4 粉末をdH2Oに溶解することにより、主に0.1 Mで1:2希釈を調製して使用します</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>粉末をdH2</>Oに溶解して1 M CaCl2を調製</td></tr>します オス<tr><td>ミウムトレトロキシド</td><td>ProSciTech</td><td>C011</td><td>汚染を避けるために、使用前にアンプルを弱酸で洗ってください。ガラス瓶に2%のストックを準備し</td></tr><tr><td>ます エタノール- アブソリュート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>459836&nbsp;</td><td>100% エタノールは高品位でなければならず、モレキュラーシーブで保管する必要があります</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Labtech</td><td>EL5</td>の他のグレード <td>dH2Oヘ</td></tr><tr><td>キサメチルジシラザン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>52619&nbsp;</td><td>使用前に室温に戻してください</td></tr><tr><td>Cannulas</td><td>Terumo</td><td>TSROX1832C、TSROX2225C、TSROX2419C</td><td>18 Gはほとんどのラットに適しています、22 Gはほとんどのマウスに適していますが、非常に小さなマウスの場合には、手元にいくつかの24 Gを持っているのが良いです</td></tr><tr><td>導電性カーボンテープ</td><td>ProSciTech</td><td>IA0201</td><td></td></tr><tr><td>カーボンペイント</td><td>ProSciTech</td><td>I003</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td></td><td></td><td>ライセンスに基づいて取得する必要があります</td></tr> キシ<tr><td>ラジン</td><td></td><td></td><td>ライセンスに基づいて取得する必要があります</td></tr><tr><td>モレキュラーシーブ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>208647</td><td>100% エタノールから水を取り除きます</td></tr></tbody></table>

走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

肝臓の正弦波内皮細胞は肝臓への入り口であり、その経細胞開窓は、血液からの小さな溶解した物質を肝臓実質にスムーズに移動させ、代謝と処理を行うことを可能にします。開窓は動的な構造であり、そのサイズや数の両方がさまざまな生理学的状態、薬物、および疾患に応じて変化する可能性があるため、調節の重要なターゲットになります。LSECの形態がさまざまな疾患、毒性、生理学的状態によってどのように影響を受けるか、またこれらの変化が肝機能にどのように影響するかを理解するには、開窓のサイズと数を正確に測定する必要があります。この論文では、再現性のある試料調製と正確な解釈を確保するために当研究室で使用されている走査型電子顕微鏡の固定および処理技術について説明します。その方法には、灌流固定、二次固定および脱水、走査型電子顕微鏡の調製および分析が含まれます。最後に、標準化された画像分析のための段階的な方法を提供し、この分野のすべての研究者に利益をもたらします。

走査電子顕微鏡による低倍率での初期の可視化は、多くの大規模な肝血管および正弦波（ 図1A）を観察するのに十分な大き露出面積と肝臓試料の平らな面を明らかにする。実装スタブの正しい肝臓ブロック配置を確保することが、この理由（ 図1B）のために避けるべきである正弦波と肝臓のグリソン鞘の鮮明な画像を得るために必須です。倍率を大きくすると、肝臓の密な血管構造の精密検査を可能にし、血管（ 図1C）を分割し、肝細胞の単一細胞プレートを明らかにする。悪い画質、血液細胞および残骸における肝結果の悪い固定肝臓（ 図1D）の視野を不明瞭。 また、倍率を大きくすると、LSECの開窓（ 図2A）の観察を可能にします。これは、正弦波がCORRていることが不可欠です<html> ectly特定さ-肝細胞のプレートは、ある状況下で、このような姿勢（ 図2B）を支援細管胆汁などの血管が、機能のように見えることができ...

有孔肝正弦波内皮細胞は、さまざまな病気、毒素、生理学的状態の影響を強く受ける生物学的に重要なフィルターシステムです。これらの変化は肝機能に大きな影響を与えます。これらのセルの開窓のサイズと数の測定を標準化する方法について説明します。

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

この手順の全体的な目的は、肝類洞内皮を分析することです。まず、肝臓を摘出し、固定液で灌流させることでこれを達成します。次に、電子顕微鏡観察の準備として、肝臓をブロック状に切断し、脱水処理を行います。その後、肝臓サンプルにスパッタコーティングを施し、電子顕微鏡で観察します。最後に、電子顕微鏡写真を解析し、窓孔の直径と頻度、および空隙率を算出します。最終的に、電子顕微鏡を用いて、さまざまな条件下における肝類洞内皮の変化を示します。本手法により、肝血管内皮の超微形態および形態学的構造に関する知見を得ることができます。同様の手法を用いて、腎臓や脳の解析を行うことも可能です。動物を使用するすべての手順は、地域の法律に従って実施されています。本研究は、シドニー地方保健区動物福祉委員会の承認を得ています。許可されている手順はプロジェクトライセンスの文書に記載されており、常に動物の福祉を確保するガイドラインに従っています。本 procedure は非生存手術です。テキストプロトコルに従って固定液を調製した後、灌流緩衝液と固定液を 35 to 37 °C に温めてください。ケタミンとキシラジンを腹腔内へ単回投与して動物を麻酔した後、後肢の逃避反射と尾部へのピンチ刺激により鎮静レベルを確認します。次に、鈍端剪刀を用いて動物の腹部にY字切開を加え、肝臓と門脈を露出させます。その後、門脈の肝臓近位側と遠位側の2か所に、非常に緩い結紮糸をそれぞれ結びます。適切なサイズのIVカニューレを用いて門脈に挿管します。次に、縫合糸を締めてカニューレを固定します。続いて、37 °Cに加温した5～20 mLのPBSを用い、10 cm H2Oの圧力で灌流を開始します。肝臓内に気泡が入らないように注意してください。気泡が入るとアーティファクトが生じ、また気圧が高くなりすぎて肝臓を損傷する可能性があります。腹腔静脈および胸腔静脈を 절断し、バッファーが肝臓から自由に流出するようにします。これにより、高い背圧による肝臓、類洞細胞、内皮細胞、またはLCCの損傷を防ぎます。肝臓から血液が完全に除去されたら、PBSを電子顕微鏡（EM）固定液に置き換え、肝臓が硬くなり、非常に白くなるまで灌流します。約5分間待ちます。その後、メスを使用して、肝臓を1〜2立方ミリメートルのブロック状に切り出します。固定液を用いて後固定を行ってください。組織を4 °Cで24～72時間固定します。次に、組織を0.1 MのナトリウムCate緩衝液に移し、走査型電子顕微鏡（SEM）で標本を観察するために、4 °Cで最大12ヶ月間保存します。テキストのプロトコルに従ってサンプルを脱水した後、解剖顕微鏡下で金属製SEMスタブの底面にラベルを貼り、スタブの上部に両面カーボンテープを貼付し、SEMに最適な類洞を持つ表面を特定するためにサンプルを観察します。選択した表面を上にしてレースをスタブのカーボントープ表面に置き、スタブにしっかりと貼り付けます。テキストプロトコルに従ってスパッタコーティングとSEMを実施した後、ImageJで画像を開き、画像内のスケールバーを用いてスケールを設定します。ImageJのポリゴンツールを使用して、窓状構造のある領域とない領域の両方を含むLSECの平坦な領域全体をトレースします。この際、窓状構造を遮っている可能性のある細胞表面上の大きなデブリは除外してください。窓状構造の直径を測定するには、ラインツールを選択し、各窓状構造の最も長い直径に沿って線を引きたい。Mキーを押して線を測定し、Dキーを押して画像上に線を恒久的に描画します。この線は窓孔径として定義され、Image Jの結果ボックスで利用可能になります。窓孔に加えて、LSEC細胞質における250 nanometers以上の大きな孔（ギャップ）をすべて測定してください。円形ではないギャップについては、その周囲をトレースし、Image Jを用いて面積を算出した後、結果ボックスのデータをExcelスプレッドシートに転記して面積を計算します。さらなる解析のために、以下の数式を用いて窓孔（フェネストレーション）の計算を行います。平均窓孔径は、すべての窓孔径の平均値とします。窓孔面積はπr²で算出され、ここでrは個々の窓孔径から算出されます。空隙率は、σπR²を分析した総面積（μm²）で除し、100を乗じた値で算出します。この計算からギャップの合計面積は除外してください。論文でデータを提示する際は、境界径を用いて窓孔（フェネストラ）を定義したことを明記した上で、窓孔径、窓孔頻度、および空隙率を記載してください。また、分析にギャップを含めたかどうかの記述に加え、窓孔径の頻度分布グラフ、肝ブロック数、および画像を提示してください。SEMによる低倍率像では、門脈域や中心静脈（central ES）を含む多くの大きな肝血管や類洞を観察するのに十分な広さの、肝標本の平坦な表面が確認できます（図参照）。肝臓ブロックをマウントスタブに正しく配置することは、類洞の鮮明な画像を得るために不可欠であり、類洞のあらゆる詳細を覆ってしまうグリソン鞘が写り込むことは避けなければなりません。そのため、ここで示すように、高倍率を用いることでLSECの窓辺（フェネストレーション）の観察が可能になります。肝細胞板は血管のように見えることがありますが、BLIなどの特徴が方向の特定に役立ちます。この図は、高い灌流圧が、SEM（走査型電子顕微鏡）下で容易に識別可能な内皮細胞の大きな隙間などのアーティファクトを引き起こす可能性があることを示しています。これはLSECのSIVプレートの合一によって生じると考えられています。核の直上の細胞膜を避け、LSECの表面下に膨らみとして観察される部分を避けることで、窓孔密度の算出と空隙率計算の精度を高めることができます。最終的に、LSECの窓孔径、密度、および頻度を定量化することで、窓孔の経験的な測定が可能となり、加齢、疾患、毒素、または治療によって誘発される変化を測定することができます。灌流手順の後、組織を透過電子顕微鏡などの他の手法で処理し、細胞の超微細構造やミトコンドリア構造を観察することが可能です。また、組織学に利用することも可能です。

a-standardized-method-for-analysis-liver-sinusoidal-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ない細胞株が存在しないと肝類洞内皮細胞（SECS）の研究は、動物から得られた初代培養細胞を使用して実行する必要があります。このメソッドは、その後の培養と実験のためのSECの浄化のための肝臓の消化および分画遠心法に依存しています。...

肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに

肝臓への白血球の動員は、固有の肝臓類洞内皮細胞で裏打ちされている肝正弦波の特殊なチャネル内に発生します。生理学的な剪断応力の条件下でヒト肝臓シヌソイド内皮を通過する白血球動員の位相差顕微鏡は、このプロセスの根底にある分子機構の解明を容易にすることができる。...

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

このプロトコルの目的は、肝臓から高生存率および肝細胞と類洞内皮細胞の高収率を取得することです。これは、灌肝門脈、肝細胞と類洞内皮細胞を取得する差動遠心分離の続くタイプ IV...

精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流

このプロトコルの目的は、説明されているマーカーを用いた肝臓内リンパ管の内皮細胞集団を識別するためにです。コラゲナーゼ IV と DNase...

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

ここでは、マウス大様の内皮細胞を直接観察する免疫蛍光染色のためのプロトコルを提示する。この技術は、異なる流れパターンでの内皮細胞の細胞および分子表現型を研究し、アテローム性動脈硬化症の発症に有用である。...

血管内皮細胞を直接観察するためにエンフェイス免疫蛍光染色を用いて

このプロトコルは、強力な3Dイメージング技術であるシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)を使用するための日常的な方法を概説しています。SBF-SEMヒンジの適用に成功し、適切な固定および組織染色技術に加え、イメージング設定を慎重に検討します。このプロトコルには、このプロセス全体に対する実用的な考慮事項が含まれています。...

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

ここでは、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)関連の肝細胞癌(HCC)ゼブラフィッシュモデルを生成して、肝臓の微小環境と免疫細胞の景観に対するコレステロール余剰の影響を研究する方法を紹介します。...

ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

本プロトコルは、肝臓 のin situ...

非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスにおける肝臓細胞外マトリックスの3Dイメージング

肝臓または他の組織の細胞から肝細胞細胞小器官間の膜接触部位の三次元的詳細を取得するための簡単で包括的なプロトコル。...

連続部電子顕微鏡を用いた肝細胞細胞内細胞小器官間接触部位の3次元特性評価

ここでは、最適化された差動超遠心法による肝癌組織由来の小さな細胞外小胞の濃縮について説明します。...

肝癌組織由来の微小細胞外小胞の濃縮法

学ぶ走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞の開窓分析の標準化手法。灌流固定、脱水、スパッタリング後、ImageJで開窓径・頻度・開孔率を定量化し、肝機能と病理学研究に貢献します。

走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法

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