ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

ここでは、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)関連の肝細胞癌(HCC)ゼブラフィッシュモデルを生成して、肝臓の微小環境と免疫細胞の景観に対するコレステロール余剰の影響を研究する方法を紹介します。

当社のゼブラフィッシュ肝がんモデルとプロトコルは、生体内顕微鏡を使用して、in vivoで非侵襲的に肝臓の微小環境と免疫ランドスケープを視覚化するユニークな機会を提供します。ゼブラフィッシュの幼虫の透明性は間違いなくこのシステムの主な利点であり、非侵襲的な生体内顕微鏡検査を実行し、肝臓などの深部組織や臓器の微小環境と免疫細胞の浸潤に関する洞察を得ることができます。私たちの食事誘発ネフローゼモデルとこのプロトコルに記載されているイメージング技術は、メタボリックシンドロームや心血管疾患を含む他の肝疾患や研究分野における複雑な細胞間相互作用に簡単に適用できます。

手順を実演するのは、私たちのラボ技術者であるカシアマイケルと、私の研究室のポスドクであるフランシスコフアンマルティネスナバロ博士です。まず、ゼブラフィッシュの幼虫用の4グラムの市販のドライフードダイエットを2つの25ミリリットルのガラスビーカー(1つは通常の食事用、もう1つは10%高コレステロールダイエット(HCD)用)に計量します。10ミリリットルのガラスビーカーに0.4グラムのコレステロールを量り、ビーカーをホイルで覆います。

ドラフト内で、20ゲージの針を備えた10ミリリットルのシリンジを使用して、5ミリリットルのジエチルエーテルを測定します。次に、ジエチルエーテルを通常のダイエットビーカーに加え、すぐにヘラを使用してドライフードと混ぜます。同じ注射器と針を使用してさらに5ミリリットルのジエチルエーテルを測定し、HCD含有ビーカーに追加します。

シリンジで上下に吸引してすぐに混ぜます。コレステロール溶液をHCDビーカーにすばやく加え、溶液が均一になるまですぐにスパチュラで混ぜます。ビーカーをフードに最大24時間置いて、ジエチルエーテルを完全に蒸発させます。

翌日、乳棒と乳鉢を使って食事を微粒子に粉砕します。各食事を小さなラベルの付いたビニール袋または50ミリリットルの遠心分離管に移し、摂氏マイナス20度で保管します。マイナス1日目にトランスジェニックフィッシュラインを設定します。

0日目に、魚が産卵した後、メッシュストレーナーで卵を集めます。E3の入ったウォッシュボトルを使用して、卵をよくすすぎ、E3培地を入れた10センチのペトリ皿に慎重に移します。微生物の制御されない成長とその結果としての幼虫の発育の欠陥を避けるために、死んだ卵や未受精の卵を含む、繁殖ボックスに蓄積した可能性のあるすべての破片のプレートをきれいにします。

次に、25ミリリットルのE3を含む皿あたり70または80個の卵の密度で卵を分けます。初日目に、死んだ胚または発達障害のある胚を、透過照明ベースを備えた解剖スコープでチェックしてきれいにします。5日目に、すべての皿の幼虫を15センチメートルのペトリ皿に入れ、メチレンブルーなしでE3を加えます。幼虫を給餌箱に分け、テキスト原稿に記載されているように給餌します。

幼虫をゼブラフィッシュルームまたはインキュベーターで摂氏28度の暗闇のサイクルで保管し、5日目から12日目まで1日2回給餌します。1ミリリットルのピペットチップに取り付けられた真空システムを使用して、毎日、および培地の90〜95%の食品の破片を取り除きます。次に、幼虫を傷つけないように、メチレンブルーを含まない新しいE3を給餌ボックスの片隅に注意深く注ぎます。

あるいは、幼虫をシステム水の入った3リットルのタンクに分割し、水流の少ないスタンドアロンのシステムユニットとして配置することもできます。この代替手段は、毎日の洗浄プロセスに必要な時間を節約し、ろ過システムは、エンドポイントまで幼虫を健康に保つのに役立ちます。13日目に、設定した実験条件の数に応じて収集皿を準備します。

各皿の底を覆うのに十分なE3をメチレンブルーなしで注ぎます。次に、慎重に、真空システムを使用して、給餌ボックスから水を吸引します。水位が低くなり始めたら、給餌ボックスをゆっくりと持ち上げて幼虫を角の1つまで泳がせ、反対方向に吸引します。

約20〜30ミリリットルの液体しか残ら、幼虫を準備したコレクションペトリ皿に慎重にデカントし、給餌ボックスからラベル付きテープを皿の蓋に置きます。蛍光実体顕微鏡で、麻酔をかけた幼虫をスクリーニングして目的の蛍光マーカーを探します。次に、トリカインE3を創傷および閉じ込め装置のチャンバーに追加します。

P-200マイクロピペットを使用して、チャンバーと拘束チャネルから気泡を取り除きます。余分なトリカインE3をすべて取り除き、チャンバーを満たすのに十分な量だけを残します。次に、麻酔をかけた幼虫を創傷および閉じ込め装置の装填室に移し、まつげツールを使用して左葉の画像化のために配置します。

テキスト原稿に記載されているように、共焦点顕微鏡下で肝臓のすべての必要なすべての細胞の形態を画像化します。フィジーソフトウェアを開きます。次に、画像ファイルを開き、[バイオフォーマットインポートオプション]タブから[チャンネルの分割]オプションにチェックマークを付けます。

各チャネルの最大強度投影を作成した後、幼虫の肝臓を囲むROIを作成し、肝臓の面積を測定します。次に、参照としてスケールバーを追加し、肝臓領域と周辺領域の75マイクロメートルを含む2番目のROIを作成します。プラグインメニューで、[分析]オプションを選択し、[セルカウンター]を選択して、募集エリア内の免疫細胞をカウントします。

募集された免疫細胞の数をスプレッドシートに記録します。肝臓面積あたりの免疫細胞の数を正規化することにより、好中球、マクロファージ、およびT細胞の密度を計算します。通常の食事を与えられたHCCゼブラフィッシュ幼虫は、オイルレッドO染色によって測定されるように、肝脂肪症を示さない。

しかし、HCDを与えられたHCC幼虫は、肝脂肪症の有意な増加を示す。余剰コレステロールへの8日間の曝露後、HCC幼虫で肝臓肥大が観察された。肝腫大を評価するために、肝臓面積、肝臓表面積、および肝臓容積を評価しました。

非アルコール性脂肪性肝炎関連HCCでは、肝細胞領域と核領域、および核対細胞質比が増加しました。核循環度の有意な減少は、高脂肪食を与えられたHCCグループでも観察されました。H2B-mCherryマーカーを使用すると、HCDを与えられたHCC幼虫で小核の発生率が高くなりました。

肝血管系評価は、HCDを与えられたHCC幼虫において血管密度の有意な増加を示した。マクロファージと好中球の浸潤は、HCCとHCD幼虫を与えられたHCCの両方で発生しました。肝臓およびその近傍のマクロファージにおける好中球の定量化は、HCDを与えられたHCC幼虫における細胞の数および密度の有意な増加を示した。

対照的に、HCDを与えられたHCC幼虫では、全体の数のT細胞密度の有意な減少が観察されました。タンクの洗浄と給餌は、幼虫の生存能力を確保し、水質の悪さや不適切な給餌による対照における脂肪症や肝臓、全身性慢性炎症の発症を回避するための最も重要なステップです。タイムラプス顕微鏡法や肝臓に生息する異なる細胞間の相互作用の分析などの他の方法でも実行できます。

さらに、さまざまな肝がんの病期で解剖された肝臓の単一細胞RNAシークを実行して、肝臓の免疫ランドスケープが疾患の進行とともにどのように進化するかを完全に理解することができます。