Name: ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュを用いたNASH関連肝細胞癌モデルにおける肝微小環境と免疫細胞動態の非侵襲的イメージング手法。このプロトコルは生体内での肝臓病態と免疫相互作用の詳細解析に有用です。

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著者は、ゼブラフィッシュ系統の支援と保守のために、アルバートアインシュタイン医科大学ゼブラフィッシュコア施設の技術者であるクリントンデパオロとスパルタクカリニンに感謝したいと思います。FJMNは、Cancer Research InstituteとFibrolamellar Cancer Foundationの支援を受けています。

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

HCC、特にNASH誘発HCCの発生率の増加に伴い、NASH関連HCCに関与する細胞および分子メカニズムを研究するためのより効率的なモデルを持つことが非常に重要です。肝臓での細胞間相互作用のデコンボリューションは、肝疾患の進行と肝発癌をよりよく理解するために重要です。このプロトコルに記載されているアプローチは、 in vivo および非侵襲的に肝疾患の進行を分析する独自の方法を提供します。
食事の準備は、NASH関連HCCモデルの確立の成功に不可欠です。ゼブラフィッシュの食事を準備しながら、有害な影響を避けるためにジエチルエーテルをヒュームフード内で完全に蒸発させることが重要です。幼虫(受精後5〜12日)でこれらの食事を使用するには、幼虫による食物摂取を確実にするために、食事を微粒子に粉砕することが非常に重要です。蛍光タグ付き脂肪酸類似体の使用は、幼虫における食物摂取量を評価するために使用することができる。
幼虫を飼育ボックスに入れて給餌手順を開始する前に、異なるプレートからの幼虫を混合することによって実験サンプリングが均一化されていることを確認することが重要です。0日目から始まるさまざまな微小環境が各プレートで促進され、炎症反応に影響を与える可能性があるため、このステップは重要です。
もう一つの重要なステップは、幼虫を数えて、各給餌箱に必要な食物の量を知ることです。食物の量が各箱に存在する幼虫の数に対して十分でない場合、2つのシナリオのうちの1つが発生します:1)幼虫は不足しています。2)幼虫は食べ過ぎになります。不正確な摂食は、炎症などの栄養失調や栄養過剰に関連する不健康な状態につながり、肝臓の微小環境に大きな影響を与えます。不正確な摂食が発生した場合、幼虫は動きの問題を示します。この発達段階では、幼虫は集中的に泳いでいるはずなので、動きの問題に気付いた場合、幼虫は不健康な条件(栄養失調または過剰摂取による有毒な量のコレステロールへの曝露)で飼育されました。このため、給餌手順は、通常の食事とコレステロールが豊富な食事の両方について厳密に管理する必要があります。肝腫大(肝臓サイズ)の存在や組織や臓器、特に肝臓や腸の炎症(好中球やマクロファージの浸潤の目に見える増加)など、幼虫の摂食と健康状態の正確さに迅速に対処するために、いくつかのアッセイを実行できます。
E3の95%の毎日の洗浄と交換は、給餌ボックス内の微生物の増殖を減らし、幼虫の健康と生存を改善するために極めて重要です。あるいは、幼虫をスタンドアロンラックシステムに配置することもできます。最良の結果を得るには、60〜80匹の幼虫を3リットルのタンクに入れます。流れを高速滴下モードに調整し、幼虫に1日2回(AMとPM)3〜4 mgを与えることにより、水の流れを最小レベルに保ちます。各タンクの正しい流れを確保するために、水の流れを定期的にチェックする必要があります。私たちの研究室では、この方法は、10%HCDの短期給餌で95〜100%の生存率をもたらします。さらに、この方法は、記載された静的給餌プロトコルに必要な日常の洗浄および水交換に固有の作業負荷を大幅に軽減した。
短期間の曝露でNASHを誘発するために10%コレステロール強化食を利用しましたが(脂肪性肝炎を誘発するには5日で十分です)、食事の変更を実行して拡張することができますフルクトース 18、脂肪酸(パルミチン酸など)19、または4%コレステロール強化食を使用して延長できる給餌プロトコル20。現在、HCCの治療標的はほとんどなく、NASHの治療標的も成功していません。ゼブラフィッシュモデルの使用は、肝発がんに関する知識を拡大するユニークな機会を提供するだけでなく、大規模なスループットの薬物スクリーニングを実行するための比類のない脊椎動物システムも提供します。このプロトコルに記載されている技術は、肝疾患および肝発癌の将来の発見および治療標的を促進するであろう。

肝細胞がん(HCC)は、治療選択肢が限られている侵攻性のがんです。HCC患者の30%以上が肥満であり、NAFLD1,2,3,4の攻撃的な形態であるNASHを患っていることがわかっています。カロリーが豊富な食事を摂取すると、脂肪酸の利用可能性が劇的に増加し、局所的および全身的な代謝シフトを引き起こし、脂肪症、肝細胞損傷、炎症、および線維症を引き起こします-NASHのすべての重要な特徴。HCCへのNASHの進行は、肝臓での脂質の蓄積を伴い、それが炎症を引き起こし、免疫細胞組成を変化させます5,6,7。肝疾患の進行中に肝微小環境と免疫細胞の景観がどのように変化するか、および特定の病因によってどのように変化するかを理解することは、特に興味深く重要です。余剰コレステロールが肝臓の微小環境と免疫細胞の景観に与える影響をよりよく特定するために、NASH関連HCCの独自のゼブラフィッシュモデルを開発しました。このモデルを使用することで、食事と栄養過多が肝臓の微小環境と肝疾患の進行に与える影響をよりよく理解できるようになりました。
マウスやヒト組織サンプルなどの哺乳類モデルは、脂肪性肝炎および脂肪症の病因を理解する上で不可欠でした8。マウスは肝疾患や癌の好ましいモデルですが、細胞レベルでの光学的透明度に欠けていますが、人間の組織サンプルには、動物モデルが模倣できる3D環境がないことがよくあります。これらの障害により、ゼブラフィッシュは研究コミュニティの強力なモデルになりました。ゼブラフィッシュは人間と著しく類似しており、少なくとも70%の遺伝子保存があります。それらは、肝臓の微小環境、肝細胞組成、機能、シグナル伝達、および傷害への反応を維持します9,10。高コレステロール食(HCD)とHCCの確立されたトランスジェニックゼブラフィッシュモデルを組み合わせて、NASH関連HCCのゼブラフィッシュモデルを開発しました。
ここでは、NASH関連HCCゼブラフィッシュモデルを生成する方法と、肝臓の微小環境を研究し、in vivoで初期の悪性腫瘍の特徴に対処する方法を説明するプロトコルを提示します。非侵襲的共焦点顕微鏡と、蛍光タグが付けられた肝細胞膜および核を有するゼブラフィッシュトランスジェニック株を組み合わせることで、肝臓の形態(面積、体積、表面積)、細胞および核の形態(肝細胞面積、核面積、N:C比、核循環度、小核/核ヘルニアスコアリング)、血管新生(血管密度)を分析することにより、初期の悪性腫瘍の特徴に対処することができます。免疫細胞の微小環境も肝発がんの重要な特徴であるため11,12,13,14、したがって、タグ付き免疫細胞(好中球、マクロファージ、およびT細胞)を持つトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を使用して、NASH関連HCC幼虫の肝臓免疫細胞組成を分析する方法も示します。記載された技術は、モデルに固有であり、肝疾患進行における肝微小環境および免疫細胞組成を評価するのに非常に有用である。

<table><tbody><tr><td>コレステロール</td><td>シグマ</td><td>C8667-25G</td><td>は簡単に分解されます。ストア-20°C。</td></tr><tr><td>コーニングNetwellsキャリアキット15ミリメートル</td><td>フィッシャー07-200-223</td><td></td><td></td></tr>コー<tr><td>ニングネットウェルインサートフィ</td><td>ッシャー07-200-212</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>フィ</td><td>ッシャー60-046-380</td><td>高揮発性。</td></tr><tr><td>デュモン鉗子#55デュモスター</td><td>フィッシャー</td><td>NC9504088</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドパスツールピペット5.75in</td><td>フィ</td><td>ッシャー22-183624</td><td></td></tr><tr><td>4%パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ゴールデンパールダイエット5&ndash;50 nm アクティブ スフィア</td><td>ブライン シュリンプ ダイレクト</td> <td>-</td> <td>幼虫用の市販の乾燥粉末食品であれば何でも使用できます。</td></tr><tr><td>目盛り付きトランスファーピペットフィ</td><td>ッシャー22-170-404</td><td></td><td></td></tr>イ<tr><td>ソプロパノール</td><td>フィッシャー</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>PBS、pH7.4、10X、10パック</td><td>クリスタルゲン</td><td>221-1422-10</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿100X20MM</td><td>フィッシャー08-747D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリカイン</td><td>シグマ</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン20</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP337-500</td><td></td></tr><tr><td>オイルレッドO溶液0.5%イソプロパノール</td><td>シグマ</td><td>O1391-500ML</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン</td><td>シグマ</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン20</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP337-500</td><td></td></tr><tr><td>バキューム</td><td>トラップVWR76207-630</td><td></td>幼<td>虫コレクション用真空システム</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M205 FCA THUNDERイメージャーモデル生物大型</td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点顕微鏡</td>ニ<td>コンニコン</td><td>ニコンCSU-W1</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td>ライ<td>カ</td><td>S9i、透過照明ベース</td><td></td></tr><tr><td>付きSoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>オープンソースJava画像処理プログラム。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イマリス9.6</td><td>ビットプレーン;オックスフォードインストゥルメンツ。</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

肝臓がんは現在、世界のがん関連死因の3番目に多い原因であり、肝細胞がん(HCC)はすべての肝臓がん症例の75〜90%を占めています。B / C型肝炎を予防および治療するための効果的な治療法の導入により、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、および非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)として知られるより攻撃的な形態は、現代社会でHCCを発症する最大の危険因子に急速になりつつあります。NASHがHCCの開発に果たす役割をよりよく理解するために、NASH関連のHCCゼブラフィッシュを設計しました。ゼブラフィッシュの幼虫の光学的透明度と遺伝的扱いやすさは、非侵襲的な蛍光ライブイメージングを使用して肝臓の微小環境と免疫細胞組成を研究するための魅力的で強力なモデルになります。このプロトコルでは、NASH関連HCCゼブラフィッシュモデルを使用して、肝臓微小環境における余剰コレステロールの影響と、疾患の初期段階での免疫細胞組成への影響を調査する方法について説明します。まず、肝細胞特異的活性化β-カテニンを発現するHCC幼虫(s704Tg)に10%高コレステロール食を8日間給餌し、NASH関連HCCモデルを開発しました。ここでは、肝臓領域、細胞、核形態(肝細胞領域、核領域、核:細胞質比(N:C比)、核円形度、小核/核ヘルニアスコアリング)や血管新生など、非侵襲的共焦点顕微鏡によって肝臓のいくつかの初期悪性腫瘍の特徴を評価するために、さまざまなトランスジェニックラインを利用する方法について説明します。次に、タグ付き免疫細胞(好中球、マクロファージ、およびT細胞)を有するトランスジェニック株を用いて、NASH関連HCC幼虫における肝免疫細胞組成を分析する方法を示します。記載された技術は、初期の肝発癌段階で肝臓微小環境および免疫細胞組成を評価するのに有用であるが、他の肝疾患モデルにおいてそのような特徴を研究するために改変することもできる。

肝細胞癌(HCC)ゼブラフィッシュモデルに短期間の高コレステロール食を導入することにより、肝細胞特異的構成活性型のベータカテニン(s704Tg;Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17では、NASH関連HCCの非哺乳類脊椎動物モデルを作成することができます。肝疾患の進行は、肝脂肪症、肝サイズ、肝細胞、核形態、血管新生、免疫細胞浸潤を測定することで早期にモニターできます(図1)。
通常の食事を与えられたHCC幼虫は、オイルレッドO染色によって測定された、軽度の肝脂肪症を示さない。しかし、高コレステロール食を与えられたHCC幼虫は、肝脂肪症の有意な増加を示しています(図2)。
肝疾患のよく知られたマーカーは肝腫大17です。肝臓のサイズを評価するために、HCC幼虫は、Tg(fabp10a:H2BmCherry)などの肝細胞に蛍光マーカーを特異的に発現するトランスジェニック系統と交配することができます。肝腫大を評価するために、肝臓面積(2D)、肝臓表面積、および肝臓容積(3D)の評価が行われます。余剰のコレステロールへの曝露の8日後、肝肥大はHCC幼虫において観察された(図3)。
非侵襲的なライブイメージングを使用して、肝細胞膜(Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP)など)および肝細胞核(Tg(Fabp10a:H2B-mCherryなど)で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックフィッシュラインを使用して、肝細胞の悪性腫瘍に関連する細胞および核の形態変化を評価できます。肝細胞面積は、NASH関連HCC(図4A、B、D)、ならびに核領域(図4C、E)および核:細胞質比(図4F)で増加しました。核の円形度の有意な減少は、HCD+HCCグループでも観察されました(図4G)。脂肪毒性は、小核の存在下での発がんの特徴であるDNA損傷を引き起こします。H2B-mCherryマーカーを使用して、高コレステロール食を与えられたHCC幼虫で小核の発生率が高いことを観察しました(図4H)。
肝血管系は、血管系を標識するTg(kdrl:mCherryまたはTg(fli:EGFP)などのトランスジェニックタグラインを使用して、ゼブラフィッシュモデルで簡単に評価できます。HCC + HCD幼虫では血管密度の有意な増加が観察されました(図5)。
NASH関連HCCの初期に誘発される炎症反応を観察するために、Tg(mfap4:tdTomato-CAAX;lyz:BFP)などのマクロファージおよび好中球に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックフィッシュラインをHCCトランスジェニックラインとアウトクロスしました。好中球とマクロファージの浸潤は、HCCとHCDを与えられたHCCの両方で発生し、肝臓とその周辺(最大75μmの周囲)の好中球/マクロファージの数と密度を定量することによって評価しました(図6A-H)。それにもかかわらず、HCC + HCDは好中球の数と密度の有意な増加を示しました(図6F-H)。受精後13日目に、適応免疫システムはすでに機能しています。Tg(lck:EGFP)などのT細胞で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックフィッシュラインを使用し、HCCトランスジェニックラインと組み合わせて使用 する。T細胞の肝臓への動員に対するコレステロール過剰の影響を評価しました。HCDを与えられたHCC幼虫では、T細胞密度と全体の数の有意な減少が観察されました(図6I-K)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>トランスジェニックゼブラフィッシュ系統</td>
			<td>ZFINリファレンス</td>
			<td>試験</td>
		</tr><tr><td>キャスパー</td>
			<td>ロイA9;ミトファW2</td>
			<td>肝脂肪症</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus / fabp10a:H2B-mCherry )</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg</td>
			<td>肝臓の形態学</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg</td>
			<td>肝細胞と核形態</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / y1Tg</td>
			<td>血管 新生</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:金星; mfap4:トマト-CAAX;lyzC:BFP)</td>
			<td>s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg</td>
			<td>マクロファージと好中球の動員</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / cz1Tg</td>
			<td>T細胞リクルートメント</td>
		</tr></tbody></table>表1:異なるアッセイで使用するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>幼虫の数</td>
			<td>給餌ボックスサイズ</td>
			<td>一日あたりの食物量(mg)</td>
			<td>E3 容量 (ml)</td>
		</tr><tr><td>30-40</td>
			<td>小型飼育ボックス</td>
			<td>3-4</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>60-80</td>
			<td>小型/大型飼育ボックス</td>
			<td>6-8</td>
			<td>400</td>
		</tr><tr><td>100-150</td>
			<td>大きな飼育ボックス</td>
			<td>10-15</td>
			<td>500</td>
		</tr></tbody></table>表2:給餌ボックスの条件を設定します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>表現型</td>
			<td>採点方法</td>
		</tr><tr><td>何一つ</td>
			<td>正常核、小核またはヘルニアなし</td>
		</tr><tr><td>軽度</td>
			<td>小核の数が少ない(視野あたり5未満)および/またはヘルニア</td>
		</tr><tr><td>中等度/重度</td>
			<td>中等度から多数の小核(視野あたり5個以上)および/またはヘルニア</td>
		</tr></tbody></table>表3:小核と核ヘルニアのスコアリング。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig01.jpg"> 図1:主な実験ステップと分析アプローチをまとめたプロトコル図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig02.jpg"> 図2:肝脂肪症の対照アッセイ-ORO染色。 HCC幼虫に正常または高コレステロール食を与え、肝脂肪症を評価するためにオイルレッドO(ORO)染色を実施した。(a)メッシュウェルインサートを用いて逐次ORO染色を行う12穴プレートの図。(B)幼虫を操作するために使用されるまつげ道具の画像。(C)オイルレッドで染色された肝臓の代表的な画像。HCCおよびHCC + HCD幼虫。(D)肝脂肪症のスコアが異なる幼虫の割合を示すカイ二乗グラフ。スケールバー= 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig03.jpg"> 図3:肝臓サイズからの代表的な画像。 肝臓マーカー(Tg(fabp10a:H2B-mCherry))を発現するトランスジェニックHCC幼虫を、zWEDGIを用いて倒立スピニングディスク共焦点顕微鏡上で生きて非侵襲的にイメージングした。(A)HCCおよびHCC + HCD幼虫における肝臓の代表的な3D再構成。(B-D)HCCおよびHCC+HCD幼虫における肝面積(B)肝表面積(C)および肝臓容積(D)を含む肝臓形態変化を示すグラフ。スケールバー = 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig04.jpg"> 図4:肝細胞と核形態からの代表的な画像。 肝細胞膜(Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP)および肝細胞核(Tg(fabp10a:H2B-mCherry))で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックHCC株をイメージングしました。(A-C)HCCおよびHCC + HCD幼虫のFアクチンおよび肝細胞核の代表的な3D再構成。開いた矢印は拡大した核を示しています。白い矢印は、形を変えた核を示しています。赤い矢印は小核と核ヘルニアを示しています。(D-G)HCCおよびHCC+HCDの13日齢幼虫における細胞および核パラメータの平均を示すグラフ。(D)肝細胞領域。(e)原子力地域。(F)核:細胞質比。(G)核の循環性。各ドットは幼虫あたりの平均を表します。ドットプロットは、小核と核ヘルニアのスコアが異なる幼虫の割合を示す平均±SEM(H)カイ二乗グラフを示しています。スケールバー = 10 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig05.jpg"> 図5:肝血管系からの代表的な画像。 肝細胞核(Tg(Fabp10a:H2B-mCherry)および内皮細胞(Tg)fli:EGFP)で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックHCC株。(A)HCCおよびHCC + HCD幼虫における肝血管系の代表的な3D再構成。(B-C)HCCおよびHCC+HFCD幼虫における肝表面積(B)体積(C)による血管密度指数を示すグラフ。ドットプロットは平均±SEMを示します。 スケールバー= 50μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig06.jpg"> 図6:肝免疫細胞ランドスケープからの代表的な画像。 マクロファージおよび好中球(Tg(mfap4:tdトマト-CAAX;lyz:BFP)またはT細胞(Tg(lck-EGFP))で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックHCC株。(A,C,F)13日齢のHCCおよびHCC + HCD幼虫の肝臓領域への肝臓および白血球動員の代表的な3D再構成。(B)画像化された肝臓領域の図。(D-E)HCCおよびHCC+HCD幼虫における肝臓面積におけるマクロファージ密度(D)および数(E)を示すグラフ。(G-H)HCCおよびHCC+HCD幼虫における肝臓面積における好中球密度(G)および数(H)を示すグラフ。(G)HCCおよびHCC + HCD幼虫の肝臓領域へのT細胞動員の代表的な3D再構成。(H-I)HCCおよびHCC+HCD幼虫における肝臓領域におけるT細胞密度(H)および数(I)を示すグラフ。ドットプロットは平均±SEMを示しています。 スケールバー= 50μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:バッファーとソリューションの表 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/JoVE_Table_of_buffersandsolutions.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)関連の肝細胞癌(HCC)ゼブラフィッシュモデルを生成して、肝臓の微小環境と免疫細胞の景観に対するコレステロール余剰の影響を研究する方法を紹介します。

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

当社のゼブラフィッシュ肝がんモデルとプロトコルは、生体内顕微鏡を使用して、in vivoで非侵襲的に肝臓の微小環境と免疫ランドスケープを視覚化するユニークな機会を提供します。ゼブラフィッシュの幼虫の透明性は間違いなくこのシステムの主な利点であり、非侵襲的な生体内顕微鏡検査を実行し、肝臓などの深部組織や臓器の微小環境と免疫細胞の浸潤に関する洞察を得ることができます。私たちの食事誘発ネフローゼモデルとこのプロトコルに記載されているイメージング技術は、メタボリックシンドロームや心血管疾患を含む他の肝疾患や研究分野における複雑な細胞間相互作用に簡単に適用できます。手順を実演するのは、私たちのラボ技術者であるカシアマイケルと、私の研究室のポスドクであるフランシスコフアンマルティネスナバロ博士です。まず、ゼブラフィッシュの幼虫用の4グラムの市販のドライフードダイエットを2つの25ミリリットルのガラスビーカー(1つは通常の食事用、もう1つは10%高コレステロールダイエット(HCD)用)に計量します。10ミリリットルのガラスビーカーに0.4グラムのコレステロールを量り、ビーカーをホイルで覆います。ドラフト内で、20ゲージの針を備えた10ミリリットルのシリンジを使用して、5ミリリットルのジエチルエーテルを測定します。次に、ジエチルエーテルを通常のダイエットビーカーに加え、すぐにヘラを使用してドライフードと混ぜます。同じ注射器と針を使用してさらに5ミリリットルのジエチルエーテルを測定し、HCD含有ビーカーに追加します。シリンジで上下に吸引してすぐに混ぜます。コレステロール溶液をHCDビーカーにすばやく加え、溶液が均一になるまですぐにスパチュラで混ぜます。ビーカーをフードに最大24時間置いて、ジエチルエーテルを完全に蒸発させます。翌日、乳棒と乳鉢を使って食事を微粒子に粉砕します。各食事を小さなラベルの付いたビニール袋または50ミリリットルの遠心分離管に移し、摂氏マイナス20度で保管します。マイナス1日目にトランスジェニックフィッシュラインを設定します。0日目に、魚が産卵した後、メッシュストレーナーで卵を集めます。E3の入ったウォッシュボトルを使用して、卵をよくすすぎ、E3培地を入れた10センチのペトリ皿に慎重に移します。微生物の制御されない成長とその結果としての幼虫の発育の欠陥を避けるために、死んだ卵や未受精の卵を含む、繁殖ボックスに蓄積した可能性のあるすべての破片のプレートをきれいにします。次に、25ミリリットルのE3を含む皿あたり70または80個の卵の密度で卵を分けます。初日目に、死んだ胚または発達障害のある胚を、透過照明ベースを備えた解剖スコープでチェックしてきれいにします。5日目に、すべての皿の幼虫を15センチメートルのペトリ皿に入れ、メチレンブルーなしでE3を加えます。幼虫を給餌箱に分け、テキスト原稿に記載されているように給餌します。幼虫をゼブラフィッシュルームまたはインキュベーターで摂氏28度の暗闇のサイクルで保管し、5日目から12日目まで1日2回給餌します。1ミリリットルのピペットチップに取り付けられた真空システムを使用して、毎日、および培地の90〜95%の食品の破片を取り除きます。次に、幼虫を傷つけないように、メチレンブルーを含まない新しいE3を給餌ボックスの片隅に注意深く注ぎます。あるいは、幼虫をシステム水の入った3リットルのタンクに分割し、水流の少ないスタンドアロンのシステムユニットとして配置することもできます。この代替手段は、毎日の洗浄プロセスに必要な時間を節約し、ろ過システムは、エンドポイントまで幼虫を健康に保つのに役立ちます。13日目に、設定した実験条件の数に応じて収集皿を準備します。各皿の底を覆うのに十分なE3をメチレンブルーなしで注ぎます。次に、慎重に、真空システムを使用して、給餌ボックスから水を吸引します。水位が低くなり始めたら、給餌ボックスをゆっくりと持ち上げて幼虫を角の1つまで泳がせ、反対方向に吸引します。約20〜30ミリリットルの液体しか残ら、幼虫を準備したコレクションペトリ皿に慎重にデカントし、給餌ボックスからラベル付きテープを皿の蓋に置きます。蛍光実体顕微鏡で、麻酔をかけた幼虫をスクリーニングして目的の蛍光マーカーを探します。次に、トリカインE3を創傷および閉じ込め装置のチャンバーに追加します。P-200マイクロピペットを使用して、チャンバーと拘束チャネルから気泡を取り除きます。余分なトリカインE3をすべて取り除き、チャンバーを満たすのに十分な量だけを残します。次に、麻酔をかけた幼虫を創傷および閉じ込め装置の装填室に移し、まつげツールを使用して左葉の画像化のために配置します。テキスト原稿に記載されているように、共焦点顕微鏡下で肝臓のすべての必要なすべての細胞の形態を画像化します。フィジーソフトウェアを開きます。次に、画像ファイルを開き、[バイオフォーマットインポートオプション]タブから[チャンネルの分割]オプションにチェックマークを付けます。各チャネルの最大強度投影を作成した後、幼虫の肝臓を囲むROIを作成し、肝臓の面積を測定します。次に、参照としてスケールバーを追加し、肝臓領域と周辺領域の75マイクロメートルを含む2番目のROIを作成します。プラグインメニューで、[分析]オプションを選択し、[セルカウンター]を選択して、募集エリア内の免疫細胞をカウントします。募集された免疫細胞の数をスプレッドシートに記録します。肝臓面積あたりの免疫細胞の数を正規化することにより、好中球、マクロファージ、およびT細胞の密度を計算します。通常の食事を与えられたHCCゼブラフィッシュ幼虫は、オイルレッドO染色によって測定されるように、肝脂肪症を示さない。しかし、HCDを与えられたHCC幼虫は、肝脂肪症の有意な増加を示す。余剰コレステロールへの8日間の曝露後、HCC幼虫で肝臓肥大が観察された。肝腫大を評価するために、肝臓面積、肝臓表面積、および肝臓容積を評価しました。非アルコール性脂肪性肝炎関連HCCでは、肝細胞領域と核領域、および核対細胞質比が増加しました。核循環度の有意な減少は、高脂肪食を与えられたHCCグループでも観察されました。H2B-mCherryマーカーを使用すると、HCDを与えられたHCC幼虫で小核の発生率が高くなりました。肝血管系評価は、HCDを与えられたHCC幼虫において血管密度の有意な増加を示した。マクロファージと好中球の浸潤は、HCCとHCD幼虫を与えられたHCCの両方で発生しました。肝臓およびその近傍のマクロファージにおける好中球の定量化は、HCDを与えられたHCC幼虫における細胞の数および密度の有意な増加を示した。対照的に、HCDを与えられたHCC幼虫では、全体の数のT細胞密度の有意な減少が観察されました。タンクの洗浄と給餌は、幼虫の生存能力を確保し、水質の悪さや不適切な給餌による対照における脂肪症や肝臓、全身性慢性炎症の発症を回避するための最も重要なステップです。タイムラプス顕微鏡法や肝臓に生息する異なる細胞間の相互作用の分析などの他の方法でも実行できます。さらに、さまざまな肝がんの病期で解剖された肝臓の単一細胞RNAシークを実行して、肝臓の免疫ランドスケープが疾患の進行とともにどのように進化するかを完全に理解することができます。

analysis-liver-microenvironment-during-early-progression-non

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ゼブラフィッシュの胆道による肝臓再生の根底にある分子メカニズムを評価するために、メトロニダゾール治療によりニトロレダクターゼを発現する肝細胞が遺伝的に除去される肝障害モデルを確立しました。...

胆道主導の肝臓の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおける肝細胞特異的アブレーション

過剰な細胞外マトリックスタンパク質の沈着を伴う持続的な線維症は肝硬変を引き起こします。アルコール乱用は、重度の肝疾患の主な原因の1つです。エタノールによるゼブラフィッシュの線維性肝臓モデルを確立し、アルコールによる傷害に対する肝細胞の再生促進のメカニズムと戦略を研究しました。...

前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発

ゼブラフィッシュは、食事の脂質処理と代謝性疾患の貴重なモデルとして浮上しています。脂質が豊富な幼虫の飼料のプロトコル、食事性蛍光脂質類似体のライブイメージング、および食物摂取量の定量化について説明します。これらの手法は、さまざまなスクリーニング、イメージング、および仮説主導の調査手法に適用できます。...

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

このプロトコールは、2％エタノールで24時間処理したゼブラフィッシュ幼虫からの肝臓の組織学的分析を記載する。このような急性エタノール処理は、肝臓脂肪症および肝臓血管系の腫脹をもたらす。...

ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

ここでは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を実証し、肝臓の成長と発達に対する遺伝的および薬理学的操作の効果を評価する方法を提供する。...

ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化

ここでは、異種移植片を生成するためのヒントと腫瘍行動分析、全実装免疫蛍光、共焦点イメージング定量のためのガイドラインを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。...

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

脱細胞化したラット肝臓の再細胞化細胞外マトリックスは、ウイルスまたはウイルスベクターの分布と導入遺伝子発現を研究するためのヒト化された3次元ex...

ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究

転移性クローンが遠く離れた場所にコロニーを形成する能力は、その増殖能力および/または大きな増殖なしに宿主の微小環境で生き残る能力に依存します。ここでは、転移性クローンによる両方のタイプの肝臓コロニー形成を定量的に可視化できる動物モデルを紹介します。...

肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ

臨床的に関連する大腸癌肝転移(CRLM)腫瘍モデルと、腫瘍増殖および転移における肝虚血再灌流(I/R)の影響について詳しく述べる。このモデルは、肝転移成長の手術誘発促進の根底にあるメカニズムをよりよく理解するのに役立ちます。...

虚血多灌流損傷の設定における転移性肝腫瘍のマウスモデル

オルソトピックヒト肝転移性ブドウ球色黒色移植マウスモデルは、培養ヒトブドウ色腫細胞株を用いた患者由来腫瘍チャンクおよび針注射技術を用いた外科的オルトトピック移植技術を用いて作成された。...

免疫不全マウスにおける肝直交細胞性ヒトうveal黒色腫異種移植プラットフォームの生成

学ぶゼブラフィッシュを用いたNASH関連肝細胞癌モデルにおける肝微小環境と免疫細胞動態の非侵襲的イメージング手法。このプロトコルは生体内での肝臓病態と免疫相互作用の詳細解析に有用です。

ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

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