ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析
2021年4月1日
ここでは、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)関連の肝細胞癌(HCC)ゼブラフィッシュモデルを生成して、肝臓の微小環境と免疫細胞の景観に対するコレステロール余剰の影響を研究する方法を紹介します。
当社のゼブラフィッシュ肝がんモデルとプロトコルは、生体内顕微鏡を使用して、in vivoで非侵襲的に肝臓の微小環境と免疫ランドスケープを視覚化するユニークな機会を提供します。ゼブラフィッシュの幼虫の透明性は間違いなくこのシステムの主な利点であり、非侵襲的な生体内顕微鏡検査を実行し、肝臓などの深部組織や臓器の微小環境と免疫細胞の浸潤に関する洞察を得ることができます。私たちの食事誘発ネフローゼモデルとこのプロトコルに記載されているイメージング技術は、メタボリックシンドロームや心血管疾患を含む他の肝疾患や研究分野における複雑な細胞間相互作用に簡単に適用できます。
手順を実演するのは、私たちのラボ技術者であるカシアマイケルと、私の研究室のポスドクであるフランシスコフアンマルティネスナバロ博士です。まず、ゼブラフィッシュの幼虫用の4グラムの市販のドライフードダイエットを2つの25ミリリットルのガラスビーカー(1つは通常の食事用、もう1つは10%高コレステロールダイエット(HCD)用)に計量します。10ミリリットルのガラスビーカーに0.4グラムのコレステロールを量り、ビーカーをホイルで覆います。
ドラフト内で、20ゲージの針を備えた10ミリリットルのシリンジを使用して、5ミリリットルのジエチルエーテルを測定します。次に、ジエチルエーテルを通常のダイエットビーカーに加え、すぐにヘラを使用してドライフードと混ぜます。同じ注射器と針を使用してさらに5ミリリットルのジエチルエーテルを測定し、HCD含有ビーカーに追加します。
シリンジで上下に吸引してすぐに混ぜます。コレステロール溶液をHCDビーカーにすばやく加え、溶液が均一になるまですぐにスパチュラで混ぜます。ビーカーをフードに最大24時間置いて、ジエチルエーテルを完全に蒸発させます。
翌日、乳棒と乳鉢を使って食事を微粒子に粉砕します。各食事を小さなラベルの付いたビニール袋または50ミリリットルの遠心分離管に移し、摂氏マイナス20度で保管します。マイナス1日目にトランスジェニックフィッシュラインを設定します。
0日目に、魚が産卵した後、メッシュストレーナーで卵を集めます。E3の入ったウォッシュボトルを使用して、卵をよくすすぎ、E3培地を入れた10センチのペトリ皿に慎重に移します。微生物の制御されない成長とその結果としての幼虫の発育の欠陥を避けるために、死んだ卵や未受精の卵を含む、繁殖ボックスに蓄積した可能性のあるすべての破片のプレートをきれいにします。
次に、25ミリリットルのE3を含む皿あたり70または80個の卵の密度で卵を分けます。初日目に、死んだ胚または発達障害のある胚を、透過照明ベースを備えた解剖スコープでチェックしてきれいにします。5日目に、すべての皿の幼虫を15センチメートルのペトリ皿に入れ、メチレンブルーなしでE3を加えます。幼虫を給餌箱に分け、テキスト原稿に記載されているように給餌します。
幼虫をゼブラフィッシュルームまたはインキュベーターで摂氏28度の暗闇のサイクルで保管し、5日目から12日目まで1日2回給餌します。1ミリリットルのピペットチップに取り付けられた真空システムを使用して、毎日、および培地の90〜95%の食品の破片を取り除きます。次に、幼虫を傷つけないように、メチレンブルーを含まない新しいE3を給餌ボックスの片隅に注意深く注ぎます。
あるいは、幼虫をシステム水の入った3リットルのタンクに分割し、水流の少ないスタンドアロンのシステムユニットとして配置することもできます。この代替手段は、毎日の洗浄プロセスに必要な時間を節約し、ろ過システムは、エンドポイントまで幼虫を健康に保つのに役立ちます。13日目に、設定した実験条件の数に応じて収集皿を準備します。
各皿の底を覆うのに十分なE3をメチレンブルーなしで注ぎます。次に、慎重に、真空システムを使用して、給餌ボックスから水を吸引します。水位が低くなり始めたら、給餌ボックスをゆっくりと持ち上げて幼虫を角の1つまで泳がせ、反対方向に吸引します。
約20〜30ミリリットルの液体しか残ら、幼虫を準備したコレクションペトリ皿に慎重にデカントし、給餌ボックスからラベル付きテープを皿の蓋に置きます。蛍光実体顕微鏡で、麻酔をかけた幼虫をスクリーニングして目的の蛍光マーカーを探します。次に、トリカインE3を創傷および閉じ込め装置のチャンバーに追加します。
P-200マイクロピペットを使用して、チャンバーと拘束チャネルから気泡を取り除きます。余分なトリカインE3をすべて取り除き、チャンバーを満たすのに十分な量だけを残します。次に、麻酔をかけた幼虫を創傷および閉じ込め装置の装填室に移し、まつげツールを使用して左葉の画像化のために配置します。
テキスト原稿に記載されているように、共焦点顕微鏡下で肝臓のすべての必要なすべての細胞の形態を画像化します。フィジーソフトウェアを開きます。次に、画像ファイルを開き、[バイオフォーマットインポートオプション]タブから[チャンネルの分割]オプションにチェックマークを付けます。
各チャネルの最大強度投影を作成した後、幼虫の肝臓を囲むROIを作成し、肝臓の面積を測定します。次に、参照としてスケールバーを追加し、肝臓領域と周辺領域の75マイクロメートルを含む2番目のROIを作成します。プラグインメニューで、[分析]オプションを選択し、[セルカウンター]を選択して、募集エリア内の免疫細胞をカウントします。
募集された免疫細胞の数をスプレッドシートに記録します。肝臓面積あたりの免疫細胞の数を正規化することにより、好中球、マクロファージ、およびT細胞の密度を計算します。通常の食事を与えられたHCCゼブラフィッシュ幼虫は、オイルレッドO染色によって測定されるように、肝脂肪症を示さない。
しかし、HCDを与えられたHCC幼虫は、肝脂肪症の有意な増加を示す。余剰コレステロールへの8日間の曝露後、HCC幼虫で肝臓肥大が観察された。肝腫大を評価するために、肝臓面積、肝臓表面積、および肝臓容積を評価しました。
非アルコール性脂肪性肝炎関連HCCでは、肝細胞領域と核領域、および核対細胞質比が増加しました。核循環度の有意な減少は、高脂肪食を与えられたHCCグループでも観察されました。H2B-mCherryマーカーを使用すると、HCDを与えられたHCC幼虫で小核の発生率が高くなりました。
肝血管系評価は、HCDを与えられたHCC幼虫において血管密度の有意な増加を示した。マクロファージと好中球の浸潤は、HCCとHCD幼虫を与えられたHCCの両方で発生しました。肝臓およびその近傍のマクロファージにおける好中球の定量化は、HCDを与えられたHCC幼虫における細胞の数および密度の有意な増加を示した。
対照的に、HCDを与えられたHCC幼虫では、全体の数のT細胞密度の有意な減少が観察されました。タンクの洗浄と給餌は、幼虫の生存能力を確保し、水質の悪さや不適切な給餌による対照における脂肪症や肝臓、全身性慢性炎症の発症を回避するための最も重要なステップです。タイムラプス顕微鏡法や肝臓に生息する異なる細胞間の相互作用の分析などの他の方法でも実行できます。
さらに、さまざまな肝がんの病期で解剖された肝臓の単一細胞RNAシークを実行して、肝臓の免疫ランドスケープが疾患の進行とともにどのように進化するかを完全に理解することができます。
概要
この研究は、肝臓の微小環境と免疫細胞の状況に対するコレステロール過剰の影響を調査するために、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）関連の肝細胞癌（HCC）のゼブラフィッシュモデルを提示します。
研究の主要な要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 腫瘍学
背景
- ゼブラフィッシュモデルは、生体内イメージングの独特な機会を提供します。
- ゼブラフィッシュ幼生の透明性により、非侵襲的な研究が可能になります。
- 肝疾患の理解は治療戦略の開発に不可欠です。
- コレステロール過剰は様々な肝臓病理と関連しています。
研究目的
- NAFLD関連のHCCを研究するためのゼブラフィッシュモデルを開発すること。
- 肝臓の微小環境と免疫細胞の相互作用を視覚化すること。
- 高コレステロール食が肝臓の健康に与える影響を評価すること。
使用された方法
- ゼブラフィッシュ幼生用の通常および高コレステロール食の準備。
- 肝臓の微小環境のイメージングに生体内顕微鏡法の使用。
- 肝臓の面積と免疫細胞密度の評価。
- Oil Red O染色を用いた肝臓脂肪症の評価。
主な結果
- 高コレステロール食を食べたHCCゼブラフィッシュ幼生は、著しい肝臓脂肪症を示しました。
- コレステロール曝露後に肝臓の肥大が観察されました。
- 肝臓の微小環境における免疫細胞の浸潤が定量化されました。
- 食事によるコレステロールは肝臓の形態と免疫反応に影響を与えます。
結論
- ゼブラフィッシュモデルは肝疾患の研究に効果的です。
- コレステロール過剰は肝臓の健康と免疫状況を著しく変化させます。
- このモデルは他の代謝および心血管研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Modeling early-stage NASH-associated hepatocellular carcinoma (HCC) in zebrafish enables non-invasive, quantitative analysis of liver microenvironment and immune cell dynamics. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence for target validation in liver disease and oncology pipelines. The platform's scalability and imaging capabilities facilitate translational continuity from discovery through preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of disease-relevant pathways in a live vertebrate system.
- Supports functional target validation by quantifying immune cell infiltration and liver morphology changes.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking cholesterol surplus to early malignancy features.
- Provides predictive confidence for prioritizing targets in NASH-HCC progression.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, optically accessible biological systems for downstream compound screening.
- Standardizes quantitative readouts such as liver area, nuclear morphology, and immune cell densities.
- Enables reproducible, high-content imaging assays for immune and microenvironmental endpoints.
- Supports scalable screening of genetic or pharmacological interventions in a disease-relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant biomarkers and immune signatures observed in human NASH-HCC.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation of immune-modulating strategies.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, in vivo phenotypes.
- Supports mechanistic studies of microenvironmental drivers of liver cancer progression.
Pipeline & Workflow Integration
This zebrafish model bridges early discovery, target validation, and preclinical research by enabling live, quantitative assessment of liver and immune phenotypes under defined metabolic stress.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the impact of cholesterol surplus and immune cell dynamics in early HCC.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging and cell quantification outputs for assay development.
- Analytics: Provides quantitative measurements of liver area, nuclear features, and immune cell densities for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns in vivo findings with human disease biomarkers and immune profiles.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse liver disease and oncology research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in liver disease modeling.
- Operational Value: Enables standardized, scalable, and reproducible imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing early, quantitative phenotypic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease and immuno-oncology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish genetics, live imaging, and quantitative image analysis.
- Needs access to confocal microscopy and image analysis software (e.g., Fiji).
- Demands cross-team standardization of feeding, imaging, and data analysis protocols.
- Adaptable to other liver disease models and immune cell markers with appropriate transgenic lines.
- Dependent on rigorous husbandry and environmental control to ensure reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:08
Preparation of 10% Cholesterol-Enriched Diet for Acute Cholesterol Surplus
2:29
NASH Induction with Short-Term Larvae Feeding with Cholesterol-Enriched Diet Static Conditions
4:22
Collection of 13 Days Post-Fertilization Larvae from Feeding Boxes
5:06
Non-Invasive Confocal Imaging Using the Zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging (zWEDGI)
5:54
Immune Cell Recruitment Analysis
6:49
Results: Monitoring Liver Disease Progression in the Hepatocellular Carcinoma (HCC) Zebrafish Model
8:30
Conclusion
