Name: リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶマウス肝臓からのリンパ管内皮細胞のフローサイトメトリー分離法。コラゲナーゼIVとDNase処理により単一細胞懸濁液を調製し、細胞表現型と機能を解析します。この手法は肝臓リンパ管生物学の理解に貢献します。

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著者は、このプロジェクトの金融支援のため消化管と肝臓生得免疫プログラムを感謝したいです。B.A.J.T. も R01 AI121209 によって資金を供給します。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) コロラド大学アンシュッツ メディカル キャンパスのによって承認されています。
1 材料の準備
<ol><li>DNase の 5 mg/mL の溶液を作るリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で。</li>
	<li>IV コラゲナーゼの 5,000 U/mL をクリックしての EHAA メディアに追加することによって消化の混合物を作る。</li>
	<li>使用する前に 30 分の 37 ° C で分解混合物を温めます。</li>
	<li>4.8% ウシ血清アルブミン (BSA) を追加することによって、分離バッファーを作るし、2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) にハンクス平衡塩類溶液 (HBSS)。</li>
	<li>塩化アンモニウム 100 mM、10 mM KHCO3、および 0.1 mM EDTA を蒸留 H2O を追加することによって赤血球 (RBC) 換散バッファーを作る</li>
</ol>2. マウス肝臓からの単一細胞懸濁液の準備
<ol><li>CO2と頚部転位マウスを安楽死させます。</li>
	<li>その毛皮をウェットを 70% エタノールでマウスをスプレーします。ピン マウスの解剖板に足。</li>
	<li>解剖はさみを使って、肌皮膚 (約 1 mm) だけをカットするように注意しながら、肛門の上約 1 cm をカットします。歯の鉗子で体から皮膚を引っ張るし、皮膚と腹膜の間ハサミを挿入します。腹膜から皮膚を分離し、その後、首の切開から皮膚をカットするはさみを開きます。</li>
	<li>各腕の下と各脚の上の 1 つのピンをしている郭清ボードに皮膚を固定します。腹膜嚢を引き上げ、首に向かって上向きにカットします。肝臓の葉をつかむし、胸骨のすぐ下をカットします。 注: 免疫組織染色 (IHC) の肝臓のいずれかを使用する場合は、注意をすべき。</li>
	<li>肝臓の周りカットしマウスから肝臓を削除、クリックしての EHAA メディアの 4 mL に置きます。</li>
	<li>メスを使用して、〜 1 mm の肝径部分をカットします。</li>
	<li>消化液 500 μ L と DNase の 500 μ L を追加私は肝臓に (2 mg/mL)。</li>
	<li>37 ° C で 30 分の肝臓を孵化させなさい15 分後に 5 mL のピペットを使用して液体を混ぜます。</li>
	<li>インキュベーションの 30 分後に 50 mL の円錐管に 100 μ m ストレーナー消化サンプルを転送します。</li>
	<li>1 mL シリンジのプランジャーをフィルターを介して残りの部分を軽く押します。</li>
	<li>5 mL の分離バッファーを持つフィルターを洗って、1 mL シリンジからプランジャーの背面にストレーナーを通して組織をゆっくりと。フィルターは分離バッファーの 25 の mL と洗浄されるまで、この手順を繰り返します。</li>
	<li>400 x gで細胞を遠心分離機の 5 分は慎重に上清を離れて吸い出しなさい。</li>
	<li>RBC 換散バッファーの 4 mL にペレットを再懸濁します。セル 5 分間室温で孵化させなさい。</li>
	<li>400 x gで 5 分間遠心分離バッファーの 10 ml セルを洗浄します。</li>
	<li>完全に肝臓の数を決定する検定のセルをカウントします。</li>
	<li>20 %iodixanol の 5 mL の細胞を再懸濁します、1 ml の PBS の層のそれら。</li>
	<li>300 x gブレーキなしの 15 分で細胞を遠心します。</li>
	<li>PBS と、iodixanol のレイヤーを削除、新しい 50 mL の円錐管に 100 μ m フィルターを介してそれらを配置します。</li>
	<li>400 x gで 5 分間遠心分離バッファーの 10 ml セルを洗浄します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、2% ウシ胎児血清 (FBS) を 500 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。</li>
</ol>3. 肝臓から単一細胞のフローサイトメトリーによる解析
<ol><li>検定とトリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを測定する顕微鏡を使用してセルをカウントします。トリパン ブルーの 10 μ L に 10 μ L のセルを追加したり、すぐに診断に入れますや生きている細胞を顕微鏡で (青ではない)。その後、あたりの細胞数を計算します。</li>
	<li>96 ウェル プレートの単一ウェルに残りの実質細胞の約 500 万の約数。</li>
	<li>400 x gで 5 分で細胞を遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、2 %90 μ L の PBS で細胞を再懸濁します FBS。</li>
	<li>PDPN (1: 200) 2.4G2 やアンチスパイウェア-CD16/32 (レバレッジ) x 10 の 10 μ L で希釈した反 CD31 (レバレッジ)、アンチ CD146 (1: 200) 抗 CD45 (レバレッジ) を追加します。 注:抗 CD16/32 標識抗体を使用した場合、Fc ブロック (2.4G2) が使用されていません。</li>
	<li>正と負のゲートを設定する必要があるには、各色のアイソタイプ コントロール抗体 (FMO) しみマイナス蛍光があります。</li>
	<li>ライブと死んだ細胞を決定するには、生存率マーカー (例えば、ゴースト赤 780) で染色します。4 ° C、30 分で細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>2 %100 μ L の PBS のセルを洗浄して政府短期証券。</li>
	<li>細胞の小さな因数を使って流れの cytometer のレーザーと補正の設定を調整します。それぞれの個々 の蛍光体、抗体なしで 1 つへの抗体と細胞を染色します。 注:によって使用されている流れの cytometer で補償行列は、スペクトル重複除去に備えます。</li>
	<li>Cytometer プローブ上にサンプル チューブを置き、収集、すべてのイベントを記録します。</li>
</ol>4. データ解析
<ol><li>側方散乱と前方散乱エリアを見て、「ライブ」の細胞生存率と粒度サイズ マーカー色素に基づくゲート。</li>
	<li>次に、CD45 鮮やかなバイオレット 510 と CD31 PerCp Cy5.5、アイソタイプ コントロールと FMO を使って正と負の集団を決定する CD45-CD31 陽性細胞のゲートを使用します。</li>
	<li>最後に、PDPN APC や CD16/32 FITC CD146 v450 を使用して、CD146-PDPN + または CD16/32 を取る-PDPN + 細胞は、再びアイソタイプ コントロールと FMO を使用して正と負の集団を決定します。これらの細胞は、LECs です。</li>
</ol>

<ol><li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li>
<li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li>
<li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740(2014).</li>
<li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771(2015).</li>
<li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li>
<li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4%28%2B%29+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li>
<li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+antigen+scavenging%2C+cross-presentation%2C+and+CD8%2B+T+cell+priming%3A+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li>
<li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+promotes+immune+tolerance+in+B16+melanomas+and+cross-presentation+of+tumor+antigen+by+lymph+node+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics.</a> Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).</li>
<li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li>
<li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li>
<li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+lymphatic+vessels%2C+not+blood+vessels%2C+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li>
<li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034(2017).</li>
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<li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989(2014).</li>
<li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+marker+podoplanin%2FD2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131(2010).</li>
<li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li>
<li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospero-related+homeobox+1+%28Prox1%29+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development%2C+injury+and+regeneration%2C+and+is+absent+from+%22oval+cells%22%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li>
<li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li>
<li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li>
<li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li>
<li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

免疫恒常性と調節で LECs の全体的な重要性は、最近光25に来てください。発表されたリンパの文献の多くは皮膚やリンパ節に焦点を当ててください。しかし、リンパ管は26体で発見され、したがって、異なる臓器の重要性の理解が必要です。セルごとに異なる表面マーカー、サイトカイン、ケモカイン、および転写因子などの細胞内タンパク質の同時発現を理解する肝で LECs を研究できる方法を紹介します。このメソッドは、表現型および肝臓で LECs の機能を評価し、健康と病気の間に今後の研究の役に立つでしょう。
肝臓で LECs の同定のためのハードルの 1 つは、他の細胞型と比較して比較的低い周波数です。肝細胞は、肝臓と流れの cytometer で肝臓を実行しているより少ない時間を必要とし、したがってより良い生存率を提供する前に、密度勾配 (iodixanol) を使用してこれらの細胞を削除の約 80% を構成します。LYVE1 + LSECs から肝臓の LYVE1 + LECs の人口を区別するために...

肝臓のリンパ管と LECs の役割はよくわかっていません。リンパ管肝1のポータル トライアド内にある病気の2の間に展開し、ほとんどは機能および肝臓内 LECs の表現型について理解されます。LECs3に主にあるマーカーの発見と恒常性と病気ニッチを異なる組織内でこれらの細胞の重要性は私達の理解の重要なギャップを埋めます。LECs は、T 細胞4,5,6,7,8、と直接相互作用によってリンパ節、転移性腫瘍周辺の公差を維持する上で主要な役割を持っています。9,10,11,12,13。 リンパ節で LECs は、渡り鳥樹状細胞14,,1516との相互作用を介して防御免疫を促進できます。したがって、特定組織と相互作用が存在するかもしれない LECs に複数のロールがあります。ただし、非常に少しは LECs が組織の免疫細胞と対話する方法または LECs が異なる器官システムでどのように機能するかについて理解したがって、肝臓や他の臓器内のセルごとごとに LECs を評価 LECs プログラムの組織特異的免疫の進歩につながる可能性があります。肝臓で LECs に焦点を当てて文献の多くはマーカーと形態17の 1 つまたは 2 つ使用して LECs を可視化する顕微鏡を使用して、ほとんどはフローサイトメトリー、しかし 1 つの調査を使用してセルごとに LECs を具体的に評価に行われています。肝類洞内皮細胞 (LSECs) と LECs18の違いを評価しました。フローサイトメトリーによる肝臓のレック集団を分析できることで、LEC の表現型の詳細な研究通常恒常性や病気の時にことができます。
フローサイトメトリーによる LECs を評価するには、複数の表面マーカーが必要です。通常、LECs は、プロスペロー関連ホメオ ボックス 1 の式 (Prox-1)、リンパ管の内皮細胞のヒアルロン酸受容体 1 (LYVE1) または顕微鏡を用いた血管内皮細胞増殖因子受容体 3 (VEGFR3) によって視覚化されます。しかし、肝臓では、これらのマーカーの発現は LECs を制限されません。肝で肝開発、再生、および傷害19時近接 1 を広く表現し、LYVE1 と VEGFR3 は肝類洞内皮細胞18によって表されます。リンパ節で LECs は、分化 (CD) のクラスターとしてフローサイトメトリーを使用して識別されます CD45、CD31 +、ポドプラニン + (PDPN)16。しかし、このアプローチは CD45-CD31 陽性細胞は、血管内皮細胞をキャプチャし、肝臓の血管内皮細胞の優勢な人口が LSECs ので、肝臓で LECs を分離するも最小限。したがって、他のマーカーは、豊富な LSEC 人口からまれな LEC の人口を区別するために必要です。CD16/32 (成熟した LSECs18によって表される)、CD146 (一般的な血管内皮細胞マーカーは主に肝類洞内皮細胞20リンパでない式には少し肝洞様毛細血管内で表現内皮細胞21) 候補マーカーします。
したがって、我々 は分離とフローサイトメトリー用上記のマーカー、CD45、CD31、CD146、CD16/32、および PDPN を利用した肝臓内 LECs を可視化法を最適化されています。IV コラゲナーゼの使用、DNase 1 と単一細胞懸濁液に肝臓消化機械的分離について述べる。非実質細胞 (NPC) と細胞残屑を除去するために分離の iodixanol の密度勾配の使用についても述べる。最後に、複数のマーカーを使用して、我々 は優勢なマーカーとしての PDPN と肝臓から LECs を識別するために最適な流れ cytometry ゲーティング戦略を決定します。

<table><tbody><tr><td>Clicks/EHAA media</td><td>Irvine Scientific</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington Biochemical corporation</td><td>LS002145</td><td>デオキシリボヌクレアーゼ 1</td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1)</td><td>BDbiosciences</td><td>562232</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗マウス CD146 (クローン ME-9F1)</td><td>Biolegend</td><td>134706</td><td>フルオレセインイソチオシアネート (FITC)</td></tr><tr><td>Pacific Blue 抗マウス CD31 (クローン 390)</td><td>Biolegend</td><td>102422</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 抗マウス CD31 (クローン 390)Biolegend</td><td></td> <td>102420</td><td>ペリジニン-クロロフィルタンパク質-シアニン 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td></tr><tr><td>APC 抗マウス PDPN (クローン 8.1.1)</td><td>Biolegend</td><td>127410</td><td>アロフィコシアニン (APC), ポドプラニン (PDPN)</td></tr><tr><td>APC/Cy7 抗マウス CD45 (クローン 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 抗マウス CD45 (クローン 30-F11)Biolegend</td><td></td> <td>103138</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗マウス CD16/32 (クローン 93)</td><td>Biolegend</td><td>101306</td><td>フルオレセインイソチオシアネート (FITC)</td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 抗マウス CD16/32(クローン 93)</td><td>Biolegend</td><td>101324</td><td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td></tr><tr><td>ghost red 780 viability dye</td><td>TONBO biosceinces</td><td>3-0865-T100</td><td></td></tr><tr><td>APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)</td><td>Biolegened</td><td>402102</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)</td><td>Biolegend</td><td>400531</td><td></td></tr><tr><td>FITC rat IgG2 (clone eBR2a)</td><td>ebioscience</td><td>1-4321-80</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスLYVE1(クローン223322)</td><td>R&D systems</td><td>FAB2125A</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスサイトケラチン(クローンEPR17078)</td><td>abcam</td><td>ab181598</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスF4/80(クローンCl:A3-1)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>MCA497</td><td></td></tr><tr><td>BSA (フラクションV)</td><td>Fischer</td><td>BP1600-100</td><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>ロバ</td>血清<td>ジャクソン免疫研究</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>E177</td><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) - RBC溶解バッファー用</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>フィッシャー</td><td>A687-500</td><td>RBC溶解バッファー</td></tr>用 <tr><td>重炭酸カリウム</td><td>フィッシャーP184-500</td><td>RBC溶解バッファー</td><td></td></tr>用 <tr><td>メス</td><td>フェザー</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;Fc</td>ガンマ+細胞への非特異的結合を阻害する社内のm細胞ス<td>トレーナーFischer</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2</td> / <td>ATCC</td><td>ATCC HB-197</td><td>FCブロック -ハイブリドーマ</td></tr><tr><td>から作られたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>コーニング21-040-CV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td><td>アトランタの生物学的製剤</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐形</td><td>Truline</td><td>TR2004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐形</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>1 mL ピペットチップ</td><td>USA scientific</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;Lピペットチップ</td><td>USA scientific</td><td>1110-1700</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;L ピペットチップ</td><td>USA scientific</td><td>1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>seriological 10 mL ピペット</td><td>greiner bio-one</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>セリロジカル 5 mL ピペット</td><td>greiner bio-one</td><td>606107</td><td></td></tr><tr><td>セルインキュベーター</td><td>フィッシャー</td><td></td><td>Heracell 160i</td></tr><tr><td>BD FacsCanto II フローサイトメーター</td><td>BD バイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>臨床遠心分離機</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td>のモデルX-14R</td></tr></tbody></table>

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

肝臓内ポータル トライアド内リンパ管に発見されてし、記述されている機能はリンパ節、肝臓から間質液を削除する細胞残渣および抗原を調査することができます。リンパ血管が炎症や肝臓内の免疫細胞の機能に関与する方法を理解することに非常に興味を持っております。しかし、ほとんどはリンパ血管内皮細胞 (LECs) 肝臓や肝臓の評価に使用することができます特定のマーカーからの分離のための消化力のプロトコルを確立する公開されているセルごとに LECs。したがって、消化や肝臓で LEC の人口を評価するために、肝臓の染色法を最適化されています。ここで概説している方法を LECs の肝臓からの単離、同定に役立つ LECs が肝の微小環境に応答する方法の私達の理解を強化して確信しております。

研究は、肝臓のリンパ管を分析は主に周波数と肝臓のリンパ管の直径を量的に免疫組織化学を使用しています。ただし、セルごとに LECs の評価または複数のマーカー、サイトカイン、ケモカイン、または転写因子の発現のためには、このメソッドはできません。したがって、我々 は尋ねたかどうか肝 LECs 肝臓から分離することができるし、フローサイトメトリーを使用して評価。Liberase DL (コラゲナーゼ私-II-と-dispase) と DNase 1 針14,16リンパ節組織の機械的分離と組み合わせてを使用してリンパ節 LECs を分離する前の作業を行った。したがって、肝組織に同じの消化力のプロトコルが使用された、または IV コラゲナーゼと DNase 1 を用いて肝22から免疫細胞分離のため、前に説明したとする密度勾配分離 (iodixanol) ステップと消化を続けて肝細胞を削除し、(<strong class...

このプロトコルの目的は、説明されているマーカーを用いた肝臓内リンパ管の内皮細胞集団を識別するためにです。コラゲナーゼ IV と DNase と組み合わせてフローサイトメトリー、リンパ管内皮細胞の明瞭な人口を識別するために、組織の穏やかなミンチを駆使しています。

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

この方法は、リンパ内皮細胞(LEC)が特定の刺激にどのように反応し、それが病気の病因にどのように寄与するかなど、リンパ管および肝臓分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、肝リンパ球内皮細胞表現型および機能を細胞ごとに評価することができ、細胞の選別後のダウンストリーム用途に使用できることです。この方法は、肝臓リンパ生物学への洞察を提供することができますが、皮膚や乳腺などの異なる組織からのリンパ性内皮細胞を評価するためにも使用できます。この手順を実証するには、私の研究室の専門研究アシスタントであるジェフリー・フィンロンです。単離した肝細胞からの単細胞懸濁液を調製するには、マウスに70%エタノールを吹き付け、足を解剖板に固定することから始めます。解剖はさみを使用して、アヌスの上約1センチメートルの皮膚を切断し、歯付き鉗子を使用して皮膚を体から離します。皮膚と腹骨の間にはさみの先端を挿入し、首まで皮膚切開を続ける前に、組織を分離するためにはさみを開きます。各前肢の下と各後肢の上の解剖板に皮膚を固定し、腹膜袋を上方に引っ張って首に向かって切開を伸ばします。肝臓の葉をつかみ、胸骨のすぐ下を切って肝臓の周りの解剖を可能にする。その後、クリックのEHAA培地の4ミリリットルに臓器を転送します.メスを使用して肝臓を直径約1ミリメートルに切り、作りたての消化液500マイクロリットルとDNase1の500マイクロリットルで断片を消化します。摂氏37度で15分後、500ミリリットルのピペットを使用して組織を完全に混合し、容器をさらに15分間保育器に戻します。インキュベーションの最後に、消化したサンプルを100ミクロンのストレーナーを通して50ミリリットルの円錐形チューブに移し、1ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、残りの組織部分をメッシュにそっと押し込みます。5ミリリットルの分離バッファーでフィルターを洗い、残りの組織をストレーナーにそっと押します。遠心分離によって単離された肝細胞を収集し、赤血球のリシスバッファーの4ミリリットルにペレットを再中断.室温で5分後、細胞を10ミリリットルの分離緩衝液で洗い、ヘモサイトメーター上の細胞を数えて完全な肝臓数を決定する。ペレットを20%のイオジキサノールの5ミリリットルで再懸濁し、細胞懸濁液を1ミリリットルのPBSで重ね合わせる。密度勾配分離により細胞を分離し、PBSとイオジキサノールの間の層を収穫する。その後、100マイクロメートルのストレーナーを通して細胞を新しい50ミリリットル円錐形チューブにフィルターします。新鮮な分離バッファーの 10 ミリリットルで細胞を洗浄し、得られたペレットを PBS の 500 マイクロリットルで再中断, 2% 牛血清、または FBS を補った.カウント後、アリコートアリコートは、遠心分離のための96ウェルプレートの各対照および実験井戸に約10〜6番目の非パレンチマル細胞を、PBSと1ウェルあたりFBSの90マイクロリットルでペレットを再中断する。適切な実験および対照一次抗体カクテルを各ウェルに加え、適切な生存マーカーですべてのウェルを染色します。この手順で最も重要なステップは、抗体の適切な滴定と、染色を検証するための氷型コントロールおよび蛍光-1コントロールの使用です。摂氏4度で30分後、遠心分離機は1ウェルあたり100マイクロリットルのPBSとFBSで細胞を洗浄し、各ウェルから個々の5ミリリットルの丸底フローサイトメトリーチューブに細胞を移し、PBSとFBS/チューブ当たり400マイクロリットルの最終体積に変換します。次に、少量のセルを使用して、フローサイトメーターのレーザーと補償の設定を調整し、各チューブのすべてのイベントを読み取ります。すべてのチューブが読み取られたら、適切なフローサイトメトリー解析プログラムにデータをインポートします。負の発現が生きていると見なされる生存マーカー色素に基づいて生細胞上のゲート。細胞のサイズと粒度、および生存マーカー染色発現に基づいて生細胞にゲートし、続いて適切なアイソタイプ制御および蛍光-1データを使用してCD45陰性CD31陽性細胞集団にゲートを付け、正および負の集団を決定する。その後、CD16/32およびポドプラニン発現に従ってCD45陰性CD31陽性細胞をゲートし、CD45陰性CD31陽性、CD16/32陰性ポドプラニン陽性リンパ管内皮、CD45陰性CD31陽性、CD16/32陽性ポドプラニン陰性肝内皮細胞の同定を可能にする。強調内皮細胞はリンパ管および内皮ヒアルロン1を発現するが、CD146は発現しない。肝単離されたCD31陽性CD16/32陽性細胞は、実証されたようにCD146陽性およびポドプラニン陽性であり、CD31陽性CD16/32陰性細胞は主にCD146陰性であり、ポドプラニン陽性または陰性である。陽性は、蛍光-1染色に基づいて決定した。肝臓リンパ球内皮細胞はCD146陰性およびPDPN陽性である。血管内皮もマウス肝臓マクロファージもポドプラニンを発現しない。ポドプラニン染色は、胆管の明確な核構造に基づくリンパ管からコリンジクサイトを区別するだけでなく、サイトケラチン7染色によっても使用することができる。リンパ管内皮細胞のみが肝臓で血管内皮成長因子受容体3とプロスペロホメオボックスタンパク質1を同時発現するように、これらのマーカーは、さらに、並べ替えられた肝臓リンパ管内皮細胞集団の純度を確認するために使用することができる。この手順を試みる間、迅速に作業し、氷の上に細胞を保つことを忘れないでください。この手順に従って、LEC 集団のフローソートのような他の方法は、LECの転写プロファイリングのような追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、肝臓固有のリンパ生物学の分野の研究者が、リンパ球がマウスとヒトの肝臓病にどのような影響を与えるかを探求する道を開いた。一般的に、この方法に新しい個人は、リンパ内皮細胞が肝臓でまれに、徐々に集団であり、方法を迅速に実行する必要があるため、苦労します。

digestion-murine-liver-for-flow-cytometric-analysis-lymphatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

直接収穫したてのマウスの骨髄、脾臓や胎児の肝臓における分化段階特異的マウス赤血球前駆細胞と前駆体の同定と分子解析のためのフローサイトメトリー法。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119、およびセルサイズに依存しています。...

CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

本論文では、大動脈の免疫成分を調査するために、フローサイトメトリーベースの方法を提示。本稿では、また別々に周囲の外膜と血管壁を調べることができる追加のテクニックを示しています。このメソッドは、大動脈白血球の表現型解析を実行し、アテローム性動脈硬化症の研究のためにいくつかの免疫学的アッセイを適用する可能性を開きます。...

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

これらの細胞がさまざまな腸および全身の疾患において重要な役割を果たすという認識が高まっているため、腸リンパ球の定量的特性評価への関心が高まっています。このプロトコルでは、その後のフローサイトメトリー特性評価のために、異なる小腸コンパートメントから単一細胞集団を分離する方法について説明します。...

マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

肝臓損傷は、不均一な細胞集団を表し、前駆細胞の増殖を伴います。この細胞区画の新規分類は、複数のサブセットの区別を可能にします。ここで説明する方法は、分析し、さらなるアッセイのために使用することができる種々のサブセットの高純度分離、フローサイトメトリーを示します。...

新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮

非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) に対する簡便で信頼性の高い食餌誘発げっ歯類動物モデルについては、特定の高脂肪食の動物及び投与の SPF...

2型糖尿病と関連した非アルコール性脂肪性肝炎のための高度なマウスモデル

このプロトコルは、単球、ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞を含む特定の眼単核貪食集団を同定するために、多パラメータフローサイトメトリック分析を目的として、目全体を単一細胞懸濁液に消化する方法を提供する。...

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

この研究では、マウス呼吸器系の免疫集団を単離するための効果的で再現可能なプロトコルを提示する。また、9色ベースのフローサイトメトリーパネルを使用して、健康なマウスの肺に存在するすべての自然免疫細胞および適応免疫細胞を同定する方法も提供しています。...

マウス肺の自然免疫細胞および適応免疫細胞の同定のためのフローサイトメトリー分析

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

本プロトコールは、マウスにおける十二指腸内栄養注入に応答して流れる腸リンパを単離するための詳細な外科プロトコールを記載する。これにより、様々な実験栄養素に応答した総腸脂質吸収およびカイロミクロン合成および分泌の生理学的決定が可能になる。...

食事脂質吸収とカイロミクロン分泌の in vivo 動態を定量化するためのマウスにおける流れる腸間膜リンパの分離

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。...

マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

このプロトコルは、インフルエンザ感染後のマウス肺からの生存免疫集団および非免疫集団の定常状態からの分離を詳述しています。また、上皮細胞および骨髄系細胞サブセットを同定するためのゲーティング戦略も提供します。...

マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

学ぶマウス肝臓からのリンパ管内皮細胞のフローサイトメトリー分離法。コラゲナーゼIVとDNase処理により単一細胞懸濁液を調製し、細胞表現型と機能を解析します。この手法は肝臓リンパ管生物学の理解に貢献します。

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

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