モーターと脳卒中とアルツハイマー病のトランスジェニックラットモデルにおける海馬依存性の空間学習とリファレンスメモリ評価

これらの行動テストの総合的な目的は、アルツハイマー病と脳卒中の新規併存ラットモデルにおいて、運動機能ならびに空間学習および記憶能力を評価することです。この手法は、脳卒中とアルツハイマー病の病理がどのように相互作用し、運動機能欠損の潜在的な増強や認知機能低下の加速という表現型をもたらすかなど、認知症分野における重要な疑問への回答に寄与します。これらの手法の主な利点は、実施が容易でコスト効率が高く、後の時点での反復テストに適している一方で、広範囲の脳機能をテストできる点にあります。

この手法の意義は、脳卒中後の認知症予防へと展開されます。なぜなら、新しい予防化合物を試験することで、併発する行動表現型を改善させる可能性を評価できるためです。まず、以前に設置したシリンダー装置の下に、鏡を45度の角度で配置します。次に、ビデオカメラを三脚に固定し、装置から約50 cmの距離に設置します。

ミラー内のシリンダーの直径全体がカメラで視認できることを確認します。次に、馴化させたラットを選択し、ホワイトボードに個体番号と追加の試行情報を記入します。このボードをミラーの前に配置し、ビデオカメラの録画ボタンを押します。

次に、ラットを尾の付け根を持って持ち上げ、シリンダーに入れます。その後、装置の蓋をしっかりと固定し、白いボードを取り除いて鏡を遮らないようにします。白いボードを除去したら、1回の試行に相当する5分間の動物の撮影を開始してください。

この時間が経過したら録画を停止し、ラットをホームケージに戻し、シリンダーをペーパータオルと水で洗浄します。その後、前述の手順をさらに2回繰り返し、1匹のラットにつき計3回の試行を行います。すべてのラットのデータ収集が完了したら、カメラファイルをビデオ編集ソフトにインポートし、テキストプロトコルに記載されている方法に従って、4肢の接触回数を定量します。

まず、黒い壁の前に2つの棚ユニットを約100 cmの間隔で配置します。次に、あらかじめ用意した木製の梁の両端をテープで棚に固定し、棚の間に約1 mの支持されていない木製部分ができるようにします。続いて、ビデオカメラをスタンドに設置し、梁の全長が撮影される位置に配置します。

ビーム歩行トレーニングセッションを終えたラットを選択し、個体番号と追加の試行情報をホワイトボードに記録します。記録が終わったら、ホワイトボードをビーム背後の壁にテープで固定します。次に、ビームの一端に、ラットがプランクを渡った直後にすぐに入ることができる動機付けのキューとして、動物のホームケージと環境エンリッチメントチューブを配置します。

次に、ビデオカメラの録画ボタンを押します。その後すぐに、ラットの尾の付け根を持って、ケージとチューブを取り除いたビームの反対側に置きます。動物が挙上された木製ビームの全長を正常に横切るまで録画し、これで試行終了となります。

ラットがビームの途中で停止した場合は、尾に軽く触れて移動を促してください。動物がタスクを完了したら、ホームケージをビームの反対端に移動させます。ホワイトボード上の試行回数を変更し、前述の手順に従って操作を繰り返します。

すべての動物の試行の記録が完了したら、ビデオ編集プログラムにカメラファイルをインポートし、テキストプロトコルに記載されている通り、関連するステップ数、肢の滑り、および落下データを分析します。まず、空の円形プールの中心上方にビデオカメラを固定します。次に、プールの縁にテープを貼ってタンクの4つの象限を指定し、トラッキングソフトウェアプログラム内のタンクの輪郭と正確に一致させます。

次に、タンクに36 cmの深さまで水を満たし、液が不透明になるまで毒性のない黒色塗料を加えます。これにより、水面下のプラットフォームが見えないようにし、白いラットをより容易に視認できるようにします。プールを準備できたら、周囲を空白の壁面で囲みます。その後、異なる色のポスターボードから4つの形状を切り出し、空間的手がかりを準備します。

その後、プールの北、南、東、西の各位置に対応する壁に、それぞれ1つずつ図形を取り付けます。空間学習実験を行うには、続けてプールの南西象限に円形のプラットフォームを設置します。付属のコンピュータープログラムで、この構造物が象限内の指定されたプラットフォーム領域に配置されていることを確認してください。

ラットの尾の付け根を掴み、プール壁沿いの所定のスタート地点に静かに置きます。動物をタンクに入れたら、すぐに視界から外れ、別の実験者にトラッキングソフトウェアの開始を合図します。ラットがプラットフォームを見つけて登るまで泳がせます。

その時点で、もう一人の研究者がコンピュータ上の試行を停止させます。動物をプラットフォームの上に30秒間留まらせてください。ラットが割り当てられた試行時間（ここでは90秒）以内にプラットフォームを見つけられなかった場合は、動物を構造物まで誘導し、そこに30秒間留まらせます。

その後、ラットの尾の付け根を持ち上げて迷路から取り出します。腕に掛けたタオルの上にラットを置きます。この手順を1匹あたりさらに3回繰り返し、試行間隔を20分として、各ラットが合計4回の試行を完了するようにします。

空間学習実験が完了したら、プールからプラットフォームを取り除き、プローブ試行を開始します。ソフトウェアで、南西象限にあった前回のプラットフォーム位置が定義されたままになっていることを確認してください。その後、ラットをプールに入れます。

それを水槽の壁に沿って水の中に入れます。前と同様に、すぐに動物の視界から離れ、別の実験者にトラッキングソフトウェアを開始するように指示します。30秒間のプローブ試行の終了後、動物の尾の付け根を掴んで水槽から取り出し、タオルを敷いたアームの上に置きます。

1週間後にこの手順を繰り返します。すべての動物で空間学習とプローブ試行が完了したら、テキストプロトコルに記載されている方法でデータを分析してください。シリンダー装置による四肢の使用データは、脳卒中誘発の3日前、および誘発後7日目と20日目にAPP21トランスジェニックラットから収集しました。

4肢を均等に使用した状態で表される値（ここにある赤線）に標準化して比較すると、これらの結果は、併存疾患を持つラットに統計的な4肢機能低下が認められないことを示しています。同様の結果が、脳卒中の有無にかかわらず野生型動物、およびAPP21遺伝子組換えラット単独でも得られました。しかし、併存疾患を持つ動物では、移動に関連する運動機能に差異が見られました。

脳卒中誘発の7日前と21日後にこれらのラットから収集したビームタスクのデータから、他の群では見られなかった、プラットフォームを横断するために必要な歩数の有意な増加が明らかになりました。また、モーリス水迷路の結果からも、併存疾患を持つ動物に記憶欠損があることが示されています。このグラフは、第1回目と第2回目のプローブ試行の間で、かつてプラットフォームがあったプールの象限に到達するまでの時間であるレイテンシの変動率を示しています。ここでは、脳卒中を伴うAPP21ラットが、第2回目の試行でターゲット象限に入るまでにかかる時間が有意に長くなっています。

この差異は、トランスジェニックラットのみ、あるいは脳卒中を誘発した野生型動物では認められませんでした。このことは、併存疾患を持つ動物に長期記憶障害があることを示しています。この手順を行う際は、すべての変数をテストセッション中およびセッション間で可能な限り一定に保ち、動物にとってストレスのない環境を整えることが重要です。

このビデオを視聴することで、脳卒中後認知症のラットモデルにおける運動能および認知機能の評価方法について十分に理解することができます。