神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。

次の実験の全体的な目標は、神経発達障害のモデルとして、Grailed 2 ノックアウト マウスの空間学習後の海馬の irk リン酸化の変化を検出することです。これは、まず、野生型と聖杯杯の両方で、モリス水迷路で2匹のノックアウトマウスをテストすることで達成されます。第2のステップとして、マウスの脳を取り出し、野生型マウスとノックアウトマウスのスライスをバイオム切断によって調製します。

次に、野生型マウスとノックアウトマウスの脳スライスを免疫組織化学のために処理し、海馬のリン酸化変化を検出するために使用されます。結果は、免疫組織化学的染色の光学顕微鏡による視覚化に基づいて、野生型と聖杯2ノックアウトマウスとの間の海馬RCリン酸化の違いを示しています。この方法により、モーリス水迷路などの海馬に依存する特別な学習タスクの後に活性化される海馬ニューロンの特定のサブセットを特定できます。

この手法のアイデアは、自閉症スペクトラム障害のマウスモデルであるグレード2ノックアウトマウスの分子欠損を強調する分子カスケードを調査することを決定したときに、最初に追加します。モリスウォーターメイのような空間学習タスクに関心のあるさまざまなバックグラウンドからマウスを訓練することを開始します。トレーニング期間の終了時に添付のテキストプロトコルに記載されているトレーニングレジメンに従い、マウスを安楽死させ、脳を固定して除去します。

手順を続行する準備ができたら、メスを使用して小脳を取り出します。次に、ビブラートのホルダープレートに脳の残りの部分を直立させて瞬間接着剤で接着します。脳を背側海馬全体で20〜40ミクロンの厚さの連続セクションに切断します。

0.1モルPBSの1ミリリットルで満たされた24ウェルプレートの1つのウェルに各スライスを移し、各マウスの3〜5つの背側海馬切片を、それぞれに0.1モルPBSの500マイクロリットルを含む24マルチウェルプレートのウェルに移します。各ウェルに含まれる切片を500マイクロリットルの0.1モルPBSでよく洗浄し、特に明記されていない限り、室温ですべての洗浄とインキュベーションを穏やかに攪拌して行います。ヒュームフードの下で、切片を40%メタノール、1%過酸化水素で0.1モルPBS中で20分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を消光します。

0.1モルPBSでさらに3回洗浄した後、切片をインキュベートしながら、切片を500マイクロリットルの0.2%Triton X 100で5分間インキュベートすることにより、実験全体に十分なブロッキングバッファーを準備します。次に、透過性溶液を取り出し、それぞれに100マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加します。切片を1時間よくインキュベートします。

次に、ブロッキングバッファーを取り外し、切片をリン酸化細胞外制御キナーゼで覆います。一次抗体をブロッキングバッファーで1〜500に希釈しました。切片を0.1モルPBSで5分間3回洗浄した後、翌日に穏やかに攪拌しながら、摂氏4度で一晩インキュベートします。

各切片は、ビオチン標識二次抗体をブロッキングバッファーで1〜250に希釈し、インキュベーション中に室温で1時間インキュベートします。Adenとビオチンの複合体が形成されるのに十分な時間を確保するために、使用の少なくとも30分前にA BC試薬を調製してください。切片を0.1モルPBSでさらに3回洗浄した後、A、b、C試薬を加え、サンプルと45分間インキュベートします。

PBSでの次の3回の洗浄セットでは、メーカーの仕様に従ってヒュームフードにDAB作業溶液を準備し、プレートにDAB作業溶液を分注します。次に、切片をDAB作業溶液を含むウェルに移し、プレートをゆっくりと渦巻かせて、切片が溶液に最大限にさらされるようにします。適切なシグナルが発生するまで、顕微鏡でDAB反応をモニタリングします。

約2〜5分で、0.1モルPBSで組織を洗浄することにより、目的の色の強度で反応を停止します。PBSでさらに3回洗浄した後、ゼラチンコーティングされたスライドに切片を取り付け、室温で少なくとも3〜4時間乾燥させます。空気乾燥されたトランスファースライドをヒュームフード内でスライドさせ、それらを統合エタノール溶液をそれぞれ2分間順番に置いてセクションを脱水し、次にスライドを100%キシレンで5分間クリアします。

蓋をして、封入剤を使用してスライドを滑り込ませ、ヒュームフードに一晩置いて乾燥させ、スライドをカメラと20倍対物レンズを備えた明視野顕微鏡に乾転写します。背側海馬の画像をカバーする200倍の倍率で、各セクションから複数の明視野画像を取得します。各動物から3〜5つのセクション。

ここに示されているのは、野生型マウスとGrailed 2ノックアウトマウスの背側カバカンピ領域の切片で、リン酸化のために染色されています。細胞外は、学習依存性ニューロンの活性化の信頼性の高い分子読み出しを調節しました。これらのマウスは両方とも、犠牲になる前に古典的な海馬依存の空間学習課題レジメンであるモリス水迷路を受けていました。

試験の最終日、Grailedの2匹のノックアウトマウスは、野生型マウスと比較して、有意な空間学習障害を示しました。マウスの脳切片を分析するために、海馬のさまざまな領域全体で陽性細胞の総数をカウントしました。CA 3パラメータ層では、野生型マウスは、ノックアウトマウスよりも面積当たりのリン酸化RK陽性細胞が有意に多かった。

逆の結果は、hili and granule cell layer or GCL で見られました。このビデオを見れば、認知障害を特徴とする神経発達障害の遺伝的および薬理学的マウスモデルの海馬からの脳スライス上のphos製剤を調査する方法について十分に理解できるはずです。この手法は、他の脳領域でのirk力の定式化の変化を研究するためだけでなく、モーリスウォーター迷路とは異なる認知行動課題を追跡するためにも使用できます。

DIAベンジンでの作業は非常に脱走兵になる可能性があり、この手順を実行する際には、適切な保護具を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。